Name: אין ויוו Microdialysis שיטת איסוף גדול חלבונים חוץ-תאית נוזל בין-תאי המוח עם משקל מולקולרי גבוה ניתוק רגשים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: למד שיטת מיקרודיאליזה in vivo לאיסוף מולקולות גדולות מנוזל בין-תאי מוח בעכברים ערים ונעים באופן חופשי. השיטה מאפשרת ניטור בזמן אמת של תהליכי סיגנל ופינוי פסולת נוירונליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ' מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (חלבון להזדקנות המוח, דמנציה Control)(15H01552) MEXT, מענק הסיוע עבור צעירים מדענים (B) (16K 20969). המחבר תודה ד ר דוד מ הולצמן, ד ר ג'ון ר' Cirrito על עצות טכניות במהלך הפיתוח של שיטה זו.

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל היו נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בוגר בית הספר לרפואה של אוניברסיטת טוקיו.
1. מראש הליך כירורגי
<ol><li>לפני תחילת הניתוח, למחוק את הכל עם 70% אתנול כדי לשמור על תנאים סטריליים. תמיכה תרמי באמצעות כרית החימום מומלץ.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכברים בזריקה בקרום הבטן של קלוראל-הידרייט (400 מ"ג/ק"ג). לאשר ההרדמה על-ידי ביצוע קמצוץ הבוהן. מומלץ להשתמש meloxicam SR אינדוקציה, הבופרנורפין עם החלמתם ההצעה לפחות 24 שעות.</li>
	<li>לגלח את השיער עם בטלוויזיה כירורגי. לתקן את עכבר עכבר, חולדה neonatal מתאם באמצעות מלחציים האף וברים של האוזן. הערה: חיוני כדי לוודא את הראש העכבר מאובטחת בשלב זה, לא זזה side-by-side.</li>
	<li>הוטרינר משחה למרוח את העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה.</li>
</ol>2. stereotaxic לניתוח ההשתלה בצינורית מדריך
<ol><li>הגדר את העכבר ואת מתאם עכברוש neonatal על המנגנון stereotaxic. לעשות חתך sagittally על העור על פני הגולגולת באמצעות אזמל.　נגב את הדם ואת רקמת חיבור על הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן לח.</li>
	<li>לקבוע את הקואורדינטה עבור אזור המוח עניין באמצעות המוח אטלס. לפני תחילת המדידות, ודא את קו האמצע הוא ישר המקדחה שניתן יהיה להעביר A-P של להישאר על התפר קו האמצע כל הזמן. הערה: מאמר זה משתמש הקואורדינטה (A / p: -3.1 מ. מ., M/l:-2.5 מ מ, יח/v:-1.2 מ מ, 12 מעלות) כדי להתמקד ההיפוקמפוס האחורי.</li>
	<li>הגולגולת רמה A-P<ol>
<li>צרף תרגיל על תחמן של מסגרת stereotaxic. הנמך את התרגיל עד בעדינות שייגע למדא והקלטה של קואורדינטות הגחון שלו. חזור על הליך זה עבור bregma. הערה: כאשר הגולגולת היא החלקה, המידה האנכית של bregma שווה לזה של למדא. אם לא, שנה את הגובה של האף קלאמפ בהתאם. אחרי הגולגולת מקבל החלקה, לתעד את הקואורדינטה הקדמי/אחוריים, לרוחב של bregma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רמת הגולגולת משמאל לימין<ol>
<li>להעביר את התרגיל bregma הקואורדינטה (A / p: -3.1 מ. מ., M/l: +2.0 מ מ), להוריד את התרגיל בגולגולת ולהקליט את האנכית. לאחר מכן חזור על הליך זה עבור הקואורדינטה (A / p: -3.1 מ. מ., M/l:-2.0 מ מ). הערה: אם הגולגולת הוא ומחבל אנכי של שתי נקודות קו מקביל מן האמצע שהמדידות שווה. אם לא, שנה את הגובה של פסי האוזן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקדוח חור burr בקפידה-הקואורדינטה היעד (A / p: -3.1 מ. מ., M/l:-2.5 מ מ) כדי להשתיל בצינורית מדריך. אם הקוטר של חור burr אינו גדול מספיק עבור ההשתלה בצינורית מדריך, נקדח חור נוסף החופפים עם החלק הראשון. נקדח חור נוסף על עצם הקודקוד הימני (בצד contralateral) ולהוסיף בורג העצם, אשר מסייע לאבטח שיניים מלט ב 1.10 (ראה איור 1B).</li>
