ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בהרכבה הדינמית של קומפלקסי חלבונים בסביבות pH שונות באמצעות אינטרפרומטריית שכבות ביולוגיות ולאשר את הרכיבים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים וספקטרומטריית מסה. זיהוי והבנת הספציפיות השולטת בהיווצרות והרכבה של קומפלקס חלבונים מעניינת מאוד חוקרים ביוכימיים. המתודולוגיה שעליה אנו מדברים היום מאפשרת לחוקרים להרכיב, לדמיין ולאמת קומפלקסים מקרומולקולריים חזויים.

האופי המורכב של משטח החיישן הביולוגי מאפשר לחוקרים לשחרר בקלות קומפלקסים מורכבים למיקרו-נפחים קטנים לצורך מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח ספקטרומטריית מסה. בהדגמה זו, עקבנו אחר הקינטיקה של סידורים מבניים המושרים על ידי pH של קומפלקס רעלן האנתרקס ואימתנו את הסידורים מחדש הללו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים ושיטות ספקטרומטריית מסה, כל זאת תוך הימנעות מצבירה. ידגימו את מכלול רעלן האנתרקס על פני החיישן הביולוגי של BLI, שחרור דגימות מאקרו ונהלי צביעה שליליים EM יהיו אלכסנדרה מאצ'ן ופירס אוניל, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי.

ד"ר אנטוניו ארטיגס מסייע בניתוח וזיהוי המיקרו-דגימות המשוחררות על ידי BLI, באמצעות ספקטרומטר המסה Orbitrap Fusion Lumos. כדי להתחיל, יש להרטיב את קצה החיישן הביולוגי BLI מהדור השני על ידי טבילתו ב-250 מיקרוליטר מים ולדגור אותו למשך 10 דקות. בתוכנת Blitz, תכנת את זמני השלבים כמפורט בטבלה זו.

התחילו את ריצת ה-BLI על ידי טבילת קצה החיישן הביולוגי ב-250 מיקרוליטר מים למשך 30 שניות כדי למדוד קו בסיס ראשוני של עובי וצפיפות החיישן הביולוגי. לאחר מכן, הפעל את החיישן הביולוגי על ידי טבילת הקצה לתוך 250 מיליליטר של 50 מילי-מולרי NHS ו-200 מילי-מולרי EDC למשך שבע דקות. לאחר מכן, טבלו את החיישן הביולוגי המופעל ב-50 מילי-מולרי PDEA מומס במאגר בוראט 0.1 מולרי, pH 8.5, למשך חמש דקות כדי ליצור משטח ביו-ריאקטיבי מופעל.

כעת, טבלו את החיישן הביולוגי הביו-ריאקטיבי המופעל ב-250 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 100 ננו-מולרית E126C LFn ב-10 מילי-מולר נתרן אצטט pH חמש, 100 מילי-טוחנות נתרן כלוריד בופר למשך חמש דקות. טבלו את קצה ה-LFn ב-50 מילי-מולרי L-ציסטאין, 1 נתרן כלורי מולרי, 0.1 נתרן אצטט מולרי pH חמש למשך ארבע דקות כדי להרוות את כל הקבוצות התגובתיות החופשיות שנותרו בתיול. לאחר טבילת קצה ה-LFn המרווה ב-50 מילי-מולרי נתרן כלורי, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי כדי לבסס את קו הבסיס של החיץ, טבלו את הקצה ב-0.5 מיקרו-מולרי אנטיגן מגן, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי למשך חמש דקות ליצירת קומפלקס LFn PA-prepore.

לאחר שיוך PA-prepore, הסר את הקצה מתמיסת PA-prepore וטבל את הקצה ב-50 מילי-מולרי Tris, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי למשך 30 שניות כדי לשטוף כל PA-prepore שאינו קשור במיוחד. טבלו את קומפלקס LFn PA-prepore לתוך 0.5 מיקרו-מולרי CMG2 ב-50 מילי-מולרי נתרן כלורי, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי למשך חמש דקות. טבלו את קומפלקס LFn PA-prepore CMG2 לתוך 50 מילי-מולרי Tris, 50 מילי-מולרי נתרן כלורי למשך 30 שניות כדי לשטוף כל CMG2 לא קשור ליצירת קומפלקס קדם-אנדוזומי.

לניתוח EM, שחרר את קומפלקס LFn PA-prepore CMG2 מקצה החיישן הביולוגי על ידי טבילת הקצה לתוך צינור PCR המכיל חמישה מיקרוליטרים של 50 מילי-מולרי DTT, 50 מילי-מולרי טריס ו-50 מילי-מולרי נתרן כלורי. לניתוח טנדם MS של הפפטידים מהקומפלקס, שחרר את קומפלקס LFn PA-prepore CMG2 מקצה החיישן הביולוגי על ידי טבילת החיישן הביולוגי בצינור PCR המכיל חמישה מיקרוליטרים של 50 מילי-מולרי DTT, שישה גואנידין הידרוכלוריד נטול קרטין ו-25 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט, pH שמונה. כדי להציג את הקומפלקס לאחר מעבר pH, הרכיבו את קומפלקס LFn PA-prepore CMG2 על החיישן הביולוגי, כפי שהודגם זה עתה.

