Name: תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למדו פרוטוקול לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים ללא הגבלה להערכת הפרשת הורמון מחלמן פועמת. שיטה זו מאפשרת מדידות LH אמינות במחקר נוירואנדוקרינולוגיה תוך מזעור מתח החיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים תודה ד"ר ג'ניפר יאנג קאופמן אלכסנדר (סשה) לקבלת סיוע טכני עם טכניקה זו, כמו גם דיונים קריטיים ומסייע רבים. סרום הורמון מבחני בוצעו על ידי היאנג. et al., 2017 אוניברסיטת וירג'יניה במרכז לחקר רבייה ליגנד Assay ניתוח הליבה, נתמך על ידי מענק יוניס קנדי שרייבר NICHD/NIH (NCTRI) P50-HD28934.
מקורות תמיכה מחקר: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM נתמכה על ידי T32 NICHD 007203.

השיטה המתוארת כאן הוא מסכים עם הנחיות שימוש ו נבחרת מוסדות של בעלי חיים בריאות, קיבלו אישור על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו.
1. הסתגלות לטיפול
<ol><li>הליך הטיפול<ol>
<li>מקום העכבר הכלובים אבטחה הקבינט. הסר את העכבר הראשון הכלוב ואת המקום על משטח מתאים (למשל מכסה כלוב נקי) בתוך ארון אבטחה.</li>
		<li>בעדינות לרסן את העכבר על משטח העבודה על-ידי החזקת בבסיס הזנב עם לאצבע, של יד אחת. לאחר מכן, בחוזקה קו השטח הגחון של הזנב, מהבסיס ועד קצה הזנב, עם לאצבע, האגודל של היד השנייה. חזור על פעולה זו הוספת קו 6 פעמים (כלומר 1 מוגדרת) ולהחזיר את העכבר לכלוב שלו.</li>
		<li>חכה 6 דקות וחזור על שלב 1.1.2. הערה: בסך הכל, שלב 1.1.2 תחזור על עצמה 4 פעמים לכל העכבר (כלומר 4 קבוצות של קווים 6), כך כל עכבר יקבל סך של משיכות הזנב 24 על כל יום של טיפול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התדירות של טיפול יומי<ol>
<li>מ-5 עד שבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, להתמודד עם עכברים כפי שמתואר בשלב 1.1, חמישה ימים בשבוע (עכברים לא מטופלים ביום שבת או ראשון עד השבועיים האחרונים של הסתגלות).</li>
		<li>אם טיפול ניסיוני במהלך תקופת הדגימה יכלול כל טיפול נוספים (למשל scruffing או הזרקת בקרום הבטן), ואקלום העכברים פעילות זו טיפול בכל מפגש טיפול. הערה: עבור הסתגלות לשגרות הזרקה, השתמש מחט קהות לבצע זריקה המזויפים.</li>
		<li>במהלך השבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, להתמודד עם עכברים כמתואר ב- 1.1, שבעה ימים בשבוע.</li>
		<li>לפחות שבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, בית עכברים בזוגות כדי למזער שיבושים לעכברים במהלך הדגימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת צינורות איסוף דם
<ol><li>הכנת מאגר assay העדינה של LH בבקבוק זכוכית: אלבומין שור 0.2% ל- 0.05% Tween-20 ב- PBS [0.2 גרם אשלגן כלורי, 8 g NaCl, g 1.44 נה2HPO4 (נטול מים), 0.24 g ח'2PO4, מים הנדסה גנטית 1 ליטר, pH 7.4, מסנן אוטוקלב] , לאחסן ב 4 º C. 1 הערה: נפח של מאגר assay העדינה של LH להיות מוכן יכול להיות מחושב בהתבסס על מספר דוגמאות ואת אמצעי האחסון עבור דגימה כמצוין להלן (2.2 & דיונים)</li>
	<li>להכין צינורות איסוף דם (0.6 מ"ל microcentrifuge צינורות). תווית צינורות, מאגר aliquot assay (57 µL מאגר למחזור; הערה, אמצעי אחסון זה עשוי להשתנות בהתאם נפח הדם שנאספו או היחס של הדם אל המאגר הרצוי). צינורות יכול להיות מוכן ימים לפני דגימה, לאחסן ב 4 º C.</li>
</ol>3. איסוף דם
<ol><li>הכנת דם אוסף חומרים.<ol>
<li>להכין הקבינט אבטחה לשימוש ולארגן את החומרים הבאים בשכונה או על עגלה בקרבת מקום: פיפטה טיפים פיפטה (ערכת 3 µL או נפח איסוף הדם הרצויה), 10 µL, לבזבז סל טיפים בשימוש פיפטה, טיימר, התדפיס עם מספרים בעלי חיים, דוגמת מספרים ( עבור הערות בנוגע לסוגיות מדגם או בעלי חיים), קרח בדלי עם צינורות איסוף דם, מספריים, גזה קטנים (2 "x 2"). הערה: "לספור עד" פונקציה על טיימר מעבדה שימושי. כי אין לו התראה נשמעים עלול להפריע העכברים</li>
