לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage
10 ביוני 2018
אנו מציגים עבור יעיל בתפזורת, מהירה כימי לדוגמות של תאי גזע pluripotent האנושי שושלת היוחסין-איפה זה מונח קונבנציונאלי (hPSC) לתוך מצב של epiblast דמוי pluripotent יציב epigenomically תמים פרוטוקול. שיטה זו התוצאה ביטוי גנים שושלת היוחסין-איפה זה מונח ירד שיפור ניכר תוך בידול multilineage מכוונת על-פני רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת.
השיטה LIF-3i מחזירה תאים פלוריטפוטנטיים של אדם קונבנציונליים למצב פלוריטפוטנטי פרימיטיבי יותר עם מאפיינים ביוכימיים, תעתיקיים ואפיגנטיים של האפיבלסט האנושי הטרום השתלה. שיטה זו משפרת את הפונקציונליות של תאים פלוריטפוטנטיים של אדם קונבנציונליים על ידי ירידה בביטוי הגנים המופנמים על ידי השושלת ומחיקת השונות הבין-שושלתית של ההתמיינות המכוונת שנצפתה בדרך כלל בין קווי hPSC עצמאיים. באמצעות שיטה זו, תאים פלוריטפוטנטיים של אדם שהושבו כימית שומרים על יציבות קריוטיפית ואפיגנומית לאחר מעבר ממושך, כולל בלוקוסים מודפסים וניתן להבדיל אותם ישירות עם יעילות משופרת ללא צורך בשלב ראשוני.
שיטת LIF-3i תפתח דרכי חקירה חדשות בביולוגיה התפתחותית מוקדמת של האדם ועשויה לקדם את הרפואה ההתחדשתית על ידי שיפור התמיינות תאים פלוריטפוטנטיים של האדם, מיקוד גנים ויצירת כימרות בין-מינים. כדי להתחיל את הפרוטוקול, שמרו והגדלו תאים פלוריטפוטנטיים של אדם קונבנציונליים או hPSCs עם קריוטיפים רגילים מאוחזרים בתרביות משותפות עם פיברובלסט עוברי עכבר או מערכת תרבית מזינה מבוססת MEF או במערכת תרבית ללא מזינים. הכינו MEF מזינים בצלחת שש-בור מגולטינת שהוכנה בעבר לפחות יום אחד לפני מעבר תרבויות hPSC הקונבנציונליות שהותאמו ל-LIF-5i.
לאחר שתרבויות hPSC הקונבנציונליות הגיעו לכ-50% צפיפות, החליפו את מדיום התרבית הסטנדרטי של hESC בשני מיליליטר לכל באר של מדיום Leukemia Inhibitory Factor 5i או LIF-5i. תרבו ושמרו את ה-hPSCs הקונבנציונליים ואת ה-MEFs עד יומיים במדיום LIF-5i במדחת CO2. החליפו את מדיום ה-LIF-5i מדי יום כדי להתאים אותם למעבר הבא שלהם ולהשבה יציבה ב-LIF-3i.
לגבי תרבויות קונבנציונליות ללא מזינים, תרבו את hPSC ב-LIF-5i רק למשך הלילה לפני מעבר למחרת בבוקר. לפני מעבר, שטפו את ה-hPSC הקונבנציונליים שהותאמו ל-LIF-5i פעם אחת עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של נוזל פיצול תאים לכל באר. לאחר מכן, דגרו את הצלחת במשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס במדחת CO2.
לאחר הדגירה, ערבבו בעדינות את התאים בעזרת פיפטה לתרחיף תאים יחיד. אספו את תרחיף התאים במדיום hESC במדיום סטרילי בדילול כפול לפחות בצינור חרוטי בנפח 15 מיליליטר וערבבו בעדינות את התאים בעזרת פיפטה כדי להשיג תרחיף תאים יחיד. צנטריפוגו את התאים ב-300 גרם במשך חמש דקות.
לאחר הצנטריפוגה, שאבו וזרקו את העל-נוזל והשרו מחדש את גרעין התאים ב-1-2 מיליליטר של מדיום LIF-5i. לאחר מכן, ספרו את התאים. שטפו את צלחת ה-MEF שהונחה מראש שש-בור פעמיים עם שני מיליליטר של PBS לכל באר.
חלקו פעם עד פעמיים 10 לשישית תאים ב-2 מיליליטר של מדיום LIF-5i לבאר אחת של צלחת ה-MEF ששוטפה ב-PBS. הניחו את הצלחת במדחת CO2. למחרת, הסתובבו בעדינות בצלחת כדי להרים את כל התאים הלא מחוברים ושאבו את המדיום והחליפו אותו ב-2 מיליליטר של מדיום LIF-5i.
