Name: בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: למד מדידת כוחות תאיים ומכניקת רקמות בזמן אמת בעוברי Drosophila באמצעות מלקחיים אופטיים ללא חרוזים בשילוב מיקרוסקופיית light sheet. שיטה זו מאפשרת ניתוח ראולוגי מינימלי פולשני של מגעים בין תאים במהלך מורפוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי עקרות Equipe גרנט עקרות DEQ20130326509, סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש גרנט ANR-בלאן, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (ל פ-F.L.). אנו להכיר תשתית צרפת-BioImaging הנתמכים על ידי הצרפתי הלאומי לחקר הסוכנות (ANR-10-INBS-04-01, «השקעות לעתיד»). אנו מודים Brice Detailleur ו קלוד מורטי מן התשתית PICSL-בי-איי לקבלת סיוע טכני.

<ol><li>Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation%2C+transmission%2C+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li>
<li>Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li>
<li>Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).</li>
<li>Campàs, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li>
<li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004(2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li>
<li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+state%2C+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface+%2F+the+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li>
<li>Etournay, R., Popović, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090(2015).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li>
<li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li>
<li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883(2017).</li>
<li>Campàs, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li>
<li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li>
<li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512(2012).</li>
<li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+theoretical+biology%22%5BJournal%5D)">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li>
<li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellFIT%3A+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116(2014).</li>
<li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7919782">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li>
<li>Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li>
<li>Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342(2014).</li>
<li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li>
<li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila%22%5BJournal%5D)">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מלקחיים אופטיים מאפשרים לבצע מדידות מכניות מוחלטת ישירות בתוך האפיתל מתחלקים המתפתח בצורה לא פולשנית. במובן הזה, הוא מציג יתרונות על פני שיטות אחרות כגון אבלציה לייזר, אשר הינם פולשניים, לספק יחסי מדידות, כוחות מגנטיים, אשר דורשים זריקות, או להכריח היסק, אשר נשענת על הנחות חזק גם לספק יחסי מדידות.
הפרוטוקול כולל כמה שלבים קריטיים. ראשית, כפי העדשה המטרה עשוי להציג סטיות כרומטי ודוחפת את המלכודת לייזר האובייקט "במורד. הנהר", זה חשוב לבדוק כי הלייזר האינפרא-אדום מלכודות החרוז בתוך המטוס הדמיה, ו...

התפתחות הוא תהליך מאוד לשחזור במהלכו תאים ורקמות לעוות לעצב את החיה לעתיד. דפורמציות כזה הוכחו דורשים הדור פעיל של כוחות ב ברמה1,תא2. כדי להבין תהליכים morphogenetic במהלכו תאים ורקמות לשנות את צורתם, לכן זה מפתח כדי להעריך את התכונות המכאניות של התאים המעורבים, וכדי למדוד את הכוחות בתוך רקמת במהלך תהליך3,4 . שכבות אפיתל, בפרט דרוזופילה, נחקרו באופן נרחב עקב הגיאומטריה קוואזי-2D שלהם וכדי שלהם טיפול קל.
מספר טכניקות ולכן פותחו על ידי, ואחרים כדי להעריך מכניקה אפיתל ויוו במהלך הפיתוח. אני אתן סקירה מהירה של שלושת הטכניקות העיקריות בשימוש ברקמות האפיתל. אבלציה לייזר, שיטה בשימוש נרחב, מאפשרת לחשוף את הלחץ מכני מקומי ברמת התא צמתי5,6,7,8 או גדולים בקנה מידה9,10,11 על-ידי ביצוע חתכים המקומי לשבש את תקינות מכנית של המטרה. הדינמיקה של הפתח בעקבות החתך מספק מידע על אבלציה מוקדמת מתח, וגם על rheology של12,רקמת13. החיסרון של אבלציה לייזר היא שזה פולשני, כפי שהוא דורש שיבוש קליפת תא מקומיים. לפיכך, אחת ניתן לבצע רק מספר מוגבל של ablations אם אדם רוצה לשמר את שלמות רקמות. חיסרון נוסף הוא כי ablations מספקים רק הערכות היחסי של מתח התא באנשי קשר, מאז פתיחת המהירות תלויה חיכוך צמיגה, אשר בדרך כלל אינו ידוע. מניפולציה מגנטי גם פותחה, בשימוש דרוזופילה, המערבים את השימוש ferrofluids14 או ליפוזומים ultramagnetic15. הם יכולים לספק מדידות מוחלטת16,17, אבל הם גם פולשני במובן שהן דורשות ההזרקה של הגששים-המיקום הרצוי. זה יכול להיות מסובך מאוד תלוי במערכת, וזה לא תמיד לבצע זריקות מדויקות. טכניקה שלישית, לחלוטין לא פולשנית, היא כוח היסק18,19,20. כוח היסק מסתמך על ההנחה של שיווי משקל מכני בנקודות טריפל (tricellular צמתים או קודקודים), מאפשר להסיק המתחים בכלל תא-תא אנשי קשר (ואולי, לחצים בכל תאי) על ידי פתירת בעיית ההופכי. מתחים, כל קודקוד מספק שתי משוואות (X ו- Y). זה מניב מערכת גדולה של משוואות לינאריות, אשר יכולה להיות הפוכה בתנאים מסוימים כדי להעריך את המתח על כל אנשי הקשר של התא. אמנם שיטה זו מושכת מאוד, כפי שהיא דורשת רק תמונה מקוטעת, לא ניסוי נוסף או את תוכנית ההתקנה, רמת הדיוק שלה היא עדיין לקבוע, שוב זה רק מספק ערכים יחסיים, אלא אם כן מתבצעת מדידה כיול מוחלטת.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, נסקור במאמר זה כיוונון של פינצטה אופטית מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון להחלת כוחות מבוקרת המידה תא ב האפיתל מתחלקים של melanogaster דרוזופילה. מלקחיים אופטיים שימשו עבור יישומים ביולוגיים רבים, כולל את המידות על חלבונים יחיד ומניפולציה של organelles ותאים21. כאן, אנחנו מדווחים כוחות יישומית בטווח של כמה עשרות pN, אשר קטן עדיין מספיק כדי לגרום העיוותים המקומיים אנשי תא ולבצע מדידות מכניות ויוו. בדרך כלל, אנו משתמשים הסטה אנכית של אנשי קשר תא, פיקוח באמצעות הניתוח של kymographs, להתייחס כוח דפורמציה. חשוב, ההתקנה שלנו לא דורשת ההזרקה של החרוזים על המיקום הרצוי בתוך הרקמה, כפי מלקחיים אופטיים מסוגלים להפעיל כוחות על התא-תא אנשי קשר ישירות. זיווג מלקחיים אופטיים כדי מיקרוסקופ אור גיליון מאפשרת לבצע הדמיה מהירה (מספר פריימים לשניה), וזה ניכר מאוד עבור ניתוח מכני-פרקי זמן קצרים, ועם phototoxicity מופחת, מאז איור מדגם הוא מוגבל למישור הדמיה22.
פינצטה אופטית, הכולל, הם דרך לא פולשנית כדי להחיל כוחות מבוקרת תא באנשי קשר ויוו ב העובר דרוזופילה , וכדי לחלץ מידע מכני כגון נוקשות ועל מתח התא אנשי קשר23, מאפייני rheological 24, ואת הדרגה או מתח23. בנוגע למקורו.