		<li>השתמש בסמן קבוע כדי לסמן את הזנב של כל עכבר (ליד הבסיס) כדי לסייע בזיהוי מהיר של העכבר הנכון במהלך הדגימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מסיכה של הכנת זנב ואיסוף הדם מראש.<ol>
<li>ב- 45 דקות לפני תחילת איסוף דם, להסיר את העכבר הראשון מהכלוב ומניחים על משטח מתאים (מכסה כלוב נקי עובד היטב) בתוך אבטחה הקבינט.</li>
		<li>להשתמש במספריים חדות, סטרילי כדי להסיר 1-2 מ מ של קצה זנב העכבר, בעקבות הכנת אספטי (קרי לשפשף עם betadine ואלכוהול). הערה: זה יכול להתבצע בבעלי ער באיפוק עדין או תחת הרדמה איזופלוריין.  בנוסף, שיכוך כאבים עשויים להינתן בעקבות המלצות IACUC המקומי.</li>
		<li>בזהירות ללטף את הזנב של העכבר כפי שתואר לעיל (1.1.2; 1-2 קווים מספיקים בדרך כלל) עד ה-droplet של דם צורות בקצה הזנב.</li>
		<li>השתמש פיפטה עם טיפ נקי כדי לאסוף 3 µL של דם מקצה הזנב ולהשליך את הטיפ פיפטה עם דם.</li>
		<li>לפני שחזר העכבר לכלוב שלו, לוודא כי זרימת הדם הפסיק. במידת הצורך, החל לחץ עדין עם גזה סטרילית.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.2.1 - 3.2.5 עבור כל העכברים. ניתן לאסוף דגימות דם עוקבות מאת בחוזקה ללטף את הזנב של העכבר עד droplet של צורות דם בקצה הזנב. הערה: אם droplet דם אינו הטופס לאחר משיחות המשרד, הזנב יכול להיות נכנס עם כרית גזה ספוגה תמיסת מלח. קרישי דם הם נוטים יותר טופס במהלך דגימה בתדירות נמוכה יותר (קרי > במרווחי זמן של 15 דקות). לאחר שקריש מנוקה מן הווריד, הדגימה תוכל להמשיך.</li>
		<li>להמשיך לאסוף 3 µL של דם בכל עכבר כמתואר לעיל כל 6 דקות למשך כ- 45 דקות במהלך תקופה זו הכנה איסוף דם מראש. למחוק את הטיפ דם, פיפטה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקיחת דמים<ol>
<li>לאסוף 3 µL של דם מקצה הזנב כמתואר לעיל. קח זהירות כדי להבטיח כי לקיחת דגימה 3 µL כולו לתוך קצה פיפטה (ללא בועות או מצעים זיהום). הוצא את דגימת הדם לתוך המאגר assay בשפופרת עם תוויות. לערבב על ידי היפוך ולחזור ברכבת התחתית לקרח.</li>
		<li>לפני שחזר העכבר בכלוב, להבטיח זרימת הדם הפסיק. במידת הצורך, החל לחץ עדין עם גזה סטרילית.</li>
		<li>חזור על הצעדים 3.3.1 - 3.3.2 עבור כל עכבר, כל 6 דקות, משך הדגימה מראש. לפקח על כל בעל חיים סימנים של מצוקה (למשל סגור חלקית העפעפיים, תפקיד הכפוף [אינה נגרמת על ידי טיפול אחר] או חוסר תגובה לטיפול) ולסיים את הדגימה, במידת הצורך. הערה: מצוקה התנהגותית או לסיבוכים אחרים הדורשים סיום של הדגימה מתרחשות לעתים רחוקות מאוד במעבדה שלנו.</li>
		<li>אם בעלי חיים אינם מורדמים בעקבות לקיחת דמים, להבטיח זרימת הדם מהקצה הזנב הפסיק לגמרי. לנגב דם שנשפך מהחלק הפנימי של כל חיה בכלוב (או שינוי הכלובים) ולחזור חיות הכלובים אל המדף דיור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לטעום עיבוד וניתוח
<ol><li>לאחסן דגימות דם ב-20 ° C עד הניתוח. הערה: LH הוא לבדיקה בדגימות דם מדולל במאגר assay; אין הפרדה של sera או פלזמה נדרשת לפני אחסון או ניתוח.</li>
	<li>Assay דגימות דם מאת אליסה העדינה כמו שתואר לעיל ערכים1 וח ב- ng/mL של דם מלא בעקבות תיקון עבור דילול של אמצעי האחסון מדגם במאגר וזמינותו.</li>
	<li>לזהות LH פולסים בערכת הנתונים. לחשב ולהשוות הדופק הממוצע משרעת תדירות דופק (או מרווח בין הדופק) בהתאם לערכת הנתונים. הערה: קריטריונים שפורסמו13,14 תוכניות,15,16 לגילוי פולסים LH הינם זמינים.</li>
</ol>

