לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים
14 ביוני 2018
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה לחיות הפצע ותיקון ההיענות דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ויוו. שיטה זו משתמשת השלב הגולמי של פיתוח דרוזופילה כדי לאפשר לטווח ארוך הדמיה ומעקב של אוכלוסיות תאים מסוים לאורך זמן והוא תואם עם איון יעיל מציאה RNAi בתיווך גנים.
על ידי ניצול פוטנציאל ההדמיה ארוך הטווח של מודל הגולם החדש הזה, יחד עם יכולת המעקב הגנטית של דרוזופילה, שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחומי ריפוי הפצעים והחיסון המולד. שלב הגולם מציע כמה יתרונות מובהקים להדמיה חיה על פני מודלים מסורתיים יותר של ריפוי פצעי דרוזופילה. לדוגמה, ניתן לדמות גלמים על פני תקופות זמן ארוכות בהרבה, שטח רקמה גדול יותר זמין למניפולציה ניסיונית, ויותר המוציטים נמצאים בשלב זה.
בנוסף, היעילות של השבתת גנים בתיווך RNAi משתפרת במידה ניכרת במהלך שלבי הגולם הללו, מה שמאפשר להפיל גנים רבים באופן ספציפי לרקמה או לזמן. כדי להקים את אוסף הגלמים, הקימו בקבוקונים עם 20 נקבות בתולות ו-20 זכרים. לאחר מכן, 18 שעות לפני סשן ההדמיה, אספו לפחות 10 גלמים לבנים שזה עתה נוצרו מהבקבוקונים.
כדי לאסוף גולם השתמש במלקחיים או במברשת צבע עדינה כדי לעקור אותו ממשטח הבקבוקון הפנימי ולהעביר אותו בזהירות לצד בקבוקון זבוב חדש. לאחר שהגלמים התפתחו לנקודת הזמן הרצויה, העבירו אותם לפיסת סרט דביק דו צדדי המותקנת על מגלשת זכוכית. כעת, תחת מיקרוסקופ דיסקציה שדה בהיר, הסר בזהירות את הגלמים ממעטפתם.
מקם את הגלמים כך שצידי הגחון שלהם יהיו דבוקים היטב לסרט. בצע את החתך הראשון באזור הקדמי ביותר של הגולם באמצעות המלקחיים. ודא שמארז הגולם באזור זה חלול ונטול רקמת גולם מכיוון שהגלמים יתכווצו בתוך המארז במהלך התפתחות הגולם המוקדמת.
לאחר מכן, קרעו או חתכו בזהירות את נרתיק הגולם בכיוון הקדמי והאחורי באמצעות מלקחיים או מספריים עד שהגולם חופשי לחלוטין מהמעטפת החומה והאטומה והשבירה. היזהר גלמים אלה שבירים מאוד. כעת חיוני שהמלקחיים והמספריים לא ינקבו את משטח הגולם במהלך שלב זה.
נסו להימנע מלגעת בגולם עצמו כשאתם מסירים את המארז שמסביב. כעת הרכיבו את הגלמים הלא פגומים בכלי תחתית זכוכית בעזרת דבק הפטן. ראשית הפקידו שורה של דבק הפטן מוכן ממנה של 10 מיקרוליטר.
לאחר מכן, לאחר חמש שניות של ייבוש, השתמשו במלקחיים כדי להעביר בזהירות את הגלמים המנותחים על הדבק. בעת הלמידה, סדרו עד חמישה גלמים. ניתן להכין יותר עם ניסיון שנצבר.
גלגלו את הגלמים באמצעות מלקחיים כדי להרכיב את הגלמים כך שהכנף תהיה שטוחה על זכוכית הכיסוי כאשר רוב משטח הכנף נמצא במגע ישיר עם זכוכית הכיסוי. לבסוף, כדי למנוע התייבשות, הוסף פיסת נייר סינון סופג ספוג במים מזוקקים לצד צלחת תחתית הזכוכית. לאחר מכן מכסים את הכלי וממשיכים בהליך הפציעה המושרה בלייזר.