טבלו את קצה החיישן הביולוגי לתוך pH אצטט של 10 מילי-מולרי חמש למשך חמש דקות כדי להתחיל את המעבר של ה-PA-prepore לנקבוביות PA. מעבר זה מסומן על ידי הגדלת המשרעת, ואחריה ירידה גדולה יותר במשרעת המשוערת כמשמעותית עבור דיסוציאציה מלאה של קולטן עקב זיקה קשירה מופחתת. לניתוח EM, טבלו את קצה החיישן הביולוגי בתמיסה המכילה 1.25 מילי-מולרי מיצלות למשך חמש דקות, כדי למנוע צבירה בתמיסה לאחר שחרור דיסולפיד.

כדי לבצע מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי, התחל בפריקת רשת נחושת מצופה פחמן 300 בלחץ אטמוספירה יציב של 0.38 מיליבר ומינוס 15 מיליאמפר למשך 20 שניות, ולאחר מכן אוורר את המכשיר באוויר. אבטח את הרשת בין זוג פינצטה נקייה. לאחר מכן פיפטה ארבעה מיקרוליטרים של דגימה מורכבת משוחררת על הרשת ואפשרו ספיחה למשך 60 שניות.

בעזרת טריז נייר פילטר, נדפו את הנוזל שנותר. לאחר מכן הכתים את הרשת על ידי פיפטינג של חמישה מיקרוליטרים של 0.75% נקודה אפס שני מיקרון פורמט אורניל מסוננים עליה ולאחר חמש שניות, נדפו את הכתם העודף. הניחו לרשת להתייבש בטמפרטורת החדר כשהיא מכוסה.

לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ אלקטרוני ההולכה כדי להציג את הדגימה. לבסוף, לאחר הכנת דגימות לספקטרומטריית מסה על פי פרוטוקול הטקסט, הפעל את ספקטרומטר המסה באמצעות CID ואנרגיית התנגשות מנורמלת של 35 תחת בקרה אוטומטית כדי לבצע ברציפות סריקת MS אחת, ואחריה כמה שיותר סריקות MS-MS טנדם בפרק זמן של שלוש שניות. עקבת הסנסוגרמה של BLI היא קריאה בזמן אמת של שינויי המשרעת עקב התוספת הספציפית של רכיבי רעלן האנתרקס.

העלייה הראשונה היא טעינת LFn על הקצה. לאחר המרווה וקו הבסיס, PA-prepore נקשר ל-LFn, ואחריו תוספת של CMG2 מסיס, וכתוצאה מכך הקומפלקס הקדם-אנדוזומי המורכב. לאחר מכן הקומפלקס נתון ל-pH נמוך שמחליש את קשירת הקולטן ומביא למעבר הנקבוביות המורחבות לאישור הנקבוביות המורחב שלו המאושר על ידי תוספת מיצלות.

מוצגות כאן תמונות EM של כתמים שליליים של קומפלקסים עם שחרורם מהחיישן הביולוגי. רשתות דגימה קדם-אנדוזומליות הראו צפיפות העולה בקנה אחד עם קומפלקסים משולשים שלמים המורכבים מ-LFn PA-prepore CMG2. רשתות מורכבות לאחר החמצה מראות כי PA עבר לנקבוביות ומסיס על ידי הכללת מיצלה ללא צפיפות CMG2 ברורה.

כפי שנצפה על ידי טרשת נפוצה, שאישרה את קומפלקסי החלבונים, דגימות טרשת נפוצה קדם-אנדוזומליות הכילו פפטידים מכל שלושת מרכיבי הרעלן עם כיסוי של 60.46, 67.97 ו-54.15% עבור LFn, PA ו-CMG2 בהתאמה. דגימות פוסט-אנדוזומליות הכילו רק פפטידים מ-LFn ו-PA. היעדר CMG2 עולה בקנה אחד עם הירידה הנצפית ב-BLI ננומטר במהלך היווצרות הנקבוביות. היכולת לנטר ולאמת את ההרכבה של קומפלקסים מקרומולקולריים גדולים היא צעד מכריע להבנת הספציפיות והפונקציונליות של מכלולים ביומולקולריים גדולים.

היכולת שלנו לשחרר קומפלקסים מקרומולקולריים שהורכבו מראש מחיישנים ביולוגיים למיקרו-נפחים להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים תהיה שימושית ביותר לניתוח מבנה. הניתוח שלנו של הרכב קומפלקסי הרכבת החיישנים הביולוגיים השתמש רק ב-0.04 פמטומולות של קומפלקס השחרור כדי לזהות את מרכיביו לפני ואחרי החמצה אנדוזומלית מוטמעת. ניתן להתאים את פרוטוקול שחרור הרכבת החיישנים הביולוגיים כדי לעקוב אחר מעברים אנדוזומיים טבעיים אך חמקמקים המושרים על ידי pH של רעלני חיידקים אחרים במבני חלבון ויראליים, עם הבונוס הנוסף של הימנעות מצבירת חלבונים.