חזרו על שלב זה מדי יום במשך שלושה עד חמישה ימים או עד שהתאים יהיו 60 עד 70% צפופים. פרוטוקול זה תומך בהשבה מהירה ובכמות גדולה של תאים דמויי נאיב של מגוון רחב של תאי גזע עובריים אנושיים וגזע פלוריטפוטנטי מושרא כל עוד תכשירי תאים פלוריטפוטנטיים אנושיים עם בידול מסומן או קריוטיפים חריגים מוחרגים בקפידה. לאחר ההתאמה הראשונית של LIF-5i, העבירו את התרבויות היציבות הבאות של LIF-3i כל שלושה עד ארבעה ימים בארון בטיחות ביולוגית או כאשר התרבויות הפכו ל-60 עד 70% צפופות.
השליכו את מדיום התרבית ושטפו כל באר של תרבויות LIF-5i-LIF-3i על ידי הוספה עדינה של שני מיליליטר של PBS. השליכו את ה-PBS והוסיפו מיליליטר אח
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטת ה-LIF-3i מחזירה ביעילות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) קונבנציונליים למצב נאיבי דמוי אפיבלסט של טרום-השתבצות. פרוטוקול זה משפר את יכולות ההגירה ומפחית את הביטוי של גנים המכווננים לשורות תאיות מסוימות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- tאים פלוריפוטנטיים של אדם (hPSCs) קונבנציונליים מראים שונות בתהליך הדיפרנציאציה.
- מצבים פלוריפוטנטיים נאיביים חיוניים להבנת ההתפתחות המוקדמת.
- דרושות שיטות דיפרנציאציה משופרות עבור יישומים רגנרטיביים.
- שיטת LIF-3i נותנת מענה לאתגרים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להחזרת hPSCs למצב נאיבי (naïve state).
- שיפור היעילות של גדילה מודרכת (directed differentiation).
- הפחתת השונות הבין-קוית בקווי hPSC.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית משותפת עם פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs).
- מערכות תרבית ללא תאי מאכילה (Feeder-free).
- הכנת פלטות של שישה בארות ג'לטיניזות עבור תאי מאכילה מסוג MEF.
- מעבר ממושך של hPSCs שהוחזרו למצב קודם להערכת היציבות.
תוצאות עיקריות
- החזרה מוצלחת של hPSCs למצב נאיבי (naïve) יציב.
- נצפתה ירידה בביטוי של גנים המכוונים להבחנה לשושלות תאים (lineage-primed).
- שיפור ביעילות ההבחנה ללא צורך בתהליך הכנה מחדש (re-priming).
- שמירה על יציבות קריוטיפית ואפיגנומית.
מסקנות
- שיטת ה-LIF-3i פותחת נתיבים חדשים בביולוגיה התפתחותית של בני אדם.
- היא עשויה לקדם יישומים ברפואה רגנרטיבית.
- פרוטוקול זה עשוי להקל על מיקוד גנים ומחקרי כימרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר החזרה המונית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים קונבנציונליים למצב דמוי-נאיב (naive-like state), ובכך הוא מפחית את השונות בין קווים שונים בתוצאות הדיפרנציאציה ומשפר את הפלוריפוטנטיות התפקודית. על ידי הגברת יעילות הדיפרנציאציה ללא צורך ב-re-priming, השיטה תומכת במידול פרה-קליני צפוי יותר ומפחיתה סיכונים בתיקוף מטרות (target validation) במסלולי פיתוח של רפואה רגנרטיבית. השחזור של השיטה על פני קווי hESC ו-hiPSC חסרי טרנסגן מגוונים מקדם תהליכי עבודה סטנדרטיים וניתנים להרחבה עבור שלבי גילוי מוקדמים ומחקרים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי איפוס של hPSCs במצב primed למצב התפתחותי מוקדם יותר עם רעש אפיגנטי מופחת.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות השוואות איזוגניות בין מצבים דמויי-naive למצבי primed כדי להבהיר את מנגנון הפעולה.
- ערך ניבוי: משפר את רמת הביטחון במבחני דיפרנציאציה על ידי מזעור השונות הבין-קוית המקשה על זיהוי מועמדים פוטנציאליים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר hPSCs נאיביות דמויות-נאיביות יציבות ונורמליות קריוטיפית, המתאימות לפלטפורמות סריקה בספיקת תפוקה גבוהה הדורשות תגובות תאיות עקביות.