	<li>לחתוך חתיכה נעילה סיבובית מן הצד האחורי של מכסה של שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL על ידי סכין גילוח ולעשות 'כתר '. הכתר הזה משמש כדי למנוע מלט שיניים מריחה על העור. למקם אותו על הגולגולת כך נקבים שנעשו בשלב 2.5 להישאר בתוך המעגל (ראה איור 1).</li>
	<li>כוונן אסיפה stereotaxic על ידי הצבת בצינורית מדריך על זרוע קצרה יותר של מתאם stereotaxic ' להדק אותו באמצעות אגוז cap. הגדר את הזרוע יותר של מתאם stereotaxic המלחציים אלקטרודה. לצרף אותו על manipulator של המנגנון stereotaxic (ראה איור 1 א').</li>
	<li>לסובב את מכלול stereotax D-V על הזרוע מניפולטור ב- 12 מעלות (ראה איור 1B). להעביר את הצינורית מדריך החור burr ב 1.6. הכנס את הצינורית מדריך לאט לתוך המוח על ידי הורדתו מאת 1.2 מ מ. הערה: הזווית של המכשיר הוא ספציפי בהיפוקמפוס; אזורים אחרים עשויים לדרוש בכלל זוויות אחרות או אין זווית. התייעץ עם אטלס של המוח עבור קואורדינטות מדויקות. לייבש את פני השטח של הגולגולת, כי אם לא הבטון לא ידבק מלט כובע יכול להפוך יצאה ממקומה</li>
	<li>הוסף את הבטון שיניים בתוך הכתר כדי כיסוי מלא בשני מתכת חלק את הצינורית מדריך, הבורג עצם מספיק כדי להבטיח להם. החל מלט שיניים נוספים אם יש חלק של הגולגולת חשוף.</li>
	<li>המתן עד מלט שיניים. זה יבש לחלוטין (~ 12-20 דקות). הסר את מתאם stereotaxic המלחציים אלקטרודה. להסיר את האגוז קאפ, להחליף את מתאם stereotaxic בדיקה דמה והדקו האגוז cap.</li>
	<li>שחרר את לחצן העכבר של המנגנון stereotaxic, בית העכבר לבד לכלוב נפרד. הערה: העכבר אסור להשאיר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. בדוק את העכבר מדי יום עד היום של microdialysis. העכבר מקבל NSAIDs כגון carprofen אם נראה שזה כואב. מחכה שבועיים הכרחי ללימודי שינה העכבר habituates הסביבה החדשה10, אך סוגים אחרים של מחקרים עשוי לדרוש תקופות התאוששות קצר יותר (למשל, 1-2 ימים).</li>
</ol>3. Microdialysis ההתקנה
<ol><li>בדיקת איכות של הגששים: מילוי מזרק חד פעמיות 1 מ"ל עם מים מזוקקים לחבר אותו לשקע (יציאה קצרות יותר) של בדיקה באמצעות צינור byton. מכסה את חורי אוורור עם האצבעות, את הבוכנה מזרק בעדינות כדי לצקת מים על החללית. בדוק את המים מופיע מן הים בדיקה ויש אין נזילה על-פני קרום microdialysis.<ol>
<li>הפעלה של הגששים: להטביע את הממברנות של החללית אתנול (70-100%) לשתי שניות. לאחר מכן, להשרות מים מזוקקים לתוך המכשיר שוב עם מזרק שוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת מאגר זלוף: כדי למנוע הידבקות של מולקולות יעד דקים, להוסיף BSA על ידי דילול פתרון BSA 30% 4% עם נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (1.3 מ'מ CaCl2, 1.2 מ מ MgSO4, 3 מ מ אשלגן כלורי, 0.4 מ מ ח'2PO4, 25 מ מ NaHCO3 , 122 מ מ NaCl, pH = 7.35), אשר תתאם אלקטרוליט