<table><tbody><tr><td>לייזר סיבי Ytterbium LP, 10 W, CW</td><td>IPG לייזר</td><td>YLM-10-LP-SC</td><td>כולל קולימטור LP: קרן D = 1.6 מ"מ ולייזר מדריך אדום</td></tr> <tr><td>ואוסלאש; תריס קרן אופטי 1/2 אינץ'</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>מערכות גלוונומטר בקוטר קרן קטן</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>1 לתזוזה X, 1 לתזוזה Y</td></tr><tr><td>מערכת Galvo 1D או 2D ספק כוח ליניארי</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>גלוונומטרים ספק כוח</td></tr><tr><td>2 עדשות f = 30 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>טלסקופ ממסר</td><td>LB1757-B</td> בין 2 גלבה</tr><tr><td>עדשה f = 200 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2.5X עדשת טלסקופ</td></tr><tr><td>f = 500 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2.5X טלסקופ</td></tr><tr><td>זווית ישרה תושבת מראה אליפטית קינמטית עם חורי מוט כלוב עם חורי מוט כלוב עם הקשה</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td><td>פריסקופ</td></tr><tr><td>משקפי בטיחות לייזר, עדשות ירוקות בהירות, 59% העברת אור נראה, Thorlabs בסגנון אוניברסלי</td><td></td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; AOI, קוטר 50.0 מ"מ, מראה חמה</td><td>אופטיקה אדמונד</td> <td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton-Emitter HC 750 / S</td><td>AHF</td><td>HC 750 / SP</td><td></td></tr><tr><td>CompactDAQ שלדה</td><td>National Instruments</td><td>cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>C Series מודול פלט מתח</td> מכשירים <td>לאומיים</td><td>NI-9263</td><td>מודול פלט אנלוגי</td></tr><tr><td>מסדרת C מודול כניסת מתח</td><td>מכשירים לאומיים</td><td>NI-9215</td><td>מודול קלט אנלוגי</td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 ומיקרו; m, פלואורסצנט אדום (580/605), 2% מוצקים</td><td>חרוזי כיול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td></tr> C<tr><td>++ (Qt) תוכנת</td><td></td><td></td> פינצטה אופטית תוצרת בית <td>שפותחה על ידי אוליבייה בלאן וקלייר צ'ארד. פתרון חלופי: labview</td></tr></tbody></table>