- פלט כמותי: תומך ביעילויות דיפרנציאציה מדידות על פני שכבות העובר, מה שמאפשר סריקה פנוטיפית ומסריקת תגובה למינון חסונות.
- סקילביליות: מאפשר החזרה למצב קודם (reversion) במסה ללא ברירה קלונלית, ובכך תומך בהכנת בדיקות בקנה מידה גדול ובמסעות סריקה של ריאגנטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מערכת אנושית דמוית אפיבלאסט של שלב טרום-השתבצות, המדויקת מבחינה התפתחותית, לצורך מידול של הפרעות התפתחותיות מוקדמות.
- המשכיות תרגומית: שומר על יציבות אפיגנומית באזורים מוטבעים (imprinted loci), דבר התומך בהסקה מהימנה לגבי בידול in vivo והיווצרות טרטומה.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מוחק שונות בין קווי תאים בבידול מודרך, ובכך מפחית תוצאות שגויות (חיוביות או שליליות) במחקרי יעילות פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה הסדרתית של LIF-5i ל-LIF-3i משתלבת בתהליכי גילוי על ידי אפשור יצירה סטנדרטית של מצב נאיבי (naive-state) לפני בדיקות דיפרנציאציה, שלבי זיהוי מועמדים (lead identification) ושלבי תיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות השוואות איזוגניות בין מצבים של hPSC דמויי-נאיב (naive-like) למצבים primed, כדי להבהיר מנגנוני מטרה ותלויות של מסלולים.
- סריקה: מספקת אוכלוסיות תאים בעלות יכולת דיפרנציאציה הניתנות לשחזור, לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות וסריקת תרכובות עם שונות מופחתת בין בארות.
- אנליטיקה: מאפשרת קריאות כמותיות של יעילות דיפרנציאציה של שלושה שוכות (trilineage) ונורמליזציה של ביטוי גנים להשוואות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על יציבות אפיגנומית וקריוטיפית לאורך מעברים מורחבים, ובכך תומכת במחקרים פרה-קליניים ארוכי טווח ובסנכרון של ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת שיטה הפיכה שאינה תלויה בפלטפורמה ליצירת hPSC דמויי-נאיב במספר פרויקטים וקווי תאים, ובכך מפחיתה אופטימיזציות כפולות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתוצאות דיפרנציאציה באמצעות הפחתה של סיגנלינג המכוון לשושלת (lineage-primed) ויציבות משופרת של הפלוריפוטנציות.
- ערך תפעולי: פרוטוקול סטנדרטי, תואם-פידרים (feeder-compatible) או ללא פידרים, עם מינימום מניפולציות ושחזוריות גבוהה בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של go/no-go על ידי מזעור הרעש הביולוגי במבחני דיפרנציאציה, ובכך הפחתת הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של שורות תאים מותאם-סיכון, המבוסס על יכולת איפוס תפקודית ולא על שונות של רקע גנטי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי גזע, כולל מעבר תאים (passaging), דיסוציאציה ותיקוף של סממני פלוריפוטנטיות.
- תלוי במדגרת CO2, קבִינה לבטיחות ביולוגית וציוד סטנדרטי לתרביות תאים עבור תרבית משותפת של MEF או הסתגלות לשיטה ללא תאי מאכילה (feeder-free).
- מחייב פורמולציית מדיום סטנדרטית הכוללת LIF, מעכבי GSK3β ו-MEK/ERK, ומעכב tankyrase מסוג XAV939 עבור LIF-3i, עם אפשרות לתוספת של forskolin ו-purmorphamine עבור הסתגלות ל-LIF-5i.
- נדרש תיקוף של קריוטיפ תקין ושיעור נמוך של דיפרנציאציה ספונטנית בקווי hPSC ההתחלתיים כדי להבטיח רברסיה מוצלחת.
- הסתגלות בין מערכות מודל שונות עשויה לדרוש אופטימיזציה של צפיפות הזריעה הראשונית ומשך החשיפה ל-LIF-5i לצורך התרחבות קלונלית.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Bulk Stabilization of Conventional hPSC Cultures for Subsequent Naïve Reversion with a Brief LIF-5i Adaptation
4:38
Long-term Maintenance and Expansion of N-hPSC in LIF-3i Medium
7:14
Results: Effective Reversion of Human Pluripotent Stem Cells
7:47
Conclusion