<ol><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li>
<li>McArdle, C. A., Roberson, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcArdle%2C+CA+%22Knobil+and+Neill%27s+Physiology+of+Reproduction%22">Knobil and Neill's Physiology of Reproduction</a>. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).</li>
<li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li>
<li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+luteinizing+hormone+pulse+frequency+and+amplitude+by+testosterone+in+the+adult+male+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat.</a> Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).</li>
<li>Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+a+robust+arcuate+GABAergic+input+to+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+a+model+of+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).</li>
<li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulse+and+Surge+Profiles+of+Luteinizing+Hormone+Secretion+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li>
<li>Campos, P., Herbison, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li>
<li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li>
<li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li>
<li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technic+for+obtaining+blood+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A new technic for obtaining blood from mice.</a> Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).</li>
<li>Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+of+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li>
<li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li>
<li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone%3A+differential+suppression+by+ovarian+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li>
<li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li>
<li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DynPeak%3A+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001(2012).</li>
<li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li>
<li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li>
<li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Stress%22%5BJournal%5D)">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li>
<li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosterone%2C+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding%2C+and+its+effect+on+nearby+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal%22%5BJournal%5D)">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li>
<li>United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017).</li>
<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן נתאר פרוטוקול עבור איסוף דם תכופים של דגימות דם כל זנב-טיפ להערכת הפרשת LH פועמת בעכברים. פרוטוקול זה מאפשר איסוף דגימות לגילוי של שינויים חריפה פועמת הפרשת LH בעקבות חשיפה דחק פסיכו-סוציאלי, והוא מותאם היטב עבור הערכה של LH פולסים מתחת אחרים מניפולציות אקוטי או כרוני.
הטיפול הוא מרכיב קריטי של פרוטוקול זה להשגת פרופילים אמין וחזק של LH פולסים תקופת הסתגלות. הרעיון כי טיפול מתח עלול לפגום הפרשת הורמון העריך בספרות,17 אבל במפורש לא נבדק. עם זאת, ניתוח של LH נציג את ה...

