תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך
1 ביוני 2018
כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו את העובר דג זברה סידור במערך תבנית, ולאחריו נוהל מפורט על השימוש של תבנית כזו עבור תפוקה גבוהה דג זברה סידור במערך העובר לתוך צלחת 96-ובכן.
שיטה זו יכולה להאיץ משמעותית את הליך סידור העוברים של דג הזברה ולהפוך את דג הזברה למתאים באמת לבדיקת תפוקה גבוהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בתבנית מודפסת בתלת מימד כדי לסדר מראש עוברי דג זברה למטריצת באר של 96 או 384, מה שמקל על תהליך הכנת צלחת יעיל ביותר. הרעיון לשיטה היה לנו לראשונה בעת ביצוע סינון של ננו-חלקיקים על ידי בחירה ידנית של עוברים בודדים לכל באר של צלחת מודולרית ורצינו להגביר את היעילות.
בנוסף לטיאן-יו, סטודנטית לתואר שני יואה ג'יאנג תדגים את ההליך. התחל הליך זה בתכנון תבנית המערך עם פריסה של שתים עשרה על שמונה 96 בארות המתאימה לצלחת סטנדרטית של 96 בארות. כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
השתמש במדפסת תלת מימד עם דיוק של 0.1 מילימטר כדי להדפיס את התבנית. כמה מרכיבי המפתח של התבנית הם תא הלכידה, באר הלכידה, תא הוואקום ויציאת האוויר פנימה. כדי לבצע את השרצת העובר של דג הזברה, תחילה הפרד זכרים ונקבות על ידי מפריד פלסטיק שקוף.
לאחר מכן, הניחו שני זוגות של דגים זכרים ונקבות לכל קופסת הזדווגות יום אחד לפני ההשרצה. ביום ההטלה, הסירו את המחיצות בבוקר כדי לערבב דגים זכרים ונקבות. הסר את הדג הזכר והנקבה ואסוף את עוברי דג הזברה באמצעות מסננת רשת דקה.
שוטפים את העוברים עם 250 מיליליטר מי ביצים. העבירו את העוברים שנאספו לצלחות פטרי עם הפתרון של הולטפרטר. הסר את העוברים המתים והלא מופרים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
מניחים את העוברים באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס. ארבע שעות לאחר ההפריה, התבוננו בעוברים והוציאו את כל העוברים המתים והלא בריאים. העוברים מוכנים כעת לשלב הבא.
שטפו את התבנית פעמיים-שלוש עם 500 מיליליטר מים נטולי יונים לפני הכנסתה לתנור הייבוש למשך חמש דקות. לאחר מכן, הדביקו את החדר התחתון עם סרט איטום חתיכה. חבר משאבת ואקום דרך יציאת האוויר בתחתית התבנית כדי ליצור לחץ שלילי בתא האטום על ידי סרט האיטום.
בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק, הניחו כ -150 עוברים בתבנית. מנערים את כל התבנית אופקית עד שבכל באר יש עובר אחד לכוד. בשלב זה, חשוב לבדוק ולוודא על כל עובר דג זברה זמין.
אם המאגר של הולטפרטר היה נמוך מאוד, אפשר היה להוסיף מאגר נוסף על ידי ניעור התבנית. השליכו עודף תמיסת הולטפרטר ועוברים שאינם לכודים בבארות. כבה ונתק את משאבת הוואקום.
הניחו צלחת סטנדרטית של 96 בארות הפוכה על התבנית וסובבו את שניהם בו זמנית. הקש על תחתית התבנית או חבר את יציאת האוויר לפחית אבק גז דחוס כדי להעביר את כל העוברים הלכודים מהתבנית לצלחת 96 הבארות. לבסוף, הסר את סרט האיטום ושטוף את התבנית שלוש פעמים מלמעלה למטה עם 500 מיליליטר מים נטולי יונים לשימוש עתידי.
מוצגת כאן תמונה חלקית של צלחת 96 בארות המסודרת על ידי התבנית. לעומת זאת, תמונה זו מציגה את התמונה החלקית של צלחת 96 בארות מסודרת ידנית. המצב הבריאותי הכללי של העוברים לאחר ציפוי בשיטות ידניות ותבנית מערך מוצג כאן.