ריכוז ב- CSF, מיד לפני השימוש. לסנן את המאגר זלוף דרך יחידת מסנן מזרק עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.1. הערה: 4% BSA משפרת את שחזור שנשארת חלבונים אך קשות יכול להגביל את המסירה של תרכובות, במיוחד עבור תרכובות בעלות BSA-מחייבת גבוהה. זהו אחד היתרונות של שימוש ריכוז נמוך יותר של BSA (כגון 0.15%) מסוימים מופעים3. שימו לב: BSA יכול לצבור בקלות רבה כאשר נסער על ידי מערבולת או מערבבים בצלחת. אגרגטים אלה יכולים להיסתם הגששים או קרום נקבוביות. נקוט זהירות בעת הכנת פתרון BSA כדי להגביל את מצבור</li>
	<li>להכין שני קווים נפרדים עבור כניסת ו אאוטלט (ראה באיור 1C) וחבר שני הקווים עם מחט חיבור. ממלאים מזרק חד פעמיות mL 3 מלא זלוף מאגר וחבר אותו עם סיום כניסת הצנרת באמצעות מחט בלנט-end. למלא את הצנרור כולו עם מאגר זלוף על-ידי הפעלת המשאבה מזרק.</li>
	<li>לעצור את משאבת מזרק והחלף את המחט חיבור בין כניסת קו וקו עודפים בדיקה microdialysis מופעל משלב 3.3 (ראה איור 1C). לפני החלפת הזה, לשים כובע אגוז על החללית.</li>
	<li>לטעון את צינור רולר לאורך צינור עודפים על המשאבה רולר. התחל את משאבת מזרק ב- µL 10/דקה ואז המשאבה רולר בקצב הזרימה מעט איטי יותר (9.5-9.8 µL/דקה). הקפד להסיר את כל הבועות אוויר בתוך הצנרת כולה, העלולים להשפיע על ההתאוששות כאשר הם מזינים את המכשיר.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכבר משלב 1.12 באותו אופן כמו שלב 1.2. שים את הקולר העכבר מסביב לצוואר. להסיר את הכובע אגוז לווין דמה, לאט להוסיף בדיקה microdialysis 3.4 דרך הצינורית מדריך והדקו האגוז cap.</li>
	<li>המקום עכבר בכלוב מחובר חינם-המעבר מערכת בעלת הקשר העכבר עם הצווארון. להמשיך לרוץ גם משאבת מזרק וגם משאבת רולר קצב זרימה שצוין בשלב 3.5 לפחות שעה. הערה: כדי להשיג אוסף הקרן מבעלי ער, מאמר זה משתמש מערכת חינם-המעבר, איפה הכלוב עצמו מגיב לתנועת של חיה כדי למנוע tubings פיתול. לחלופין, הזמינות מחברות שונות נוזלי סביבול יכול גם לשמש.</li>
	<li>עצור רולר לשאוב תחילה ולאחר מכן את משאבת מזרק. הגדר את קצב הזרימה הרצויה. הפעל המזרק משאבת 20% מהר יותר מאשר המשאבה רולר. הערה: למשל, אם אתה מפעיל ב- µL 1/דקה, להפעיל את משאבת מזרק 1.2 קצב הזרימה אופטימלית µL לדקה צריך להיות נחוש מדעית עבור כל מולקולה.</li>
	<li>איסוף דגימות הקרן: מקום חופשי סוף שקע אבובים על האספן שבר בקירור. הערה: נפח דגימה המתאים משתנה בהתאם מבחני המשמש לניתוח.</li>
	<li>לאחר סיום הניסוי, להסיר את המכשיר. (עזים ומתנגד העכבר לפי הצורך.)  להתמודד עם העכבר שחזור באותו האופן כמו שלב 2.11. לנתח את הקרן שנאספו על ידי שיטות כגון hplc, קורס או אליסה.</li>
	<li>כדי לשטוף את הצנרת כולה לאחר microdialysis, התחבר כניסת, tubings שקע שוב על-ידי החלפת המכשיר עם החיבור מחט לרוץ אקונומיקה מדוללת את הצנרת כולה ואת ואז לשטוף את זה עם מים. יבש ואחסן אותו לשימוש חוזר. הערה: סוגים אחרים של tubings מקובלים, אולם, BSA במאגר זלוף יכולים להיסתם דקים בקוטר קטן, ובכך tubings אלה נחשבים לשימוש יחיד. Tubings יכול להיות משוחק או סתומות לאחר מספר שימושים, אז ודא כי קצב הזרימה עקבי בכל פעם לפני השימוש.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

