הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אלפא-סינוקלאין, כגון להבהיר את מנגנון התפשטות הצבירה והרעילות של אלפא-סינוקלאין in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת טיהור גוזל זמן של סיבים מוכנים מראש של אלפא-סינוקלאין. תדגים את ההליך לוסיה רוטה, סטודנטית לתואר שני ממעבדת COLA.

כדי להתחיל בהליך, הכינו את מאגר ההומוגניזציה ושמרו אותו על קרח. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמה הטרייה או הקפואה בנפח של 1 עד 10 של מאגר הומוגניזציה קר כקרח באמצעות הומוגנייזר עלי טפלון עם 10 עד 15 פעימות. לאחר מכן, העבירו את כל ההומוגנאט הראשוני לצינור מיקרו-צנטריפוגה, וצנטריפוגה ב-1,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס על מנת להסיר גרעינים ותאים לא שבורים בגלולה המתקבלת.

לאחר מכן, השלך את גלולת התוצאה. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי, וצנטריפוגה אותו בטמפרטורה של 10,000 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה מקוררת על מנת להשיג את הסופרנטנט השני ואת הגלולה. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט הזה לבקבוק פוליקרבונט, וצנטריפוגה אותו ב-100,000 פעמים G למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ורוטור בזווית קבועה.

השעו מחדש את הגלולה הגולמית P100 עם 500 מיקרוליטר של מאגר ההומוגניזציה. העבירו את הגלולה הגולמית P100 לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי, וצנטריפוגה ב-10,000 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה מקוררת. לאחר 20 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את P100 עם 100 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה.

לאחר מכן, סוניקציה של הדגימה למשך שתי שניות על קרח, ואחסנו אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע Western Blot, הטיל ג'ל פוליאקרילאמיד בשיפוע של ארבעה עד 20% טריס-גליצין על מכשיר אלקטרופורזה אנכי. ממיסים מיקרוגרם אחד של שברי אלפא-סינוקלאין הקשורים למיקרוזומים במאגר הדגימה של דנטורציה, ומעמיסים אותו על הג'ל.

בבאר אחרת, טען חמישה מיקרוליטרים של סמן חלבון סטנדרטי. הפעל את הג'ל ב-100 וולט במאגר ריצה טריס-גליצין SDS עד שסמן החלבון מגיע לקצה הג'ל. לאחר מכן, העבירו את החלבונים לקרום ניטרוצלולוזה באמצעות מאגר קרבונט בסיסי.

שמור את הדגימה למשך הלילה בחדר הקירור עם הספק קבוע המוגדר על 200 מיליאמפר . למחרת, חסום את הממברנה עם PBS-T עם חלב יבש ללא שומן 5% על שייקר אורביטלי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לשטוף בקצרה את הממברנה עם PBS-T.

דגרו את הממברנה עם SIN-1 ב-1 עד 5,000, או נוגדן אלפא-סינוקלאין P-Ser129 ב-1 עד 5,000 בחלב יבש דל שומן של 2.5% ב-PBS-T למשך הלילה בחדר הקירור או במקרר בארבע מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי. למחרת, שטפו את הממברנה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם PBS-T על שייקר מסלולי. דגרו את הממברנה עם נוגדן משני מצומד HRP נגד עכבר או נגד ארנב ב-1 עד 3,000 בחלב יבש נטול שומן של 2.5% ב-PBS-T למשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי.

לאחר מכן, שטפו את הממברנה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם PBS-T על שייקר אורביטלי שלוש פעמים. השג את האות באמצעות ערכת הכימילומינסנציה הרגילה. כדי לטפל בנוירונים, משוך את אגרגטים אלפא-סינוקלאין הקשורים למיקרוזומים המתקבלים מחוט השדרה של שלושה עכברים טרנסגניים חולים שונים על מנת לקבל תמיסה של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר מדוללת עם מאגר ההומוגניזציה המקורי.

לאחר מכן, הסר שליש מהמדיום, והחלף אותו בעדינות במדיום נוירונים טרי. הוסף מיקרוגרם אחד של אגרגטים אלפא הקשורים למיקרוזומים מאוגדים למדיום התא. החזר את הנוירונים בחממה ב-37 מעלות צלזיוס.

הוסף שליש מדיום טרי לדגימה מבלי להחליף את המדיום אחת לשלושה ימים למשך שבוע. לאחר שבוע של טיפול, הסר שליש מהמדיום, והחלף אותו בעדינות במדיום טרי המכיל 2% B27, 10 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין ושני מילי-מולרי גלוטמין. חזור על הפעולה כל שלושה ימים למשך שבוע לפני תיקון התאים.

כדי לבצע אימונופלואורסצנטיות, במכסה אדים כימי מקבעים את הנוירונים עם 2% פרפורמלדהיד ו-PBS בתמיסת סוכרוז של 5% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מבלי לרעוד. לאחר 15 דקות, הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף לזמן קצר את הנוירונים עם PBS שלוש פעמים. לאחר מכן, לחדור את הנוירונים עם 0.3% של סורפקטין לא יוני ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו לזמן קצר את תאי העצב עם PBS שלוש פעמים. דגרו על הנוירונים עם 3%FBS ו-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים. לאחר מכן, דגרו את הנוירונים עם נוגדן ראשוני מתאים המומס ב-3% FBS ו-PBS למשך הלילה בחדר הקירור או במקרר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי.

למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים, ושטוף את התאים לזמן קצר עם PBS במשך שלוש פעמים. לאחר מכן, דגרו על הנוירונים עם הנוגדן המשני הפלואורסצנטי המתאים המומס ב-3% FBS ו-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך על שייקר מסלולי. יש להסיר את תמיסת הנוגדנים ולשטוף קצרות עם PBS שלוש פעמים.

לאחר מכן, צבעו את הנוירונים בתמיסת DAPI למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך על שייקר מסלולי. לאחר 15 דקות, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף קצרות עם PBS שלוש פעמים. התקן את החלקות הכיסוי על המגלשה באמצעות אמצעי הרכבה נגד דהייה.

במחקר זה, מתן מיקרוגרם אחד של אגרגטים אלפא-סינוקלאין הקשורים למיקרוזומים מאוגדים מעכברים טרנסגניים A53T חולים למדיום התרבות של נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס גורם להיווצרות תלוית זמן של תכלילי אלפא-סינוקלאין, חיוביים לנוגדני אלפא-סינוקלאין ספציפיים לצבירה. לאחר יומיים של טיפול, אגרגטים אלה מופיעים כפונקטה קטנה ומפוזרת שתהפוך לשופעת יותר בנקודות זמן מאוחרות יותר. לאחר שבועיים, תכלילי אלפא-סינוקלאין דומים למבנים דמויי חרוזים ארוכים ובוגרים המפוזרים בכבדות בתרביות הנוירונים בעקבות דפוס נויריט ומשתלבים חלקית עם סמנים פרה-סינפטיים ונויריטים.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להתאים את היחס בין מיקרוגרם של אגרגטים אלפא-סינוקלאין הקשורים למיקרוזום לצפיפות הנוירונים המצופים ולבודד אגרגטים אלפא-סינוקלאין הקשורים למיקרוזום מרקמה עשירה בתכלילים אלפא-סינוקלאין. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר אגרגטים אלפא-סינוקלאין הקשורים למיקרוזום מעכברים טרנסגניים חולים, כדי לשמש כטיפול לנוירונים ראשוניים כדי לגרום להיווצרות תכלילי אלפא-סינוקלאין.