התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על חלבוני קרום אינטגרליים כגון המצב האוליגומרי, גודלם, הצורה הכוללת ומבנה ברזולוציה נמוכה בפתרון. מחקרי פתרון של חלבוני קרום דורשים ייצוב מולקולות כמו חומרי ניקוי. לטכניקה זו יש יתרון שהיא הופכת חומרי ניקוי לבלתי נראים ומדגישה את האות מחלבון הממברנה.

ההשלכות של טכניקה זו להרחיב שאלות מחקר ביולוגי ורפואי רבים כי מעל 1/3 של חלבונים שוכנים ממברנות שבו הם מבצעים פונקציות תאיות חיוניות רבות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו תיוג deuterium וצעדי פיזור נויטרונים קשה ללמוד כי מעט מאוד מוסדות מציעים הכשרה בטכניקות אלה. כדי להתחיל, לקבוע צפיפות אורך פיזור נויטרונים או SLDs באמצעות יישום האינטרנט MULCh, מודולים לניתוח של נתוני וריאציית ניגודיות.

פתח את מודול החדות על-ידי לחיצה על חדות הממוקמת בחלונית הניווט הימנית. ספק טקסט עבור כותרת פרוייקט והזן את הפרטים שלהלן עבור שני רכיבים כיוניית משנה אחת וכותרת משנה שתיים. הזן את הנוסחה המולקולרית עבור כל רכיב בתיבת הטקסט של הנוסחה.

לאחר מכן הזן את אמצעי האחסון באנגסטרום מעוקב עבור כל רכיב בתיבה שמתחת לאמצעי האחסון. לבסוף, הזן את הפרטים עבור רכיבי מאגר. לחץ על שלח כדי לבצע את חישובי ניגודיות הנייטרונים.

נוצר דף תוצאות המספק טבלה של צפיפות אורך פיזור ונקודות התאמה של ניגודיות וכן נוסחה לקביעת פרמטרים אלה בכל אחוז נתון של D2O במאגר. סקור את הפרמטרים המתפזרים עם תשומת לב מיוחדת לנקודות ההתאמה של ניגודיות הרכיבים. לגדל תאי E.coli מחסה וקטור ביטוי בלתי ניתן לחיסון עבור רצף חלבון היעד במדיום LB לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר או OD 600 של אחד בקירוב.

להתאים תאי E.coli כדי deuterium שכותרתו בינוני לפני קנה המידה עבור ביטוי יתר של חלבון deuterated על ידי דילול תרבות LB אחד עד 20 בשלושה מיליליטר של מדיום מינימלי. לאחר גידול OD 600 של אחד בקירוב, חזור על אחד עד 20 דילולים באמצעות מדיום מינימלי המכיל 50, 75, ו 100%D2O. לאחר הסתגלות, להמשיך לגדל את התרבות ב bioreactor כדי להגדיל את התשואה של מסת תאים deuterated.

ככל שתוכן ה-D2O יגדל, שיעורי הצמיחה יירדו. המשך לקצור, lyse ולטהר תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הבא לצייד עמודת אי-הכללת גודל עם יותר משני נפחי עמודות של מאגר החלפה סופי באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה.

לאחר הזרקת המדגם, הפעל את העמודה בשברים מבודדים המתאימים לחלבון המעניין. שמור aliquot של מאגר תואם עבור פיזור נויטרונים בזווית קטנה או חיסור רקע SANS. כדי לאסוף נתוני SANS, טען תחילה דגימות ומאגרים בתאי קוורץ.

לאחר הבטחת סגירת תריס הקרן, התקרבו לאזור הסביבה לדוגמה והצבו את תאי הקוורץ במחליף הדגימה. רשום את מיקום המחליף לדוגמה עבור כל תא לדוגמה. בדוק את האזור וודא כי נתיב הקרן נקי מחסימה לפני שתעזוב את אזור הסביבה לדוגמה.

ואז לפתוח את תריס הקרן. ביצוע סריקת טבלה עבור איסוף נתונים אוטומטי. בצע את ההוראות לפעולת מכשיר המסופק על ידי מדען פיזור נויטרונים.

השתמש בתוכנת Mantid Plot ובקובץ Script של Python להפחתת נתוני SANS מתדמית דו-מימדית להתוויה חד-מימדית. לשם כך, היכנס לאשכול הניתוח המרוחק והבצע את העלילה של Mantid מתוך שורת הפקודה. לאחר מכן פתח את קובץ ה- Script של הפחתת המשתמש שסופק והצב את מספרי הסריקה או הזיהוי המתאימים עבור הדוגמה בזוגות מאגרים ברשימה המתאימה.

בצע את קובץ ה- Script כדי ליצור נתונים מופחתים כקובץ טקסט בן ארבע עמודות במיקום שצוין. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מרחב העבודה המתאים ועל העלילה של Mantid ובחר התוויה עם שגיאות לבדיקה ראשונית של הפרופילים המתפזרים. הורד את חבילת התוכנה של ATSAS ולהשתמש PRIMUS עבור התוויית נתונים, שינוי קנה מידה של מאגר וחיסור וניתוח Guinier.