המחבר אין לחשוף.

Microdialysis עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך ממברנות להפעלה על-ידי מצב מו-דו, וכך זה קריטי כי קצב הזרימה הוא מדויק וקבוע. אי-הדיוק את שיעורי זרימת יכול להיות הגורם של דור בועות אוויר, חוסר עקביות הריכוז לדוגמה. אם הזרם הוא לא עקבי, בדוק את כל חיבורי עבור דליפה. אם הבעיה עדיין נמשכת, ייתכן צורך להתחיל מחדש עם המחקרים החדשים וכל tubings.
הגששים Microdilaysis הם perfused באופן רציף על-ידי המאגר זלוף. לכן, אין מספיק זמן עבור מולקולות חוץ-תאית להגיע שיווי משקל מלא במאגר זלוף. כתוצאה מכך, ריכוז dialysa...

הקרן כוללת 15-20% נפח המוח הכולל, מציע microenvironment קריטי עבור אותות, ולהזמנת המצע פסולת סיווג1. לכן, היכולת של איסוף הקרן מבעלי חיים יספקו יותר השלכות על תהליכים ביולוגיים שונים, כמו גם מנגנון המחלה. Microdialysis in vivo הוא אחד מהשיטות הדגימה לכמת חוץ-תאי המולקולות של הקרן מ ער, בחופשיות חיות ו ובכך משמשת כלי שימושי2,בשדה מחקר מדעי המוח3. בשיטה זו, microdialysis הגששים עם ממברנות semipermeable מוכנס במוח, perfused עם מאגר זלוף קצב זרימה איטית יחסית (0.1-5 µL/min). במהלך זה זלוף, חוץ-תאי המולקולות של הקרן פסיבי לפזר לתוך המכשיר על פי מעבר הצבע ריכוז ולאסוף כמו dialysate. למרות מאמר זה מתמקד בשיטת מדגם הקרן במוח, העיקרון והן השיטה ניתן להחיל לאיברים אחרים על-ידי שינוי המתאים במידת הצורך.
Microdialysis הועסק לראשונה בשנות ה-60 המוקדמות, ומאז ואז היא בשימוש נרחב כדי לאסוף את מולקולות קטנות כולל חומצות אמינו או עצביים במוח. עם זאת, לאחרונה הזמינות המסחרית של הגששים microdialysis עם משקל גבוה-מולקולרי לחתוך ממברנות (kDa-3 100 מד א) האריך היישום שלה יחסית גדול יותר חלבונים ב- ISF כמו גם4,5,6 ,7. המחקרים באמצעות רגשים אלו הוביל הממצא הזה חלבונים כגון טאו או α-synuclein זה זמן נחשבו בלעדי cytoplasmic נוכחות גם הן מבחינה פיזיולוגית ב- ISF-4,-5,-8.
אחד הקשיים בעזרת microdialysis הגששים גדול לחתוך ממברנות (בדרך כלל מעל 1,000 kDa) היא כי הם רגישים יותר אולטראפילטרציה אובדן נוזלים עקב הלחץ הפנימי שמצטבר את הגששים. הגששים Microdialysis המשמש כאן יש מבנה ייחודי כדי להימנע מבעיה זו. הלחץ לא יבנה בשל מבנה זה, ובכך microdialysis עם הגששים אלה צריך להיות מופעל במצב "push-pull" באמצעות מזרק משאבה כדי perfuse את הגששים (= דחיפה), משאבה סחרור/רולר כדי לאסוף את מגיע dialysate מהשפך בדיקה (= משיכה) 9 (למרות שצריך לדחוף ולמשוך משאבות, בעקבות לחץ ביטול חורים פתח ב הגששים, המערכת טכנית רק מונעת על ידי משיכה המשאבה). מאמר זה מתחיל עם הניתוח stereotaxic של השרשה בצינורית מדריך, מאמר זה מתאר כיצד להגדיר קווים microdialysis כדי לאסוף הקרן באמצעות microdialysis הגששים עם 1,000 kDa ניתוק ממברנות.