העבירו את הגלמים המותקנים למיקרוסקופ שדה רחב המצויד במערכת אבלציה בלייזר מתכווננת. כוונן את לייזר האבלציה הנשאב בחנקן מקורר אוויר UV באורך הגל הרצוי באמצעות תא הצבע המתאים. לפציעה אופטימלית הגדר את קצב החזרה על הדופק ל-40 הרץ.
כעת, תוך שימוש במטרות פי 40 או 63 פעמים ושדה בהיר, התאימו את בקרות שלב המיקרוסקופ כדי לאתר את כנף הגולם של הגולם הראשון שנפצע. התמקד במישור של אפיתל כנף הגולם הקרוב ביותר להחלקת כיסוי הזכוכית. יישר את האזור שייפצע עם אזור המטרה הידוע של לייזר האבלציה.
לשם כך, נצל את סמן הכוונת בתוך עינית המיקרוסקופ. לאחר מכן התאם את עוצמת הלייזר על ידי התאמת שקופית מנחת צפיפות האנרגיה במיקרוסקופ. נצל את עצירות הלחיצה כדי להפוך את ההגדרה לניתנת לשחזור.
עכשיו כדי לגרום לפצע, הפעל את לייזר האבלציה בלחיצה מהירה על שליטה ידנית. לאחר מכן בדוק את הופעת בועת האוויר החולפת באתר האבלציה וזה נורמלי עם פציעה. אם הפציעה לא מצליחה, נסה לשנות את מישור המוקד.
לחלופין, הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר באמצעות שקופית המחליש עד להשגת גדלי הפצע הרצויים. לאחר פציעת שולי כנף הגולם, העבירו במהירות את צלחת הזכוכית עם תחתית הזכוכית למיקרוסקופ מתאים להדמיית זמן. לאחר מכן פתח את תוכנת לכידת התמונות המתאימה.
בתוכנה הפעל את הלייזרים המתאימים והתאם את העוצמה והרווח/היסט שלהם כדי לקבל מספיק אות פלואורסצנטי ללא רוויה של פיקסלים. בדרך כלל עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית בטווח של חמישה עד 20% פועלת בצורה הטובה ביותר כדי למזער את ההלבנה. התמקדו בכל כנף הגולם בהגדלה נמוכה או התמקדו בפצע בהגדלה גבוהה כדי לחקור תיקון פצע.
כדי ללכוד הן את האפיתל המתקן והן את גיוס התאים הדלקתיים, הגדר תחילה את המיקרוסקופ להקליט מחסנית z באמצעות התאמת המיקוד העדין בלוח הבקרה. סריקה מהאפיתל הפצוע ועד לחלל החוץ-תאי שמתחתיו המכיל המוציטים נודדים. לאחר מכן, הגדר את התוכנה להקליט פרוסות z דרך כנף הגולם כל שלושה מיקרון או במרווחי זמן הדוקים עוד יותר.
עבור הדמיית זמן-lapse, הקלט ערימות z לפחות כל 30 שניות למשך שעה אחת לפחות. בעת שימוש בבדיקות הניתנות להמרה כדי להמיר תמונות באופן סלקטיבי ולתייג תת-קבוצה של תאים במהלך ההדמיה, פתח את המודולים המתאימים בתוך תוכנת ההדמיה כדי לבצע את המרת התמונות ולהפעיל את הלייזר של 405 ננומטר. לאחר מכן בחר את התאים להמרת תמונות בתוך תוכנת FRAP באמצעות כלי בחירה.
לאחר מכן, הגדר את מסלול הזמן להמרת תמונות למסגרת איטרציה אחת והגדר את הלייזר של 405 ננומטר לעוצמת לייזר של 20%. לאחר מכן לחץ על התחל את הניסוי כדי לבצע המרת תמונות. לאחר השלמתו, צא ממודול FRAP וחזור למסך ההדמיה המקורי.
שם מכוונים את הלייזרים לפלואורופורים בשימוש ומצלמים את התאים שהומרו באור ולא הומרו באמצעות הקלטות זמן-lapse. הכנפיים הפצועות של גלמי דרוזופילה 18 שעות לאחר היווצרות הגולם צולמו באמצעות מיקרוסקופ זמן-lapse קונפוקלי. פגיעה שנגרמה על ידי לייזר באפיתל כנף הגולם עוררה נדידה מהירה של תאי חיסון מולדים של דרוזופילה הנקראים המוציטים לאתר הפצע.