תפקוד בלוטת המין אצל יונקים הוא תלוי גונדוטרופין הפרשת הורמון מחלמן (LH), הורמוני, מבלוטת יותרת המוח. Gonadotropins המופרשים בדפוס או פועמת או גל בתגובה היפותלמי הפרשת הורמון releasing – גונדוטרופין (GnRH). סינתזה של הפרשת LH ו- FSH מוסדרים באמצעות פעולה אנדוקרינית, paracrine ו- autocrine מתוך מגוון של מולקולות כולל GnRH היפותלמי, האשכים הורמונים סטרואידים, מערכת activin-inhibin-follistatin, כמו גם מספר עצום של מצבים פיזיולוגיים כולל איזון מתח ואנרגיה. 2
הדפוס פועמת של LH בדם נובע הפרשות די פתאומי של LH לדם ההיקפי, ואחריו כ מעריכי חיסול. חשוב על תכונות של הדפוס כוללות את התדירות של כל הפרשה LH את משרעת של התגובה LH, אשר שניהם מוכתבים, בחלקו, על ידי שחרורו של GnRH. בשל הקושי באיסוף הדם פורטל ההיפותלמוס, יותרת המוח למדידת GnRH פועמת, דגימה של מדידה של LH משמש כמדד לקבלת GnRH רגולציה של הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים. לכן, מידע קריטי מקודד בתדר ו משרעת של LH פולסים, אשר לא ניתן לקבוע מתוך מדגם בודד.
ניתוח של הפרשת LH פועמת היסטורית הוגבלה ל היונקים הגדולים (בני אדם, יונקים ו כבשים) עקב שלהם נפח הדם גדול וסובלנות עבור איסוף דגימת דם תכופים. בחולדות, דגימה דם תכופים היה מוגבל חולדה, מושגת באמצעות שכינתה קטטר פרפור. 3 , 4 עלות נמוכה יחסית וזמינות של גנטי (למשל cre-לקס, CRISPR) ולבצע מניפולציות מורכבות מעגל עצבי (למשל optogenetics, chemogenetics) עכברים אורגניזם מודל יפה; עם זאת, הפרי של דגימות דם תכופים וניתוח עוקבות של LH ריכוזים עד לאחרונה, הוכח חמקמק. מטלה זו היה חלוץ ידי סטיין ועמיתים לעבודה. 1 מאז אז, מספר מעבדות החלו לנצל דגימה דם תכופים ואת מבחני לאולטרה רגישות LH כדי להעריך את הפרשת LH פועמת במגוון של פרדיגמות ניסיוני. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 יצוין כי המרדף אחר שיטה מעשית של איסוף דגימות דם מרובים מעכברים כבר מתקיים כבר שנים לפחות 4010 עם ליטושים מרובים שנעשתה בדרך. 11 , 12
הערכת דפוסי הדופק LH (כלומר תדר ו משרעת) מייצג עידון הגדולות בפיקוח גונדוטרופין הבזליים הפרשת במודל בעלי חיים זה גנטית צייתן. באופן מסורתי, LH ריכוזים בעכברים היו נחושים בדגימת דם בודדת. חולשה אחת הדוגמאות נקודה אחת היא ערכת נתונים משתנה מאוד בגלל ריכוזים LH הם יציבים באופן טבעי במהלך לכל פעימה. חולשה נוספת היא כי מדידות מבודד מטבעו לפסוח על מידע חיוני מועברת על ידי דפוסי הפרשת LH דופק. לפיכך, שיטה לאיסוף דגימות דם תכופים ב להתנהג בחופשיות, עכברים ערככם (למעט טיפול עדין במהלך דגימה) לספק מידע משופרת ולהוכיח שימושי מעבדות רבות חוקרים הורמון פועמת רגולציה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האוסף של בתדירות גבוהה (כל 6 דקות) דם דגימות ער, ערככם עכברים. חשוב לציין, אנו כוללים טיפול הסתגלות פרוטוקול המאפשר עבור זיהוי חזקה ומתמשכת של הפרשת LH פועמת בדגימות דם שנאסף מעל ניתן לקבוע את משך הזמן בו מראש, שלאחר הערכת אתגר חריפה, כמו התגובה ללחץ פסיכו-סוציאלי של קיבעון ואיפוק. וזמינותו יעיל עבור LH ריכוזים של דגימות דם שתיארנו קודם לכן; 1 שפרוטוקול זה מתמקדת שיטה לאיסוף דגימות הדם למדידה הדופק LH.