<table><tbody><tr><td>Univentor 820 Microsampler</td><td>Univentor</td><td>8303002</td> משאבת <td>מזרק אספן שברים מקורר</td></tr><tr><td>KD</td> מדעי <td>KDS-101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת רולר</td><td>Eicom מיקרודיאליזה</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Raturn מערכת עצמאית</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>מערכת נע חופשי</td></tr><tr><td>ערכת כלוב מינים כפולים</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת מיקרודיאליזה AtmosLM (אורך פיר 8 מ"מ, אורך ממברנה 2 מ"מ)</td><td>Eicom microdialysis</td><td>PEP-8-02</td><td>אורך פיר לבדיקה, מדריך, בדיקה דומי ומתאם סטריאוטקסי צריכים להיות זהים.</td></tr><tr><td>מדריך מיקרודיאליזה (אורך פיר 8 מ"מ)</td><td>Eicom מיקרודיאליזה</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת דמה מיקרודיאליזה (אורך פיר 8 מ"מ)</td><td>Eicom מיקרודיאליזה</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>בורג עצם</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>סופר בונד C& B סט</td><td>מלט שיניים</td><td>Sunmedical</td><td></td></tr> מכשיר <tr><td>סטריאוטקסי לבעלי חיים קטנים עם קונסולת תצוגה דיגיטלית</td><td>Kopf</td><td>דגם 940</td><td>מכשיר סטריאוטקסי</td></tr><tr><td>מתאם עכבר וחולדה יילודים</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>מוטות אוזניים סטנדרטיים וטיפים גומי לעכבר Stereotaxic</td><td>Stoelting</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין מסרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7284-50ML</td><td>30% תמיסת BSA</td></tr><tr><td>צינורות FEP (70 ס"מ)</td> <td>מיקרודיאליזה של Eicom</td><td>JF-10-70</td><td>נפח פנימי = 0.5 ומיקרו; </td></tr><tr><td>צינורות טפלון L/cm (50 ס"מ)</td> <td>מיקרודיאליזה של Eicom</td><td>JT-10-50</td><td>נפח פנימי = 0.08 ומיקרו; צינור L/cm</td></tr><tr><td>Byton</td><td>מיקרודיאליזה Eicom</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>מתאם דקירה לואר אינטרמדיק 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>מחט קצה קהה</td></tr><tr><td>צינור רולר</td><td>מיקרודיאליזה Eicom</td><td>RT-5S</td><td>נפח פנימי = 4 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>אגוז כובע</td><td>Eicom מיקרודיאליזה</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0.25 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה עם מכסה</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>צינורות לאספן שברים</td></tr><tr><td>מתאם סטרוטקסי (אורך פיר 8 מ"מ)</td> <td>מיקרודיאליזה</td><td>Eicom PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>מחט חיבור</td><td>Eicom מיקרודיאליזה</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>עכבר צווארון בעלי חיים</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיקרו-מנוע סיבובי במהירות גבוהה</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>מקדחה</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>מברג לברגי</td><td></td><td></td><td></td>עצם</tr><tr><td>אזמל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צמר</td><td></td><td></td><td></td>גפן</tr><tr><td>קוצץ</td><td></td><td></td><td></td> כירורגי</tr></tbody></table>

אין ויוו microdialysis שיטת איסוף גדול חלבונים חוץ-תאית נוזל בין-תאי המוח עם משקל מולקולרי גבוה ניתוק רגשים

