מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

ROS תאיים הוכח לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. כאן, אנו מתארים וזמינותו רגיש לכימות תנועת ROS רמות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר. אנו מספקים גם פרוטוקולים להערכת את הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ, אשר תורמת הדיווחים תפקוד שונות הקשורות לגיל.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק טכניקות רגישות לניטור רמות ROS תוך תאיות ופנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות, או SASP, במהלך הזדקנות תאית. כאן, אנו מדגימים כי שיטות אלה חושפות בהצלחה את העלייה ברמות ה-ROS התוך-תאי וגורמי ה-SASP IL-6 ו-IL-8 במהלך הזדקנות הנגרמת על ידי H-Ras בפיברובלסטים אנושיים רגילים של WI-38. טכניקות אלו מאפשרות ניטור שינויים ברמות ה-ROS התוך תאיות במהלך הזדקנות התא וניתוח הביטוי של גורמי SASP.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שניתן ליישם אותם על מודלים רבים ושונים של הזדקנות תאית. לכן, שיטה זו יכולה בסופו של דבר לעזור לנו להבין את תפקידם של ROS ו-SASP בהזדקנות התאית ולחקור את מנגנוני הבקרה הבסיסיים. ידגימו את ההליך יאנג יון קים וג'י-היון אום מהמעבדה שלי.

התחל הליך זה על ידי הכנת רטרו-וירוס H-Ras. ראשית, זרעי תאי BOSC אקוטרופיים בצלחת תרבית מצופה פולי-ליזין, ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית רקמה למשך יום אחד. למחרת, העבירו את תאי ה-BOSC עם ה-DNA הרטרו-ויראלי H-Ras ואריזת DNA באמצעות מגיב טרנספקציה בהתאם להוראות היצרן.

לאחר שמונה שעות של טרנספקציה, הסר את אמצעי הטרנספקציה והוסף שמונה מיליליטר של מדיה טרייה. אסוף את המדיה המכילה חלקיקים נגיפיים 48 שעות לאחר מכן, והסר פסולת תאית על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, סנן את המדיה המכילה וירוסים עם מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר.

צלחת תאי WI-38 בצלחת תרבית של 60 מילימטר יום אחד לפני קציר הרטרו-וירוס H-Ras, ותרבית ליום אחד ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור. למחרת, הסר את מצע הגידול והוסף מיליליטר אחד של נגיף H-Ras. הוסף מיליליטר נוסף של מצע גידול המכיל שני מיקרוליטר של תמיסת מלאי פוליברן, ודגר למשך יום אחד בחממת CO2.

24 שעות לאחר ההדבקה, הסר את אמצעי הנגיף, שטוף את התאים פעמיים עם PBS והוסף את מצע הגידול. כדי להסיר תאים לא נגועים, יש לטפל בתאים במשך יומיים בשני מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין. הכן תמיסת צביעה בטא-גל SA טרייה על ידי דילול תמיסת המלאי.

הסר את אמצעי התרבית ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS. מוסיפים תמיסת קיבוע המכילה פורמלדהיד, ודוגרים במשך חמש דקות. הסר את תמיסת הקיבוע מהתאים ושטוף עם PBS.

הוסף תמיסת צביעה SA בטא-גל טרייה שהוכנה לכיסוי המנה. אטמו את הכלי עם Parafilm כדי למנוע ייבוש הדגימה, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא CO2. בדקו את מצב הצביעה של התאים במיקרוסקופ למחרת.

תאים חיוביים לבטא-גל SA יופיעו כחולים באזור הפרי-גרעיני. רכשו תמונה של צביעת בטא-גל של SA עם מצלמת CCD, וחשבו את אחוז התאים המוכתמים בבטא-גל SA על ידי ספירת מספר התאים החיוביים ל-SA בטא-גל בקרב לפחות 200 תאים בסך הכל. צלחת פעמיים 10 עד תאי WI-38 החמישיים על צלחת תרבית של 60 מילימטר, וגרמו להזדקנות על ידי הדבקת התאים ברטרו-וירוס H-Ras כפי שתואר קודם לכן.

בנקודת הזמן הרצויה למדידת ROS, הסר את מצע הגידול ושטוף פעם אחת עם PBS. נתק את התאים על ידי טיפול בתמיסת טריפסין/EDTA, וקבע את ספירת התאים. מעבירים אחד כפול 10 לתאים החמישיים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, ואוספים את התאים על ידי צנטריפוגה.

הסר את מצע הגידול בזהירות, והוסף מיליליטר אחד של מדיום צביעה DCF-DA טרי שהוכן לאחרונה. השעו בזהירות את כדור התא, ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ושוטפים פעם אחת עם PBS.

השעו מחדש את התאים עם מיליליטר אחד של PBS, והעבירו את הדגימות לתוך צינור FACS. ניתן למדוד את אות הקרינה DCF-DA באמצעות ציטומטר זרימה המצויד בלייזר כחול של 488 ננומטר. ראשית, הפעל דגימת תא בקרה לא מוכתמת.

בתרשים הנקודות של הפיזור קדימה לעומת פיזור הצד, בחר תאים חיים והסר תאים מתים ופסולת תאים באמצעות כלי שער. לאחר מכן, בהיסטוגרמה המציגה אות פלואורסצנטי DCF-DA, כוונן את מתח הלייזר הכחול כדי למקם את השיא מתאי הבקרה בקצה השמאלי. כעת, הריצו כל דגימה מוכתמת ב-DCF-DA, והקליטו לפחות 10,000 אירועים.

