תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת
4 ביולי 2018
כאן אנו מציגים פרוטוקול דגימה דם הזנב-טיפ לאיסוף הדגימה תכופים בעכברים ערככם. שיטה זו שימושית עבור להערכת דפוסי הפרשת הורמון מחלמן פועמת, יכול להיות מותאם ניתוח גורמים אחרים במחזור.
המטרה הכוללת של דגימת דם תכופה בקצה הזנב היא להשיג דגימות דם מלאות למדידת הפרשת הורמון לוטניזציה פועם המכונה LH בעכברים ערים, לא מורדמים ומתנהגים כרגיל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירואנדוכרינולוגיה הרבייה על ידי מתן פרוטוקול אמין להערכת הפרשת הורמון פועם בעכברים. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שטיפול והרגלה תכופים יבטיחו מדידות חזקות ואמינות של דופק הורמון לוטניזציה לאחר טיפולים ניסיוניים חריפים או כרוניים.
במשך חמישה שבועות לפני איסוף הדם, טפל בעכברים על בסיס יומי מיום שני עד שישי. בשבועיים האחרונים, טפלו בעכברים גם בשבת וראשון. בצע את משטר הטיפול בעכבר בארון בטיחות ביולוגית.
הסר את העכבר הראשון מהכלוב שלו והנח אותו על משטח מתאים בתוך הארון. רסנו בעדינות את העכבר על משטח זה על ידי החזקת בסיס הזנב שלו. ואז ביד השנייה לטף בחוזקה את פני הגחון של הזנב מהבסיס ועד הקצה.
עשה זאת בסך הכל שש פעמים ולאחר מכן החזר את העכבר לכלוב שלו. זה מהווה סט טיפול אחד. כעת המתן שש דקות ובצע ערכת טיפול נוספת.
המשך דפוס זה עם מרווחים בין קבוצות, בצע ארבע ערכות טיפול בכל הפעלת טיפול. בסך הכל זה מספק עשרים וארבע משיכות זנב בכל מפגש. אם טיפולים ניסיוניים במהלך תקופת הדגימה יכללו שיטות טיפול נוספות כמו קשקוש או הזרקה תוך צפקית, אז גם התאקלמו העכברים לפעילות טיפול כזו במהלך מפגשי הטיפול.
שבועיים לפני יום איסוף הדם המתוכנן, יש לשכן את העכברים בזוגות כדי למזער את ההפרעה שלהם במהלך תקופת הדגימה. לאוספי הדם הכינו צינורות מיקרו צנטריפוגה של 0.6 מיליליטר לאחסון דם. סמן את הצינורות ועבור שלושה אוספי דם של מיקרוליטר ציטט חמישים ושבעה מיקרוליטר של מאגר ACES לכל צינור.
לאחר ההכנה יש לאחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס. בארון הבטיחות הביולוגית הכינו את הפריטים הבאים: קצות פיפטה, פח אשפה, טיימר, בול עץ חוויתי, דלי קרח המכיל את צינורות איסוף הדם, מספריים חדים וסטריליים, טוש קבוע וגזה קטנה. ארבעים וחמש דקות לפני תחילת איסוף הדם, הוציאו את העכבר הראשון מהכלוב שלו והניחו אותו על משטח מתאים.
לאחר מכן סמן את הזנב כדי לזהות במהירות את העכבר הזה מהשותף שלו לכלוב. כעת השתמש במספריים כדי להסיר מילימטר עד שניים מקצה הזנב. לאחר גזיזת הזנב יש ללטף בזהירות את הזנב עד שנוצרת טיפת דם בקצה.
לאחר מכן אספו שלושה מיקרוליטרים של דם והשליכו גם את הדם וגם את הקצה לפח האשפה. לאחר מכן, ודא שזרימת הדם נעצרה. במידת הצורך הפעל לחץ עדין עם גזה סטרילית.
לאחר מכן החזר את העכבר לכלוב שלו למשך שש דקות. כעת, במרווחים של שש דקות על פני ארבעים וחמש דקות, לטפו את הזנב בחוזקה כדי לקחת דגימות דם נוספות מהעכבר. אם לא נוצרת טיפת דם, טפחו את הזנב עם פד גזה ספוג במי מלח כדי לסייע בפינוי קריש הדם.