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In vivo microdialysis היא טכניקה חזקה כדי לאסוף את הקרן מבעלי ער, מתנהג באופן חופשי המבוסס על עיקרון דיאליזה. בעוד microdialysis היא שיטה ותיקה המודד מולקולות קטנות יחסית, כולל חומצות אמינו או נוירוטרנסמיטורים, לאחרונה שהשתמשו בה להעריך גם את הדינמיקה של מולקולות גדולות יותר של הקרן באמצעות רגשים עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך ממברנות. בעת שימוש כזה הגששים, microdialysis יש לפעול במצב שכיבות למשוך כדי למנוע לחץ שהצטברו בתוך הגששים. מאמר זה מספק צעד אחר צעד פרוטוקולים כולל ניתוח stereotaxic וכיצד להגדיר קווים microdialysis לאסוף חלבונים מן הקרן. במהלך microdialysis, סמים יכול להינתן או מערכתית או על ידי אינפוזיה ישירה לתוך הקרן. Microdialysis הפוכה היא טכניקה להחדיר ישירות תרכובות לתוך הקרן. הכללת תרופות במאגר זלוף microdialysis מאפשר להם מפוזרת לתוך הקרן באמצעות הגששים תוך איסוף בו זמנית הקרן. על ידי מדידת חלבון טאו כדוגמה, המחבר מציג כמה רמות שלה השתנו בעת פעילות. עצבית מגרה על-ידי microdialysis ההפוך של picrotoxin. היתרונות והמגבלות של microdialysis מתוארים יחד עם הבקשה המורחבת על ידי שילוב של שיטות אחרות ויוו .

כדי לעורר או לעכב פעילות. עצבית הפוכה microdialysis11,12,13, picrotoxin, אנטגוניסט GABAA או טטרודוטוקסין, שימשו חוסם ערוץ Na+ . הוכח, כי שחרור טאו הוא מגורה על ידי הגדלת פעילות. עצבית13,14. בקנה אחד עם אלו תצפיות הקודם, כאשר 50 מיקרומטר picrotoxin (PTX) היה מנוהל באמצעות microdialysis הפוכה (ראה דיון לפרטים נוספים) ב...

Microdialysis in vivo אפשרה אוסף של מולקולות נוכח נוזל בין-תאי המוח (הקרן) מבעלי ער, להתנהג בחופשיות. על מנת לנתח מולקולות גדולות יחסית של הקרן הלאומית למדע, המאמר הנוכחי מתמקד במיוחד בפרוטוקול microdialysis באמצעות רגשים עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך את הממברנות.

אין ויוו Microdialysis שיטת איסוף גדול חלבונים חוץ-תאית נוזל בין-תאי המוח עם משקל מולקולרי גבוה ניתוק רגשים