לגרום להזדקנות על ידי הדבקת התאים ברטרו-וירוס H-Ras כפי שתואר קודם לכן. יום אחד לפני הקציר יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. הוסיפו שלושה מיליליטר של DMEM ללא FBS, ותרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה למשך יום אחד.

לאחר 24 שעות, אספו את המדיום הממוזג, ואחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עבור ELISA שלאחר מכן. נסה את התאים, וקצור את התאים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על ידי צנטריפוגה. הכן RNA כולל בשיטת מיצוי RNA קונבנציונלית, וצור cDNA משני מיקרוגרם של RNA כולל באמצעות תגובת שעתוק הפוכה.

ל-PCR בזמן אמת, הכן את SYBR Green PCR Master Mix עבור כל התגובות המכילות את הפריימרים קדימה ואחורה עבור IL-6 או IL-8. הכן את תערובת התגובה לכל דגימה המכילה פריימרים אקטין כבקרה פנימית. הוסף 48 מיקרוליטר של Master Mix ושני מיקרוליטר של מוצרי cDNA מדוללים אחד עד שלושה לכל באר בצלחת qPCR אופטית של 96 בארות.

בצע כל תגובה בשלוש פעמים. הגדר את תוכנית תגובת ה-PCR בזמן אמת במחזור התרמי, ובצע PCR בזמן אמת. עם סיום הריצה, אסוף את ערכי מחזור הסף, או ערכי CT, וחשב את רמות ה-mRNA של IL-6 או IL-8 לאחר נורמליזציה לרמות האקטין.

הפשרה של מדיה מותנית שנאספה בעבר מתאי WI-38 מזדקנים. הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה בחום של 500 גרם למשך חמש דקות. רכז את המדיום המותנה פי 10 באמצעות פילטר צנטריפוגלי בגודל נקבוביות של 3,000 דלטון.

בצע את ה-ELISA עם ערכת IL-6 או IL-8 ELISA המתאימה. ראשית, יש לצפות היטב את צלחת ה-ELISA בנוגדנים מדוללים של IL-6 או IL-8 על ידי דגירה של הצלחת למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת כל באר ארבע פעמים, הוסיפו חיץ חוסם לכל באר ודגרו למשך שעה.

שוטפים את הצלחת ארבע פעמים. הוסף תקני ELISA בדילול סדרתי או דגימות מדיום מותנות מרוכזות, ודגירה למשך שעתיים. לאחר שטיפת הצלחת, יש לדגור את הדגימות עם נוגדן משני וסטרפטווידין-HRP מצומד ברצף.

הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע TMB לכל באר, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר התפתחות צבע. עצור את התגובה על ידי הוספת תמיסת עצירה. קרא את הספיגה של כל באר עם קורא ELISA ב-450 ננומטר.

התווה את העקומה הסטנדרטית עבור התקנים שנוצרו. לחשב את הריכוזים של IL-6 ו-IL-8 בתווך המותנה על פי העקומות הסטנדרטיות. התווה את התוצאות לאחר הנורמליזציה לספירת התאים.

זיהום של פיברובלסטים אנושיים רגילים WI-38 ברטרו-וירוס H-Ras גרם לשינויים דרמטיים במורפולוגיה התאית. פעילות צביעה של בטא-גל SA נצפתה ביותר מ-70% מהתאים, מה שמצביע על כך שביטוי H-Ras גורם להזדקנות תאית בתאי WI-38 תוך שישה ימים. ניתוח צביעה DCF-DA מגלה כי ביטוי H-Ras גורם גם לעלייה משמעותית ברמות ה-ROS התוך תאי.

העלייה ברמות ה-ROS התוך-תאיות נצפית כבר יומיים לאחר ביטוי H-Ras ונשמרת עד לנקודת הזמן של שישה ימים. ניתוח PCR בזמן אמת של גורמי ההפרשה המייצגים הקשורים להזדקנות IL-6 ו-IL-8 מגלה כי ביטוי mRNA של IL-6 ו-IL-8 מוגבר באופן ניכר בתאי WI-38 מזדקנים. ELISAs של מדיום מותנה אישרו כי הפרשת IL-6 ו-IL-8 מוגברת גם בתאים מזדקנים המושרים על ידי H-Ras.

גרימת הזדקנות תאית באמצעות ביטוי אונקוגן, נזק ל-DNA או מתח חמצוני אורכת בדרך כלל שישה עד שמונה ימים. לאחר שהתאים מוכנים, ניתן לבצע מדידת ROS תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר שליטה בטכניקות אלה, ניתן להשלים את ניתוח רמות ה-mRNA והחלבון של גורמי SASP תוך יום אחד.

בעת ניתוח רמות ROS ואינדוקציה של SASP, חשוב לאשר הזדקנות תאית באמצעות צביעת SA בטא-גל ושיטה נוספת במידת הצורך. בנוסף, חשוב לזכור כי העלייה ב-ROS מתרחשת בשלב המוקדם של ההזדקנות, בעוד שהתפתחות SASP ניתנת לזיהוי רק לאחר התבססות מלאה של ההזדקנות. ניתן ליישם טכניקות אלו על מגוון רחב של מודלים של הזדקנות תאית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את רמות ה- ROS והשראת SASP במהלך הזדקנות תאית.