במהלך תקופת הדגימה שלפני הדגימה, השליכו את כל חומרי הדם. לאחר ארבעים וחמש דקות התחל את תקופת הדגימה. בעת לקיחת דגימות, העבירו שלושה מיקרוליטרים של דם לתוך צינור איסוף, ערבבו את הצינור בהיפוך והחזירו אותו לקרח.
כעת המשך בדגימה כל עוד יש צורך. לאחר מכן, המתת חסד של העכברים או ודא שזרימת הדם בזנב שלהם נעצרה לחלוטין ולאחר מכן ספק לעכברים כלוב נקי. לאחר מכן, העבירו דגימות דם לקופסת אחסון ואחסנו את הדגימות במינוס עשרים מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לנתח אותן.
הורמון לוטניזציה או LH נמדד בדגימות דם תכופות כדי לקבוע את התגובה לאתגר לחץ פסיכו-סוציאלי חריף. נקבה בוגרת C57 שחורה שישה עכברים עברו כריתת שחלות ודגימות דם נאספו במשך תשעים דקות כדי לבסס קו בסיס לפני הטיפול של הפרשת LH פועמת. לצורך הטיפול במאמץ במהלך הדגימה של תשעים דקות, חיות הניסוי הוכנסו למכשירי ריסון מכרסמים והועברו לכלוב חדש בזמן שהביקורת נשארה בכלובים הביתיים שלהם ולא הייתה מרוסנת.
הניתוח הראה כי לחיות הביקורת היו פולסים ברורים וחד משמעיים של LH לאורך כל תקופת הדגימה. לעומת זאת, הלחץ הפסיכו-סוציאלי של הריסון דיכא במהירות ובאופן חד משמעי הפרשת LH פועמת בקבוצת הניסוי. כאשר מתכוננים להשתמש בטכניקה זו, חשוב לזכור למזער הפרעות סביבתיות כגון רעש או הפרעות על ידי חוקרים אחרים שעלולים להלחיץ את העכברים ולהפריע להפרשת LH פועמת.
מאז פיתוחה על ידי ד"ר שטיין ואחרים במעבדת חן, טכניקה זו החלה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה לחקור את ויסות הדופק של LH במין שבו כלים מולקולריים וגנטיים מורכבים הם מעשיים וזמינים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתאר פרוטוקול לדגימת דם מקצה הזנב לצורך איסוף דגימות דם מעכברים שאינם קשורי, תוך התמקדות במדידה של הפרשת הורמון לוטאיניזן (LH) פולסטילית. השיטה תוכננה כדי לאפשר הערכות מהימנות של הפרשת LH פולסטילית, ובכך לתרום למחקרים בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה של הרבייה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירואנדוקרינולוגיה
- ביולוגיה של הרבייה
- התנהגות בעלי חיים
רקע
- הפרשה פולסטילית של הורמון הלוטאיניזציה היא קריטית בפיזיולוגיה של הרבייה.
- טכניקות אמינות לדגימת דם חיוניות למדידה מדויקת של תנודות הורמונליות.
- ייתכן ששיטות קיימות אינן מביאות בחשבון באופן מספק את השפעות הסטרס של בעלי החיים.
- פרוטוקול זה נועד למזער את הסטרס בעכברים במהלך איסוף דם.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול אמין לדגימת דם מקצה הזנב עבור עכברים שאינם מורחשים.
- הערכת הפרשה פולסטילית של LH בתגובה לטיפולים אקוטיים וכרוניים.
- שיפור הדיוק של שיטות מחקר נוירו-אנדוקרינולוגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפרוטוקול כולל טיפול יומי והרגלה של העכברים לפני איסוף הדם.
- נעשה שימוש בנקבות בוגרות של עכברי C57BL/6, כאשר הדם נדגם מקצה הזנב למדידת LH.
- מפגשי טיפול תכופים סייעו ביצירת סביבה נטולת סטרס.
- דגימות דם נאספו לאורך מסגרת זמן קבועה כדי לקבוע קווי בסיס הורמונליים.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה הובילה לאיסוף מוצלח של רמות LH בבעלי החיים שבקבוצת הביקורת.
- לחץ פסיכו-סוציאלי כתוצאה מריסון דיכא באופן משמעותי את הפרשת ה-LH בקבוצות הניסוי.
- הלחץ צמצם את המדידות המהימנות של הפרשת LH פולסטילית, דבר המדגיש את יעילות השיטה.
- נמצא כי הפרעות סביבתיות משפיעות על המדידות ההורמונליות.
מסקנות
- מחקר זה מבסס שיטה חדשנית להשגת מדידות הורמונליות מדויקות בעכברים.
- הפרוטוקול מאפשר לחוקרים לבחון ביעילות את ויסות ה-LH במחקרי נוירואנדוקרינולוגיה.
- הבנת השפעת הלחץ (stress) על הפרשת הורמונים תורמת לתובנות רחבות יותר לגבי פיזיולוגיה רבייתית והתנהגות בעלי חיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
דגימת דם תכופה מקצה הזנב בעכברים מאפשרת הערכה ברזולוציה גבוהה של הפרשת הורמון לוטאינצ'ינ (LH) פולסטילית, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף מטרות נוירואנדוקריניות. גישה זו תומכת בביטחון ניבוי בחקירת מסלולים מונעי-הורמונים ומספקת בסיס לקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של תיקי פיתוח באמצעות מדדים אנדוקריניים כמותיים ומהימנים. יכולתה של השיטה ללכוד דפוסים הורמונליים דינמיים בעכברים בעלי התנהגות חופשית משפרת את הרציפות התרגומית משלב הגילוי למחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מסלולי סיגנלינג נוירואנדוקריני באמצעות מדידה ישירה של הפרשת LH פולסטילית.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין תנודות הורמונליות פיזיולוגיות לכאלה המושרות על ידי סטרס.
- מספק נתוני תיקוף פונקציונלי של מטרות עבור תוכניות מחקר ברבייה ובנוירואנדוקרינולוגיה.
- מסייע בביטחון ניבוי במחקרים מכניסטיים של ויסות הורמונלי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מודלים של בעלי חיים שעברו תיקוף עבור בדיקות המשך בתחומי האנדוקרינולוגיה והנוירוביולוגיה.
- מספק מדידות הורמונליות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור וכמותיות, המתאימות לפיתוח בדיקות.
- מאפשר סריקה של התערבויות ניסיוניות המשפיעות על דינמיקת הפרשת הורמונים.
- תומך בהערכה אמינה של הפרעות גנטיות או השפעות של תרכובות in vivo.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקר הפרעות בויסות האנדוקריני ותגובות למצבי דחק.
- מבטיח רציפות מממצאי שלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות לוויסות הורמונלי.
- מספק נתונים מותאמי סיכון לקידום מטרות נוירואנדוקריניות בקו הייצור (pipeline).
- משפר את הפחתת הסיכונים החזויה (predictive de-risking) עבור פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף מהגילוי ועד לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה דינמית של הורמונים במודלים של בעלי חיים חיים, ובכך היא תומכת הן במחקרים מכניסטיים והן במחקר תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייעת בבדיקת השערות ובבירור נתיבים במערכות נוירואנדוקריניות.
- סריקה: מספקת קריאות LH כמותיות וניתנות לשחזור לצורך בדיקת מוכנות המערך וסריקת התערבויות.
- אנליטיקה: מספקת נתוני הורמונים בעת רחבה התומכים בהשוואה סטטיסטית של תנאים ניסויים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים של תפקוד אנדוקרי ותגובה למשמרים (stress response).
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכה הורמונלית דינמית במספר תוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליך התיקוף של יעדים נוירואנדוקריניים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דגימת הורמונים, המבטיחה שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) בין מחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים אנדוקריניים כמותיים ומהימנים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של יעדים והתערבויות המווסתים הורמונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בבעלי חיים ובפרוטוקולי דגימה נוירואנדוקרינית.
- נדרשת גישה לבדיקות הורמונליות ברגישות גבוהה ולתשתית אנליטית מתאימה.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי למזער גורמי לחץ סביבתיים ולחצים הנובעים מהטיפול.
- ניתן להתאמה למודלי עכברים שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור זנים או נקודות סיום שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בהרגלה ממושכת ובבקרה סביבתית קפדנית כדי להבטיח את שלמות הנתונים.