<table><tbody><tr><td>Biosaftey cabinet</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (נטול מים)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד</td><td>Millipore</td><td></td><td>מים מטוהרים ומסוננים</td></tr><tr><td>מכשיר ריסון מכרסמים ברום</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>52-0460</td><td>לא הכרחי לאיסוף דם, אך שימשו לאיסוף נתונים מייצגים.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת

Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

במערכות רבות האנדוקרינית, במחזור הורמונים או גורמים לא מתפרסמים באופן רציף, אך מופרשים כמו דופק דיסקרטית בתגובה גורם releasing. נקודה אחת דגימה אמצעים מתאימים להבין באופן מלא את המשמעות הביולוגית של התבנית הפרשה של הורמונים פועמת בתנאים רגילים הפיזיולוגיות או במהלך תנאי dysregulation. הורמון מחלמן (LH) מסונתז על ידי תאים gonadotrope יותרת המוח הקדמי והוא מופרש בצורה תבניתית פועמת המחייב אוסף תכופים של דגימות דם להערכת הדופק. זה לא היה אפשרי בעכברים עד לאחרונה, עקב התפתחות assay LH רגישות גבוהה, התקדמות טכניקה עבור תכופים בנפח נמוך המדגם אוסף, תיאר בתחילה על ידי סטיין ועמיתיו. 1 כאן נתאר פרוטוקול עבור אוסף דגימת דם היקפיים תכופים של עכברים עם הסתגלות טיפול מספיק כדי לזהות פועמת הפרשת LH. בפרוטוקול הנוכחי מפרט תקופת הסתגלות מורחב המאפשר הערכה של פולסים חזקה ומתמשכת של LH שעות מרובות. פרוטוקול זה, קצה הזנב מקוצצת, דם נאסף מן הזנב באמצעות פיפטה של כף יד. עבור הערכה של LH פועמת בעכברים gonadectomized, טורי הדגימות שנאספו כל 5-6 דקות עבור 90-180 דקות חשוב, האוסף של דם ומדידה של פולסים חזקים של LH יכול להתבצע בעכברים ער, להתנהג בחופשיות, לתת טיפול הולם הסתגלות, מאמץ כדי למזער את גורמי איכות הסביבה. הסתגלות מספיק יכולה להיות מושגת תוך 4-5 שבועות לפני איסוף דם. פרוטוקול זה מדגיש ההתקדמות המתודולוגיה כדי להבטיח אוסף דגימות דם מלא עבור הערכת דפוסי הפרשת LH פועמת במשך שעות רבות בתוך העכבר, במודל בעלי חיים רב עוצמה לחקר נוירואנדוקרינים.

נציג LH הדופק דפוסים של עכברים 4 מוצגים באיור 1 (נתונים הודפס מחדש של יאנג. et al., 2017). LH נמדדה בדגימות דם בתדירות גבוהה כדי לקבוע את התגובה מהווה אתגר כהתקפת פסיכו-סוציאלי. עכברים C57/Bl6 הנשי למבוגרים היו ovariectomized, טיפל כמפורט בפרוטוקול זה עבור איסוף דם תכופים. דגימות דם נאספו עבור 90 דקות הראשון בכל בעלי החיים כדי לקבוע תוכנית בסיסית לטיפולי קדם של הפרשת LH פועמת. במהלך 90 דקות השני הדיגום, חיות (שאינם הדגיש) בקרת נותרו בכלובים שלהם, איפ...

כאן אנו מציגים פרוטוקול דגימה דם הזנב-טיפ לאיסוף הדגימה תכופים בעכברים ערככם. שיטה זו שימושית עבור להערכת דפוסי הפרשת הורמון מחלמן פועמת, יכול להיות מותאם ניתוח גורמים אחרים במחזור.