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר במדעי המוח על איך אות טרנסדוקציה מצע תחבורה פינוי פסולת להתרחש בחללים חוץ תאיים במוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת דגימה וכימות של מולקולות חוץ-תאיות גדולות בנוזל הבין-תאי או ב- ISF של בעלי חיים ערים הנעים בחופשיות. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן, הסר את השיער מהגולגולת של עכבר הרדמה ולהשתמש בפסי האוזן ומהדק האף כדי לתקן את החיה בבטחה על מתאם.יש למרוח משחה על עיני החיה ולהחיל את המתאם על המנגנון הסטריאוטקסי. השתמש אזמל כדי להפוך חתך בעור sagittally על הגולגולת ולצרף מקדחה על המניפולטור של מסגרת סטריאוטוקסית. מנמיך את התרגיל עד שהוא נוגע בעדינות lambda ולאפס את קואורדינטת DV של התרגיל לאפס.לאחר מכן, הזיזו את התרגיל ל-bregma לאיפוס קואורדינטות AP ו- ML לאפס. העבר את התרגיל מברגמה לתיאום האנכי. מנמיך את המקדחה לגולגולת והגדר את קואורדינטת DV לאפס שוב.לאחר חזרה על ההליך עבור קואורדינטת שלישית, לקדוח חור בר בזהירות על קואורדינטת היעד, ואחריו חור שני בצד הנגדי של עצם קודקודית. הכנס בורג עצם לתוך החור השני והצב את פיסת הנעילה ממכסה צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר על הגולגולת, כך חורי בר נמצאים בתוך המעגל. לאחר מכן, מניחים cannula מדריך על הזרוע הקצרה יותר של מתאם סטריאוטוקסי להדק את cannula עם אגוז כובע.הגדר את הזרוע הארוכה יותר של המתאם הסטריאוטוקסי על מהדק האלקטרודה והצמד את הזרוע על המניפולטור של המנגנון הסטריאוטקסי. סובב את ההרכבה הסטריאוטוקסית DV על זרוע המניפולטור ב -12 מעלות והזז את המדריך cannula לחור בר. לאחר מכן, לאט להוריד את המדריך cannula 1.2 מילימטרים לתוך המוח.מוסיפים מלט דנטלי לכתר עד שחלק המתכת של צינורית המדריך, בורג העצם וכל גולגולת חשופה מכוסים ומאובטחים ומאפשרים למלט להתייבש. לאחר 12 עד 20 דקות, הסר את המתאם הסטריאוטוקסי ממהדק האלקטרודה, הסר את אגוז המכסה והחלף את המתאם הסטריאוטקסי בבדיקה דמה. לאחר מכן, refasten אגוז כובע, לשחרר את העכבר מן המנגנון הסטריאוטוקסי, והאוס העכבר לבד בכלוב בודד.לפני הגדרת microdialysis, למלא מזרק חד פעמי אחד מיליליטר עם מים מזוקקים ולהשתמש צינור ויטון כדי לחבר את המזרק לשקע של בדיקה microdialysis. מכסים ידנית את חורי האוורור ומדכאים בעדינות את בוכנה המזרק כדי להחדיר את הגשוש במים. ודא כי מים מופיעים במבונית החללית כי יש דליפה על פני השטח של קרום microdialysis.כדי להפעיל את החללית, להטביע את קרום החללית ב 70-100% אתנול במשך שתי שניות, ואחריו עירוי מים מזוקק שני. חבר מחט חיבור למפרצה אחת ולקו שקע אחד וטען מזרק חד פעמי של שלושה מיליליטר עם חיץ תדלוק טרי. חבר מזרק המצויד במחט קהה לקצה התוך של הצינורות ולהשתמש במשאבת מזרק כדי למלא את הצינור כולו עם חיץ תדלוק.כאשר הצינור מלא, החלף את מחט החיבור בין קווי התוך והשקע עם בדיקה microdialysis מופעל ואגוז כובע ולהעלות צינור רולר לתוך צינורות שקע על משאבת רולר. הפעל את משאבת המזרק ב 10 microliters לדקה ואת משאבת רולר ב 9.5-9.8 microliters לדקה. עכשיו מניחים את הצווארון סביב הצווארון של המדריך הרדמה cannula מושתל בעלי חיים ולהסיר את אגוז כובע בדיקה דמה.הכנס לאט את בדיקה microdialysis דרך cannula מדריך להדק את אגוז הכובע. לאחר מכן, מקם את העכבר בכלוב המחובר למערכת הנעה בחופשיות ו לקשור את העכבר עם הצווארון. לאחר שעה אחת לפחות, עצרו ברצף את משאבת הגלילה ומשאבת המזרק, הפעילו מחדש את המשאבות עם משאבת המזרק מוגדרת ל-20% מהר יותר ממשאבת הגלילה והכניסו את הקצה החופשי של צינורות השקע על אספן שברים בקירור כדי לאסוף את ספק השירות של המוח.כאשר אמצעי האחסון הניסיוני המתאים הושג, להסיר את החללית ולטפל בהתאוששות העכבר כפי שהוכח רק. בקנה אחד עם תצפיות קודמות, כאשר 50 מיקרומולרי Picrotoxin מנוהל באמצעות microdialysis הפוך כפי שהוכח בעכברים C57B6J ער, עלייה ברמות טאו אנדוגני interstitial נצפתה בהשוואה לרמות שנמדדו בבעלי חיים שטופלו בבקרת רכב. בנוסף למינהלי תרופות, מיקרודיאליזה יכולה להיות משולבת עם שיטות אחרות vivo כמו הקלטת EEG או אופטוגנטיקה כדי לענות על שאלות נוספות על איך פעילות עצבית משפיעה על ריכוז המצע ב- ISF.

in-vivo-microdialysis-method-to-collect-large-extracellular-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ניטור של רמות הנוירוטרנסמיטר תאי מוח באזורים שונים של בעלי חיים באופן חופשי לנוע מציע תובנות על הקשר בין שחרור הנוירוטרנסמיטר והתנהגות. בשנת vivo microdialysis יחד עם זיהוי אלקטרוכימי מספק אנטומי מעולה ברזולוציה כימיים ומידע איך עצבית הבסיס משתנה על ידי מניפולציות תרופתי או פיזיולוגי.