ההמוציטים סומנו הן בסמן גרעיני והן בסמן ציטופלזמי או ציטו-שלד כדי לאפשר מעקב ותצוגה של המורפולוגיה שלהם, בהתאמה. מעקב אחר מסלולי הגרעין של ההמוציטים מדגים את הדינמיקה המרחבית-זמנית המורכבת של התגובה הדלקתית. תוך 30 דקות מרגע הפציעה, המוציטים הממוקמים הכי קרוב לאתר הפציעה החלו לנדוד לכיוון הפצע.
בסופו של דבר המוציטים הממוקמים בהדרגה רחוק יותר מהפציעה מתחילים לנדוד לכיוון הפצע. על ידי שימוש בפלואורופור Kaede הניתן להמרה לצילום, תת-אוכלוסיות של המוציטים כנפיים נודדים אלה סומנו באופן סלקטיבי. שיטה זו שימשה כדי להראות כי המוציטים שגויסו לפצע ראשוני אינם רגישים באופן זמני לפצע שני שנוצר 90 דקות לאחר מכן.
על ידי תיוג ה-E-cadherin בצמתים של דבקים תאיים עם GFP, ניתן לזהות בקלות את קצה הפצע וזה מאפשר ניתוח של דינמיקת ריפוי הפצע. רוב הפצעים מתחילים להתגלות מחדש תוך שעה מרגע הפציעה. קצה הפצע מתקדם פנימה והפצעים נרפאים בסופו של דבר תוך שלוש שעות.
לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן להכין מספר גלמים להדמיה חיה תוך 10 דקות בלבד, אך בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור שלאחר ניתוח ממארז הגולם שלהם, גלמי דרוזופילה פגיעים מאוד לנזק והתייבשות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום החיסון המולד לשתף פעולה עם ביולוגים חישוביים וליישם מודלים מתמטיים מתוחכמים יותר כדי לחקור את התנהגות האותות המושכים לפצע האחראים לגיוס התאים הדלקתיים. ואפילו לאחרונה סוגי תאים חלופיים סומנו גם כדי לעקוב אחר תגובתם לפגיעה הנגרמת על ידי לייזר וזה גילה שתאי אדיפוציטים, תאי גוף השומן של דרוזופילה, מגיבים גם הם לפצעים בתוך מערכת זו.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לדימות חי של תיקון פצעים ותגובה דלקתית בבובנאות של Drosophila. השיטה מאפשרת דימות ומעקב ארוכי טווח אחר אוכלוסיות תאים ספציפיות, ובכך משפרת את חקר ריפוי הפצעים והחסינות המולדת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- Drosophila מציעה נגישות גנטית לבחינת תהליכים ביולוגיים.
- שלב הגולם מאפשר דימות ממושך יותר בהשוואה למודלים מסורתיים.
- נוכחות ההמוציטים גדולה יותר במהלך שלב הגולם, מה שמקל על מחקרי תגובה חיסונית.
- נטרול גנים באמצעות RNAi יעיל יותר בגולמים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לדימיון ברזולוציה גבוהה של ריפוי פצעים.
- חקירת הדינמיקה של נדידת המוציטים במהלך תיקון פצעים.
- שיפור ההבנה של מנגנוני החסינות המולדת ב-Drosophila.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף והכנה של בובנאות Drosophila לצילום.
- גרימת פצעים באמצעות לייזר בכנפי בובות לצורך תצפית בזמן אמת.
- דימוי במרווחי זמן (Time-lapse imaging) ללכידת תגובות תאיות לאחר פגיעה.
- שימוש במ probes ניתנים להמרה פוטו-כימית לסימון אוכלוסיות תאים ספציפיות.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של נדידת המוציטים לאתרי הפצע.
- הוכחת יעילותו של מודל הגולם לחקר תיקון פצעים.
- זיהוי דינמיקות תאיות מרכזיות המעורבות בתגובה הדלקתית.
- אספקת פרוטוקול מפורט למחקרים עתידיים בריפוי פצעים.
מסקנות
- שלב הגולם של ה-Drosophila הוא יתרון למחקרי דימות חי.