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

המטרה הכוללת של דגימת דם תכופה בקצה הזנב היא להשיג דגימות דם מלאות למדידת הפרשת הורמון לוטניזציה פועם המכונה LH בעכברים ערים, לא מורדמים ומתנהגים כרגיל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירואנדוכרינולוגיה הרבייה על ידי מתן פרוטוקול אמין להערכת הפרשת הורמון פועם בעכברים. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שטיפול והרגלה תכופים יבטיחו מדידות חזקות ואמינות של דופק הורמון לוטניזציה לאחר טיפולים ניסיוניים חריפים או כרוניים.במשך חמישה שבועות לפני איסוף הדם, טפל בעכברים על בסיס יומי מיום שני עד שישי. בשבועיים האחרונים, טפלו בעכברים גם בשבת וראשון. בצע את משטר הטיפול בעכבר בארון בטיחות ביולוגית.הסר את העכבר הראשון מהכלוב שלו והנח אותו על משטח מתאים בתוך הארון. רסנו בעדינות את העכבר על משטח זה על ידי החזקת בסיס הזנב שלו. ואז ביד השנייה לטף בחוזקה את פני הגחון של הזנב מהבסיס ועד הקצה.עשה זאת בסך הכל שש פעמים ולאחר מכן החזר את העכבר לכלוב שלו. זה מהווה סט טיפול אחד. כעת המתן שש דקות ובצע ערכת טיפול נוספת.המשך דפוס זה עם מרווחים בין קבוצות, בצע ארבע ערכות טיפול בכל הפעלת טיפול. בסך הכל זה מספק עשרים וארבע משיכות זנב בכל מפגש. אם טיפולים ניסיוניים במהלך תקופת הדגימה יכללו שיטות טיפול נוספות כמו קשקוש או הזרקה תוך צפקית, אז גם התאקלמו העכברים לפעילות טיפול כזו במהלך מפגשי הטיפול.שבועיים לפני יום איסוף הדם המתוכנן, יש לשכן את העכברים בזוגות כדי למזער את ההפרעה שלהם במהלך תקופת הדגימה. לאוספי הדם הכינו צינורות מיקרו צנטריפוגה של 0.6 מיליליטר לאחסון דם. סמן את הצינורות ועבור שלושה אוספי דם של מיקרוליטר ציטט חמישים ושבעה מיקרוליטר של מאגר ACES לכל צינור.לאחר ההכנה יש לאחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס. בארון הבטיחות הביולוגית הכינו את הפריטים הבאים: קצות פיפטה, פח אשפה, טיימר, בול עץ חוויתי, דלי קרח המכיל את צינורות איסוף הדם, מספריים חדים וסטריליים, טוש קבוע וגזה קטנה. ארבעים וחמש דקות לפני תחילת איסוף הדם, הוציאו את העכבר הראשון מהכלוב שלו והניחו אותו על משטח מתאים.לאחר מכן סמן את הזנב כדי לזהות במהירות את העכבר הזה מהשותף שלו לכלוב. כעת השתמש במספריים כדי להסיר מילימטר עד שניים מקצה הזנב. לאחר גזיזת הזנב יש ללטף בזהירות את הזנב עד שנוצרת טיפת דם בקצה.לאחר מכן אספו שלושה מיקרוליטרים של דם והשליכו גם את הדם וגם את הקצה לפח האשפה. לאחר מכן, ודא שזרימת הדם נעצרה. במידת הצורך הפעל לחץ עדין עם גזה סטרילית.לאחר מכן החזר את העכבר לכלוב שלו למשך שש דקות. כעת, במרווחים של שש דקות על פני ארבעים וחמש דקות, לטפו את הזנב בחוזקה כדי לקחת דגימות דם נוספות מהעכבר. אם לא נוצרת טיפת דם, טפחו את הזנב עם פד גזה ספוג במי מלח כדי לסייע בפינוי קריש הדם.במהלך תקופת הדגימה שלפני הדגימה, השליכו את כל חומרי הדם. לאחר ארבעים וחמש דקות התחל את תקופת הדגימה. בעת לקיחת דגימות, העבירו שלושה מיקרוליטרים של דם לתוך צינור איסוף, ערבבו את הצינור בהיפוך והחזירו אותו לקרח.כעת המשך בדגימה כל עוד יש צורך. לאחר מכן, המתת חסד של העכברים או ודא שזרימת הדם בזנב שלהם נעצרה לחלוטין ולאחר מכן ספק לעכברים כלוב נקי. לאחר מכן, העבירו דגימות דם לקופסת אחסון ואחסנו את הדגימות במינוס עשרים מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לנתח אותן.הורמון לוטניזציה או LH נמדד בדגימות דם תכופות כדי לקבוע את התגובה לאתגר לחץ פסיכו-סוציאלי חריף. נקבה בוגרת C57 שחורה שישה עכברים עברו כריתת שחלות ודגימות דם נאספו במשך תשעים דקות כדי לבסס קו בסיס לפני הטיפול של הפרשת LH פועמת. לצורך הטיפול במאמץ במהלך הדגימה של תשעים דקות, חיות הניסוי הוכנסו למכשירי ריסון מכרסמים והועברו לכלוב חדש בזמן שהביקורת נשארה בכלובים הביתיים שלהם ולא הייתה מרוסנת.הניתוח הראה כי לחיות הביקורת היו פולסים ברורים וחד משמעיים של LH לאורך כל תקופת הדגימה. לעומת זאת, הלחץ הפסיכו-סוציאלי של הריסון דיכא במהירות ובאופן חד משמעי הפרשת LH פועמת בקבוצת הניסוי. כאשר מתכוננים להשתמש בטכניקה זו, חשוב לזכור למזער הפרעות סביבתיות כגון רעש או הפרעות על ידי חוקרים אחרים שעלולים להלחיץ את העכברים ולהפריע להפרשת LH פועמת.מאז פיתוחה על ידי ד"ר שטיין ואחרים במעבדת חן, טכניקה זו החלה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה לחקור את ויסות הדופק של LH במין שבו כלים מולקולריים וגנטיים מורכבים הם מעשיים וזמינים.