הפעל את היישום ATSAS, יישום ניתוח נתונים SAS וטען את קבצי הנתונים המופחתים המתאימים לצמד הדוגמה והמאגר. כדי לשנות את קנה המידה של המאגר כראוי, בחר את טווח הנתונים ב- Q גבוה שבו שני הפרופילים דומים בדירה ולחץ על לחצן קנה המידה הממוקם תחת הכרטיסיה פעולות. הגדל את טווח הנתונים כדי להציג את כל הנקודות, לחץ על הפחת כדי לבצע פעולה זו.

בצע ניתוח Guinier של המאגר חיסור נתונים לדוגמה באמצעות הכרטיסיה ניתוח של יישום ניתוח נתונים SAS. ודא שהקובץ המתאים נבחר ברשימה ולחץ על רדיוס של gyration. ניסיון אוטומטי לבצע התאמה Guinier יסופקו על ידי לחיצה על כפתור RG אוטומטי.

הרחב את טווח הנתונים המשמשים לכלול את כל נתוני Q הנמוכים והתחל לצמצם את טווח הנתונים על-ידי לקיחת נקודות Q גבוהות עד שמגבלת ה- Q max times RG נמוכה מ- 1.3. השתמש בהתוויה של שאריות כדי לוודא שהנתונים הם ליניאריים בטווח מתאים. בצע התאמות קטנות באזור ההתאמה ונטר את הרגישות של ערכים אלה לטווח הנתונים המשמשים להתאמה.

השג את פונקציית התפלגות ההסתברות P של R בגמד. כעת הפעל את אשף הפצת המרחקים בכרטיסיה ניתוח. קבלת התאמה טובה לנתונים חיונית להשגת מודל איכותי.

לקבוע Dmax, המרחק הבין אטומי המרבי בתוך המולקולה. הערכת ערך עבור Dmax על-ידי ביטול הסימון של התיבה כדי לכפות Rmax שווה לאפס והזנת ערך גדול עבור Dmax. יירוט X הראשון בעלילה של P של R מניב הערכה זו.

בצע שינויים מצטברים בערך Dmax זה, כמו גם בטווח הנתונים המשמשים עבור מספר הנקודות המשמשות למיטוב התאמה שלgnome לנתונים ועקומת P של R המתקבלת. הפעל את אשף הצורות של PRIMUS מלחצן dammif בכרטיסיה ניתוח נתוני SAS ולהשתמש בבחירה ידנית של פרמטרים. הגדר את טווח Guinier מההתקף והמשך לשלב הבא באמצעות לחצני הניווט.

הגדר ערכי התאמה מהתוויה P of R והמשך לשלב הבא. ספק פרמטרים עבור תהליך מידול ab initio. לאחר מכן הפעל את התהליך באמצעות לחצן Commit.

שכבת-על ו-superimpose המעטפה הסופית sans עם מודל קשור ברזולוציה גבוהה באמצעות supcomb בתוך ATSAS. מקם עותק של מודל PDB ברזולוציה גבוהה כך שיתאים למעטפת SANS בספריית העבודה. לאחר מכן בצעו supcomb ממשרת הפקודה באמצעות שמות הקבצים PDB כשני ארגומנטים כאשר מבנה התבנית רשום תחילה.

לבסוף לדמיין את תוצאות מודל ab initio באמצעות PyMOL, תוכנית צפייה בגרפיקה מולקולרית 3D. לאחר מעטפת SANS ומבנה ברזולוציה גבוהה כבר עלו, מודלים אלה ניתן לדמיין באמצעות כל תוכנית צפייה בגרפיקה מולקולרית. מוצגת סקירה כללית של תהליך הפריט החזותי של PyMOL.

לאחר שקבצי מבנה PDB נפתחו ב- PyMOL, הדגמים צריכים להיות גלויים בחלון מציג PyMOL. ניתן לשנות את הייצוגים של כל דגם באמצעות לחצן S לצד כל שם קובץ. כאן משמש ייצוג משטח עבור מעטפת SANS וייצוג קריקטורה משמש עבור עמוד השדרה של החלבון של מודל ברזולוציה גבוהה.

ניתן לבחור ערכת צבעים מתאימה מתוך האפשרויות הזמינות תחת לחצן C. עבור שרשראות חלבון, צביעה קשת שרשרת מספק שיפוע צבע מ N כדי C שליחות כדי לסייע בפרשנות. שקיפות מוחלת על ייצוג פני השטח כדי לאפשר הדמיה טובה יותר של מבנה החלבון בתוך המעטפה.

עבור תמונות פרסום, מומלץ להשתמש ברקע לבן. לאחר החלת רמזי הדמיה אלה, ניתן לבחון את המבנים תלת-מימדיים על-ידי לחיצה וגרירה של המבנה. מניפולציות של פרספקטיבה סיבוב מולקולה ותרגום יכול להתבצע.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להתאים במדויק את הניגוד נויטרונים של קבוצות ראש וזנב דטרגנט עם ממס D2O H2O. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחקר המבנה של פרוטאזות אספרטו תוך-ממברן. חלבונים אלה מעורבים בתגובה החיסונית, הפטיטיס C ואלצהיימר המחלה.

אל תשכחו שעבודה במעבדות ביוכימיות ובמתקנים של קרן נויטרונים עלולה להיות מסוכנת. אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי וביצוע כל כללי הבטיחות במתקן ופרסומים רדיולוגיים הם חובה בעת ביצוע הליך זה.