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

מורפוגנזה דורשת תיאום בין המתבנת גנטי וכוחות מכני robustly לעצב את תאים ורקמות. ומכאן, אתגר להבין תהליכים morphogenetic הוא למדוד ישירות כוחות הסלולר לבין תכונות מכניות ויוו במהלך מופרה. כאן, אנו מציגים את כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, המאפשר ליישם ישירות כוחות על אנשי קשר תאים תאים של העובר דרוזופילה מוקדם, תוך כדי הדמיית במהירות של מספר פריימים לשניה. טכניקה זו יש יתרון כי הוא אינו דורש ההזרקה של חרוזים לתוך העובר, בדרך כלל נעשה שימוש הגששים ביניים שבו כוחות אופטי הם המופעל. אנחנו מפרטים שלב אחר שלב המימוש של ההתקנה, ולהציע כלים כדי לחלץ מידע מכני של הניסויים. על ידי ניטור של displacements של תא-תא אנשי הקשר בזמן אמת, אחד יכול לבצע מדידות מתח ולחקור rheology של אנשי הקשר של התא.

איור 5 מציג נתונים ניסיוני מתקבל על ידי הטלת תנועה sinusoidal למלכודת. ההשמנה מייצרת אפשרות סטיה של הממשק, למשל, הצילומים 3 מציג ממשק רצופים 3 עמדות (איור 5A)23. סרטים מוקלטים משמשים כדי ליצור את kymograph (איור 5B), עוד ניתוח כדי לקבוע המיקום של הממשק עם רזולוציה subpixel, שימוש של Gaussian להתאים לאורך כיוון x לכל מסגרת. המשטר של העיוותים קטן, העמדות מלכודת וממשק הם יחסיים (...

אנו מציגים כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, ואת יישומו כדי לחקור מכניקה תא בלי חרוזים ב העובר דרוזופילה .

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במכניקת רקמות כגון כיצד תכונות של מגעים תאים לשנות במרחב ובזמן במהלך morphogenesis רקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פולשנית חלשה והיא תואמת הדמיה חיה כגון מיקרוסקופיה של יריעות אור. טכניקה זו אינה דורשת הזרקה של חרוזים לרקמה.בדרך כלל משמש כבדיקות demiere שבו כדי לקבל froses, אני מתרגש. הדגמת התהליך תהיה Chardes, מהנדס, ורפאל קלמנט, מדען מחקר מרמת השטח שלי. כדי להתחיל, להגדיר מיקרוסקופ זקוף עבור מיקרוסקופ יריעות אור במישור האופקי, ולאחר מכן להכין את הלייזר ואת האופטיקה לפעול כמו פינצטה אופטית.לאחר מכן, יש לצנרת מיקרו-ליטר אחד של 500 חרוזי ננואורסצנט אל קובט זכוכית, ולהוסיף 10 מיליליטר של מים מזוקקים. מניחים את ה- cuvette במחזיק ה- cuvette תחת המטרה, ומתאימים את מוקד המטרה כך שהמטרה נוגעת במשטח המים. עכשיו, לפתוח את סביבת פיתוח משולבת QT הבורא אשר משמש כדי לשלוט בתוכנת הרכישה.פתח את תוכנת הרכישה, על ידי פתיחת microRheo. והפעיל את מצב הרכישה החיה, על-ידי בחירה בשידור חי. לפני החלפת הלייזר, לשים על משקפי בטיחות, ולאחר מכן, להתאים את כוח הלייזר לוואט אחד, ולהדליק את הלייזר.ההזנה החיה אמורה להראות עכשיו חרוז לכוד במוקד הלייזר. במידת הצורך, התאימו את מיקום עדשת הטלסקופ השנייה, כדי לצפות בקדושה בפוקוס. ייתכן גם שיהיה צורך להתאים את הזווית של

probing-cell-mechanics-with-bead-free-optical-tweezers-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה...

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS)...

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

העדר כלים למדידת תכונות החומר, הפרמטרים tensional ויוו מונע אימות התפקידים שלהם במהלך הפיתוח. אנחנו מועסקים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומעקב nanoparticle לכמת תכונות מכניות על התא חלמון העובר תקין דג זברה במהלך epiboly. שיטות אלה הינם אמינים החלים נרחב הימנעות התערבויות פולשניות.

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

התכווצות אקטומיוזין ממלאת תפקיד חשוב במורפוגנזה של תאים ורקמות. עם זאת, זה מאתגר לתפעל התכווצות actomyosin in vivo בחריפות. פרוטוקול זה מתאר מערכת אופטוגנטית המעכבת במהירות את התכווצות האקטומיוזין בתיווך Rho1 בעוברי דרוזופילה , וחושפת את האובדן המיידי של מתח אפיתל לאחר השבתת אקטומיוזין in vivo.

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

למד מדידת כוחות תאיים ומכניקת רקמות בזמן אמת בעוברי Drosophila באמצעות מלקחיים אופטיים ללא חרוזים בשילוב מיקרוסקופיית light sheet. שיטה זו מאפשרת ניתוח ראולוגי מינימלי פולשני של מגעים בין תאים במהלך מורפוגנזה.

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים