ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון
August 6th, 2018
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בהרכבה הדינמית של קומפלקסי חלבונים בסביבות pH שונות באמצעות אינטרפרומטריית שכבות ביולוגיות ולאשר את הרכיבים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים וספקטרומטריית מסה. זיהוי והבנת הספציפיות השולטת בהיווצרות והרכבה של קומפלקס חלבונים מעניינת מאוד חוקרים ביוכימיים. המתודולוגיה שעליה אנו מדברים היום מאפשרת לחוקרים להרכיב, לדמיין ולאמת קומפלקסים מקרומולקולריים חזויים.
האופי המורכב של משטח החיישן הביולוגי מאפשר לחוקרים לשחרר בקלות קומפלקסים מורכבים למיקרו-נפחים קטנים לצורך מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח ספקטרומטריית מסה. בהדגמה זו, עקבנו אחר הקינטיקה של סידורים מבניים המושרים על ידי pH של קומפלקס רעלן האנתרקס ואימתנו את הסידורים מחדש הללו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים ושיטות ספקטרומטריית מסה, כל זאת תוך הימנעות מצבירה. ידגימו את מכלול רעלן האנתרקס על פני החיישן הביולוגי של BLI, שחרור דגימות מאקרו ונהלי צביעה שליליים EM יהיו אלכסנדרה מאצ'ן ופירס אוניל, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי.
ד"ר אנטוניו ארטיגס מסייע בניתוח וזיהוי המיקרו-דגימות המשוחררות על ידי BLI, באמצעות ספקטרומטר המסה Orbitrap Fusion Lumos. כדי להתחיל, יש להרטיב את קצה החיישן הביולוגי BLI מהדור השני על ידי טבילתו ב-250 מיקרוליטר מים ולדגור אותו למשך 10 דקות. בתוכנת Blitz, תכנת את זמני השלבים כמפורט בטבלה זו.
התחילו את ריצת ה-BLI על ידי טבילת קצה החיישן הביולוגי ב-250 מיקרוליטר מים למשך 30 שניות כדי למדוד קו בסיס ראשוני של עובי וצפיפות החיישן הביולוגי. לאחר מכן, הפעל את החיישן הביולוגי על ידי טבילת הקצה לתוך 250 מיליליטר של 50 מילי-מולרי NHS ו-200 מילי-מולרי EDC למשך שבע דקות. לאחר מכן, טבלו את החיישן הביולוגי המופעל ב-50 מילי-מולרי PDEA מומס במאגר בוראט 0.1 מולרי, pH 8.5, למשך חמש דקות כדי ליצור משטח ביו-ריאקטיבי מופעל.
כעת, טבלו את החיישן הביולוגי הביו-ריאקטיבי המופעל ב-250 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 100 ננו-מולרית E126C LFn ב-10 מילי-מולר נתרן אצטט pH חמש, 100 מילי-טוחנות נתרן כלוריד בופר למשך חמש דקות. טבלו את קצה ה-LFn ב-50 מילי-מולרי L-ציסטאין, 1 נתרן כלורי מולרי, 0.1 נתרן אצטט מולרי pH חמש למשך ארבע דקות כדי להרוות את כל הקבוצות התגובתיות החופשיות שנותרו בתיול. לאחר טבילת קצה ה-LFn המרווה ב-50 מילי-מולרי נתרן כלורי, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי כדי לבסס את קו הבסיס של החיץ, טבלו את הקצה ב-0.5 מיקרו-מולרי אנטיגן מגן, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי למשך חמש דקות ליצירת קומפלקס LFn PA-prepore.
לאחר שיוך PA-prepore, הסר את הקצה מתמיסת PA-prepore וטבל את הקצה ב-50 מילי-מולרי Tris, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי למשך 30 שניות כדי לשטוף כל PA-prepore שאינו קשור במיוחד. טבלו את קומפלקס LFn PA-prepore לתוך 0.5 מיקרו-מולרי CMG2 ב-50 מילי-מולרי נתרן כלורי, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי למשך חמש דקות. טבלו את קומפלקס LFn PA-prepore CMG2 לתוך 50 מילי-מולרי Tris, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי למשך 30 שניות כדי לשטוף כל CMG2 לא קשור ליצירת קומפלקס קדם-אנדוזומי.
לניתוח EM, שחרר את קומפלקס LFn PA-prepore CMG2 מקצה החיישן הביולוגי על ידי טבילת הקצה לתוך צינור PCR המכיל חמישה מיקרוליטרים של 50 מילי-מולרי DTT, 50 מילי-מולרי טריס ו-50 מילי-מולרי נתרן כלורי. לניתוח טנדם MS של הפפטידים מהקומפלקס, שחרר את קומפלקס LFn PA-prepore CMG2 מקצה החיישן הביולוגי על ידי טבילת החיישן הביולוגי בצינור PCR המכיל חמישה מיקרוליטרים של 50 מילי-מולרי DTT, שישה גואנידין הידרוכלוריד נטול קרטין ו-25 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט, pH שמונה. כדי להציג את הקומפלקס לאחר מעבר pH, הרכיבו את קומפלקס LFn PA-prepore CMG2 על החיישן הביולוגי, כפי שהודגם זה עתה.
טבלו את קצה החיישן הביולוגי לתוך pH אצטט של 10 מילי-מולרי חמש למשך חמש דקות כדי להתחיל את המעבר של ה-PA-prepore לנקבוביות PA. מעבר זה מסומן על ידי הגדלת המשרעת, ואחריה ירידה גדולה יותר במשרעת המשוערת כמשמעותית עבור דיסוציאציה מלאה של קולטן עקב זיקה קשירה מופחתת. לניתוח EM, טבלו את קצה החיישן הביולוגי בתמיסה המכילה 1.25 מילי-מולרי מיצלות למשך חמש דקות, כדי למנוע צבירה בתמיסה לאחר שחרור דיסולפיד.
כדי לבצע מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי, התחל בפריקת רשת נחושת מצופה פחמן 300 בלחץ אטמוספירה יציב של 0.38 מיליבר ומינוס 15 מיליאמפר למשך 20 שניות, ולאחר מכן אוורר את המכשיר באוויר. אבטח את הרשת בין זוג פינצטה נקייה. לאחר מכן פיפטה ארבעה מיקרוליטרים של דגימה מורכבת משוחררת על הרשת ואפשרו ספיחה למשך 60 שניות.
בעזרת טריז נייר פילטר, נדפו את הנוזל שנותר. לאחר מכן הכתים את הרשת על ידי פיפטינג של חמישה מיקרוליטרים של 0.75% נקודה אפס שני מיקרון פורמט אורניל מסוננים עליה ולאחר חמש שניות, נדפו את הכתם העודף. הניחו לרשת להתייבש בטמפרטורת החדר כשהיא מכוסה.
לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ אלקטרוני ההולכה כדי להציג את הדגימה. לבסוף, לאחר הכנת דגימות לספקטרומטריית מסה על פי פרוטוקול הטקסט, הפעל את ספקטרומטר המסה באמצעות CID ואנרגיית התנגשות מנורמלת של 35 תחת בקרה אוטומטית כדי לבצע ברציפות סריקת MS אחת, ואחריה כמה שיותר סריקות MS-MS טנדם בפרק זמן של שלוש שניות. עקבת הסנסוגרמה של BLI היא קריאה בזמן אמת של שינויי המשרעת עקב התוספת הספציפית של רכיבי רעלן האנתרקס.
העלייה הראשונה היא טעינת LFn על הקצה. לאחר המרווה וקו הבסיס, PA-prepore נקשר ל-LFn, ואחריו תוספת של CMG2 מסיס, וכתוצאה מכך הקומפלקס הקדם-אנדוזומי המורכב. לאחר מכן הקומפלקס נתון ל-pH נמוך שמחליש את קשירת הקולטן ומביא למעבר הנקבוביות המורחבות לאישור הנקבוביות המורחב שלו המאושר על ידי תוספת מיצלות.
מוצגות כאן תמונות EM של כתמים שליליים של קומפלקסים עם שחרורם מהחיישן הביולוגי. רשתות דגימה קדם-אנדוזומליות הראו צפיפות העולה בקנה אחד עם קומפלקסים משולשים שלמים המורכבים מ-LFn PA-prepore CMG2. רשתות מורכבות לאחר החמצה מראות כי PA עבר לנקבוביות ומסיס על ידי הכללת מיצלה ללא צפיפות CMG2 ברורה.
כפי שנצפה על ידי טרשת נפוצה, שאישרה את קומפלקסי החלבונים, דגימות טרשת נפוצה קדם-אנדוזומליות הכילו פפטידים מכל שלושת מרכיבי הרעלן עם כיסוי של 60.46, 67.97 ו-54.15% עבור LFn, PA ו-CMG2 בהתאמה. דגימות פוסט-אנדוזומליות הכילו רק פפטידים מ-LFn ו-PA. היעדר CMG2 עולה בקנה אחד עם הירידה הנצפית ב-BLI ננומטר במהלך היווצרות הנקבוביות. היכולת לנטר ולאמת את ההרכבה של קומפלקסים מקרומולקולריים גדולים היא צעד מכריע להבנת הספציפיות והפונקציונליות של מכלולים ביומולקולריים גדולים.
היכולת שלנו לשחרר קומפלקסים מקרומולקולריים שהורכבו מראש מחיישנים ביולוגיים למיקרו-נפחים להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים תהיה שימושית ביותר לניתוח מבנה. הניתוח שלנו של הרכב קומפלקסי הרכבת החיישנים הביולוגיים השתמש רק ב-0.04 פמטומולות של קומפלקס השחרור כדי לזהות את מרכיביו לפני ואחרי החמצה אנדוזומלית מוטמעת. ניתן להתאים את פרוטוקול שחרור הרכבת החיישנים הביולוגיים כדי לעקוב אחר מעברים אנדוזומיים טבעיים אך חמקמקים המושרים על ידי pH של רעלני חיידקים אחרים במבני חלבון ויראליים, עם הבונוס הנוסף של הימנעות מצבירת חלבונים.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לניטור הרכבה ופירוק של רעלן האנתרקס באמצעות ביולוגיה בין-רובדית (BLI). המתודולוגיה מאפשרת ויזואליזציה וזיהוי של מתחמי חלבון באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים וספקטרומטריית מסה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מבנית
- דינמיקה של חלבונים
רקע
- הבנת היווצרות מתחמי חלבון היא חיונית למחקר ביוכימי.
- ביולוגיה בין-רובדית מספקת פלטפורמה לתצפית בזמן אמת של אינטראקציות חלבונים.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים וספקטרומטריית מסה חיוניים לאישור מבנים מורכבים.
- רעלן האנתרקס משמש כמודל לחקר דינמיקת הרכבת חלבונים.
מטרת המחקר
- לצפות בהרכבה הדינמית של מתחמי חלבונים בתנאי pH משתנים.
- לאשר את רכיבי מתחם רעלן האנתרקס באמצעות טכניקות הדמיה מתקדמות.
- לשפר את ההבנה של הספציפיות בהיווצרות מתחמי חלבונים.
שיטות בשימוש
- ביולוגיה בין-רובדית לניטור קינטיקה של הרכבה/פירוק.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים לויזואליזציה של מתחמי חלבונים.
- ספקטרומטריית מסה לזיהוי רכיבי מתחם.
- סביבות pH מבוקרות לחקר סידורים מחדש מבניים.
תוצאות עיקריות
- הוכחה להרכבה מוצלחת של מתחם רעלן האנתרקס.
- הושגה ניטור בזמן אמת של מעברים מבניים.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים אישרה את שלמות המבנה של המתחמים המשוחררים.
- ספקטרומטריית מסה סיפקה זיהוי מפורט של רכיבי המתחם.
מסקנות
- הפרוטוקול מנטר באופן יעיל את הדינמיקה של מתחמי חלבונים.
- שילוב של BLI עם EM ו-MS מציע ניתוח מקיף של אינטראקציות חלבונים.
- מתודולוגיה זו ניתנת ליישום על מתחמי חלבונים אחרים למחקרים דומים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables real-time monitoring of pH-induced protein complex assembly and disassembly, providing critical insights into target validation and mechanistic de-risking for toxin-based therapeutic development. By combining label-free BLI with EM and MS, it supports predictive confidence in early discovery by confirming complex identity and structural transitions under disease-relevant conditions. The approach addresses a key discovery inflection point: verifying that predicted macromolecular interactions occur with correct stoichiometry and environmental responsiveness before advancing to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by validating the assembly of specific protein complexes under controlled pH conditions that mimic endosomal environments.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of binding kinetics and complex stability, reducing mechanistic ambiguity in toxin-receptor interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming whether toxin components engage receptors with expected affinity shifts upon acidification, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by releasing defined complexes into microliter volumes suitable for structural and compositional analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sequential, easy-to-replicate procedures that yield quantifiable BLI sensogram traces correlating with complex formation.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse, as the BLI biosensor surface can be regenerated and reused for multiple rounds of complex assembly and release.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by modeling anthrax toxin endosomal transition, a mechanism applicable to other bacterial toxins and viral entry proteins.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural and compositional verification of complexes before and after pH transition.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by using EM and MS to confirm complex identity and receptor dissociation, reducing false positives in downstream assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through real-time complex monitoring.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by allowing researchers to assemble, visualize, and validate predicted macromolecular complexes in a controlled, label-free format.
- Screening: Describes assay readiness through the release of assembled complexes into microvolumes for EM and MS analysis, ensuring reproducibility and quantitative output.
- Analytics: Highlights measurements such as BLI amplitude changes, EM density patterns, and MS peptide coverage (e.g., 60.46% for LFn, 67.97% for PA, 54.15% for CMG2 in pre-endosomal complexes) that enable teams to compare conditions and confirm complex integrity.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by confirming structural transitions (e.g., prepore to pore) and compositional changes (e.g., loss of CMG2 signal post-acidification) that mirror endosomal events.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability, noting that the BLI biosensor surface can be regenerated and the release protocol adapted to other pH-sensitive protein systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein complex formation, and confirmation of structural dynamics under disease-relevant conditions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of complex assembly and release procedures across runs and laboratories.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency through early de-risking, and reduced late-stage biological failure by validating complex behavior before investment.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on confirmed complex assembly, pH responsiveness, and component identity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biolayer interferometry, protein labeling and coupling, and interpretation of real-time binding kinetics.
- Dependent on instrumentation including BLI systems, transmission electron microscopes, and high-resolution mass spectrometers (e.g., Orbitrap Fusion Lumos).
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, pH shift timing, and release protocols to ensure consistent complex recovery for EM and MS.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other model systems, particularly regarding biosensor surface chemistry and stability of complexes under acidic or micelle-containing conditions.
- Includes practical limitations such as the need to prevent aggregation post-release (addressed by micelle inclusion) and the requirement for sufficient complex stability during transfer to analysis platforms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:28
Assembly of Prepore Anthrax Toxin Complex on a PDEA-modified Amine Reactive Biosensor Surface
4:37
Assembly of Pore Anthrax Toxin Complex on PDEA-modified Amine Reactive Biosensor Surface
5:26
Identification of Released Macromolecular Assemblies from BLI Biosensors by Negative Stain Electron Microscopy and Mass Spectrometry
6:50
Results: Analysis of Dynamic Protein Complexes by Biolayer Interferometry, Electron Microscopy, and Mass Spectrometry
8:29
Conclusion