frequent-tail-tip-blood-sampling-mice-for-assessment-pulsatile

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מראה כיצד לגרום hypophysitis אוטואימוניות בעכברים SJL וכיצד להעריך חומרתה ידי histopathology.

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

בסרטון זה אנו מדגימים הליך חיתוך זנב במודל עכבר לאיסוף דם היקפי. הדם שנאסף נתון לאחר מכן לצנטריפוגה לפלזמה נפרדת, אשר יכולה לשמש לניסויים נוספים.

הליך חיתוך זנב עכבר לאיסוף דם היקפי ובידוד פלזמה

דגימות דם שימושיות להערכת סמנים ביולוגיים של מצבים פיזיולוגיים או מחלה in vivo. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה לדגימת דם מווריד הזנב הצדדי בחולדה. שיטה זו מספקת דגימות מהירות עם מינימום כאב ופולשניות.

דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

אנו מתארים את התפתחות מודל העכבר PCOS דמוי רזה עם גלולה דיהידרוטסטוסטרון ללמוד הפתופיזיולוגיה של PCOS, הצאצא של סכרים PCOS דמוי אלה.

מודל Hyperandrogenic העכבר ללמוד תסמונת השחלות הפוליציסטיות

מחקר זה דוחות דיגום הדם של וריד הזנב בעכברים באמצעות מערכת צינור שאיבת ואקום עם זכוכית מגדלת מוכספת. השיטה שלנו קל לתרגל, ניתן להשתמש עבור לקיחת דמים חוזרים בעכברים.

איסוף ששונה דם מן הוורידים הזנב של עכברים שאינם מרדימים עם מערכת איסוף הדם ואקום, זכוכית מגדלת מוכספת

מאמר זה מספק שלוש גישות קלות ונגישות להערכת חילוף החומרים של השומנים בעכברים.

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

מאמר זה מתאר טכניקת טיפול בעכברים, טכניקת הטיפול בתלת-ממד, המאפשרת טיפול שגרתי על ידי הפחתת התנהגויות דמויות חרדה ומציגה פרטים על שתי טכניקות קשורות קיימות (טיפול במנהרה וזנב).

טכניקות טיפול להפחתת מתח בעכברים

מחקר זה מתאר את המדידה הישירה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי יציב באמצעות וריד הזנב הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז יחד.

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

פעימות הורמון luteinizing (LH) הוא סימן היכר של תפקוד הרבייה. אנו מתארים פרוטוקול להפעלה מרחוק של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות הקשורות לאיסוף דם אוטומטי סדרתי. טכניקה זו מאפשרת אפנון הורמונלי מתוזמן, ריבוב ומזעור השפעות מניפולציה על רמות LH בבעלי חיים הנעים בחופשיות מודעת, וללא הפרעה.

הפעלה עצבית מרחוק יחד עם דגימת דם אוטומטית כדי לגרום ולמדוד הורמון luteinizing במחזור בעכברים

הפרוטוקול נועד לתאר מודל עכברי ליצירת הישנות של לוקמיה לימפובלסטית חריפה, בהתבסס על הדינמיקה של התגובה לכימותרפיה אינדוקציה.

מודל עכברי של הישנות לוקמיה לכימותרפיה אינדוקציה ללוקמיה לימפובלסטית חריפה

למדו פרוטוקול לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים ללא הגבלה להערכת הפרשת הורמון מחלמן פועמת. שיטה זו מאפשרת מדידות LH אמינות במחקר נוירואנדוקרינולוגיה תוך מזעור מתח החיה.

תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת

גלה סרטונים נוספים