כירורגיה Stereotaxic לשרוד במכרסמים

אפנון של זכרון עבודה המרחבי hippocampally תלוי על ידי microinjection intrahippocampal הישיר, מלווה...

Microinjection האינסולין היפוקמפוס ו<em&gt; בחי</em&gt; Microdialysis במהלך בדיקת זיכרון המרחבי

הסרטון מדגים את תהליך השימוש בבדיקת מיקרודיאליזה לאיסוף חלבונים חוץ-תאיים מהנוזל הבין-תאי (ISF) של מוח עכבר. בדיקת מיקרודיאליזה, המצוידת בקרום חדיר למחצה חתוך במשקל מולקולרי גבוה, מוחדרת למוחו של עכבר מורדם באמצעות צינורית מנחה מושתלת. הגשושית, המחוברת למשאבות, מאפשרת לחצץ פיזיולוגי לחלחל את רקמת המוח ולהתערבב עם ה-ISF. חלבונים ב-ISF מתפזרים על פני הממברנה החדירה למחצה ונאספים לניתוח.

מיקרודיאליזה של נוזל אינטרסטיציאלי ממוח עכבר לבידוד חלבונים חוץ-תאיים

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Microdialysis היא טכניקה נפוץ במחקר מדעי מוח. לכן בדיקות מסחריות נמצאות בdemand.In הגדול עבודה זו הרכבה בדיקה הוא הסבירה בפירוט לבנות חללית אמינה, קונצנטריים, מחוייט microdialysis פחות מ 10 $.

Microdialysis Probe עיצוב מותאם אישית

. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.

שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels

כאן, אנו מתארים שיטה ויוו microdialysis לניתוח שחרור אספרטט ולא גלוטמט בהיפוקמפוס הגחון של חולדות אפילפסיה ואפילפטי, בשילוב עם הקלטות EEG. חוץ-תאית ריכוזי אספרטט גלוטמט יכול להיות בקורלציה עם השלבים השונים של המחלה.

Microdialysis של חומצות אמינו מעוררות במהלך ההקלטות EEG בחופשיות העברת חולדות

הפרוטוקול כאן מספק דגימה דינמית מפורטת בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי מההיפוקמפוס של חולדות ערות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה.

איסוף דינמי בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס מחולדות מודעות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה

בחיים החיים, תקשורת בין-תאית התומכת במחלות רבות במערכת העצבים המרכזית, כגון גליובלסטומה (GBM), ידועה כקשה מאוד למדידה ולאפיון. כאן, אנו מתארים פרוצדורות של מיקרופרפוזיה מוחית בזרימה פתוחה (cOFM) שניתן להשתמש בהם לדגימת רכיבי נוזל אינטרסטיציאלי במודל חייתי אורך של GBM.

שימוש במיקרופרפוזיה בזרימה פתוחה במוח לאיסוף אורך של נוזל בין-תאי במודל חייתי של גליובלסטומה

הקלטות תאיים של הפעילות העצבית באמצעות בדיקות סיליקון החולדה הרדים יתוארו. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע על אזורי מוח מרובים יותר מ 100 נוירונים בו זמנית. הוא מספק מידע עם רזולוציה של תא בודד על הדינמיקה בתוך מעגלים עצביים הרכבים מקומיים רבים.

הקלטה בקנה מידה גדול הרכבים העצבית עם בדיקות הסיליקון ב עכברוש הרדים

למד שיטת מיקרודיאליזה in vivo לאיסוף מולקולות גדולות מנוזל בין-תאי מוח בעכברים ערים ונעים באופן חופשי. השיטה מאפשרת ניטור בזמן אמת של תהליכי סיגנל ופינוי פסולת נוירונליים.

אין ויוו Microdialysis שיטת איסוף גדול חלבונים חוץ-תאית נוזל בין-תאי המוח עם משקל מולקולרי גבוה ניתוק רגשים

גלה סרטונים נוספים