בהתבסס על שיעורי הבקיעה, ההישרדות והמומים של העוברים, לא נצפו השפעות משמעותיות על הבריאות הכללית של העוברים בשני המקרים. לאחר שליטה, טכניקה זו תכין צלחת באר אחת של 96 או 384 תוך שתיים-שלוש דקות בלבד אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לנצל את מלוא התכונות החדשות של אורגניזם מודל זה ולהשיג באמת סינון תפוקה גבוהה במבחנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לתכנון ויצירת תבנית לסידור עוברים של דג זברה, המאפשרת סידור בעל תפוקה גבוהה לתוך צלחת של 96 באר. השיטה משפרת באופן משמעותי את יעילות הליך סידור העוברים של דג הזברה.
רכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
- סינון בעל תפוקה גבוהה
רקע
- דגי זברה נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביולוגי בשל עוברים שקופים.
- סידור יעיל של עוברים הוא קריטי עבור יישומי סינון בעל תפוקה גבוהה.
- שיטות מסורתיות כוללות בחירה ידנית, שעלולה להיות צורכת זמן רב.
- הכנסת תבנית מודפסת תלת-ממדית מציעה פתרון חדשני לשיפור היעילות.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לסידור עוברי דג זברה בעל תפוקה גבוהה.
- להשתמש בתבנית מודפסת תלת-ממדית לסידור יעיל של עוברים.
- לשפר את תהליך הסינון עבור יישומים שונים, כולל בדיקת ננו-חלקיקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון של תבנית לסידור מודפסת בתלת-ממד עם פריסה של 12 על 8.
- סידור מוקדם של עוברי דג זברה למטריצה של 96 או 384 באר.
- הדגמת הנוהל על ידי סטודנטים לתואר שני.
- פרוטוקול טקסט מפורט ליישומים.
תוצאות עיקריות
- התבנית המודפסת תלת-ממדית מאפשרת סידור עוברים מהיר ויעיל.
- חסכון משמעותי בזמן בהשוואה לשיטות ידניות.
- מאפשרת יכולות סינון בעל תפוקה גבוהה.
- הוכחה לאפקטיביות בהכנת צלחות לניסויים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח משפר את היעילות של סידור עוברי דג זברה.
- השימוש בתבנית מודפסת תלת-ממדית הוא חדשנות מרכזית.
- שיטה זו מועילה לחוקרים המבצעים סינון בעל תפוקה גבוהה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High throughput zebrafish embryo arraying is a critical bottleneck in phenotypic screening and early-stage compound evaluation. The introduction of a 3D-printed template with vacuum manipulation enables rapid, reproducible preparation of multi-well plates, directly supporting scalable screening workflows. This innovation enhances operational efficiency and supports portfolio-wide compound triage in discovery-stage biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates preparation of zebrafish embryos for hypothesis-driven compound testing.
- Enables robust phenotypic screening by standardizing embryo placement across wells.
- Supports functional target validation by facilitating high-content, parallelized assays.
Screening & Assay Development
- Delivers rapid, reproducible arraying of embryos for multi-well plate-based screening.
- Improves assay throughput and consistency, reducing manual variability.
- Enables efficient scaling to 96- and 384-well formats for compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Supports disease-relevant phenotypic assays in zebrafish embryos for translational insights.
- Facilitates continuity from early discovery to preclinical model validation.
- Reduces operational barriers to implementing high-throughput in vivo screening platforms.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D-printed template method integrates at the interface of early discovery and screening, enabling seamless transition from embryo collection to high-throughput phenotypic assays.
- Discovery Biology: Streamlines hypothesis testing by enabling rapid setup of parallel experimental conditions.
- Screening: Provides standardized, reproducible embryo arraying for quantitative screening outputs.
- Analytics: Supports consistent measurement of phenotypic endpoints across large sample sets.
- Translational Research: Bridges early discovery and preclinical validation by enabling scalable in vivo assays.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for repeated high-throughput screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological variability in screening assays.
- Operational Value: Standardizes embryo arraying, enabling reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, high-throughput phenotypic data generation.
Implementation Considerations
- Requires access to precision 3D printing and basic vacuum instrumentation.
- Demands operator proficiency in embryo handling and template operation.
- Standardization of washing and transfer steps is critical for reproducibility.
- Adaptable to both 96- and 384-well plate formats for diverse screening needs.
- Template cleaning and maintenance are essential for sustained performance.