- שיטה זו יכולה לתרום משמעותית להבנת תהליכי ריפוי פצעים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה כדי לבחון גורמים גנטיים שונים בחסינות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר דימות ברזולוציה גבוהה ובטווח זמן ארוך של דינמיקה של תאי דלקת במודל שניתן לטיפול גנטי, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליכי תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות למסלולי חסינות מולדת. על ידי לכידה של נדידת המוציטים ודינמיקת ריפוי פצעים בזמן אמת, הפרוטוקול מספק נתונים כמותיים הניתנים לשחזור, אשר מגבירים את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מקלה על שיתוף פעולה חוצה-תפקודים בין צוותי ביולוגיית גילוי וצוותי מידול חישובי כדי לחקור אותות משיכה לפצעים והתנהגות תאית הרלוונטית להתערבות טיפולית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר גיוס ותנהגות של תאי מערכת החיסון המולדת בתגובה לנזק רקמתי.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות ויזואליזציה של דינמיקת נדידת המהמוציטים ותגובה להפרעות גנטיות באמצעות RNAi.
- ערך חיזוי: משפר את תעדוף הפורטפוליו על ידי אספקת נתונים מרחביים-זמניים על תגובות דלקתיות, המגבירים את הביטחון במטרה ואת הרלוונטיות של המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקה המשכית, באמצעות ביסוס מודלים סטנדרטיים של פצעים עם גיוס תאי חיסון שניתן לכימות.
- ערך תפעולי: מענה לסוגיית השחזור של הבדיקה באמצעות פרוטוקולים עקביים של יצירת פצעים באמצעות לייזר ודימוי Time-lapse במספר בובות.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר הכנה של דגימות מרובות בתוך 10 דקות לאחר השליטה בטכניקה, ובכך תומך במוכנות לסריקה בקיבולת בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין תצפיות של גילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי מידול תהליכי דלקת שמורים במערכת הרלוונטית למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקדת בהפחתת סיכונים חזויה באמצעות ניתוח מפורט של מסלולי המוציטים ודינמיקת רה-אפיתליזציה של הפצע.
- סנכרון ביומרקרים: תומכת בחקירת ביומרקרים תרגומיים באמצעות פלואורופורים בעלי יכולת המרה פוטו-כימית כמו Kaede, למעקב אחר תתי-אוכלוסיות ספציפיות של תאי חיסון לאורך זמן.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות המטרה ועד לזיהוי המולקולה המובילה (lead identification), ומספקת תובנות מנגנוניות המנחות החלטות המשך (go/no-go) בתוכניות בשלבים מוקדמים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לתצפית בזמן אמת על דינמיקה של תאי מערכת החיסון המולדת בעקבות פגיעה ברקמה.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות יצירת פצעים סטנדרטית ודימוי כמותי של גיוס ופינוי המוציטים.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים מדידים הכוללים מסלולי נדידה, קצבי סגירת פצעים וקינטיקה של המרה פוטונית לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול התנהגות תאי חיסון הישימה למסלולי דלקת וריפוי פצעים בבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוי רב-פעמית למחקרים ארוכי טווח של משנים גנטיים ופארמקולוגיים של דלקת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בגיוס וברזולוציה של תאי דלקת.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות תהליכי עבודה מוגדרים להכנת בניש, פציעה ודימוי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים ביולוגית מוקדמת של מטרות אימונומודולטוריות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון באמצעות הערכה כמותית של פעילות המסלול ודינמיקת התגובה התאית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, במיקרו-כירורגיה ובמיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך ביצוע מוצלח של דיסקציה והרכבה של בופות.
- תלוי במערכות אבלציה בלייזר ובלייזר UV הניתן לכיונון לצורך השראת פצע מדויקת וניתנת לשחזור.
- מצריך סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח גודל פצע עקבי, מרווחי הדמיה ופרוטוקולי פוטו-המרה אחידים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת השיטה לסוגי תאים אחרים או לרקעים גנטיים מעבר להמוציטים ואפיתל.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שבירות הבופה לאחר הדיסקציה וסיכון להתייבשות, הדורשים טיפול זהיר ובקרות סביבתיות.
