בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביום של הקרקע, הריזוספרה והאנדוספרה של השורש, כגון כיצד מגוון הקהילה המיקרוביאלית משתנה בתגובה לסוג הדגימה, הטיפול והגנוטיפ של הצמח. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהיא מתאימה היטב לניסויי שדה הדורשים מספרי דגימה גדולים ושכפול. מי שמדגים את ההליך יהיו אני וסטפני פוטרל, סטודנטית לתואר שני וטכנאית מחקר מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל את הפרוטוקול, סמן תבנית כביסה ודלי עם פתק דביק עם פרטי דגימת הצמח. נשא את הדלי המסומן למגרש והשאיר את מחבת הכביסה בתחנת העבודה שהוקמה בשטח. בחר ואסוף באופן אקראי שני צמחים לכל חלקה מאזורים שונים בתוך החלקה.

לאחר מכן, חודרים את האדמה בעזרת חפירה לעומק של 30 סנטימטרים כדי לחתוך כל אחד מהשורשים הרוחביים המחזיקים את הצמח באדמה. חפרו את שורשי הצמח על ידי מינוף האת והניחו את כדור השורש בדלי המסומן. החזר את הדלי לעמדת העבודה בשטח.

נענע את השורשים והשתמש בכף או במשיכה ידנית כדי להסיר אדמה מהשורשים. ללבוש כפפות ולהניח את השורשים ליד תחנת העיבוד. לאחר ניעור השורשים, מערבבים את האדמה בתבנית הכביסה ומפרקים את כל גושי האדמה בעזרת טילר כף יד.

הניחו דגימת אדמה נקייה מפסולת לתוך שקית אחסון עם רוכסן בגודל 17.7 על 19.5 ס"מ והניחו אותה על קרח. עקר מספריים גיזום באתנול 70%. השתמש במספריים הסטריליים כדי לכרות מגוון שורשים, כארבעה עד שישה שורשים לצמח וכל שורש באורך של כ-9 עד 12 סנטימטרים.

הנח את השורשים הכרותים בשפופרת מסומנת של 50 מיליליטר המכילה 35 מיליליטר של מאגר פוספט אוטוקלאב עם חומר פעילי שטח כגון Silwet L-77. לנער את הצינורות במשך שתי דקות כדי לשחרר את הריזוספרה מפני השטח של השורשים. שפר את הטלטול בעזרת גנרטור ומערבולת.

בעזרת מלקחיים מעוקרים באתנול 70%, הוציאו את השורשים מהצינור, נגבו אותם לזמן קצר על מגבות נייר והניחו אותם בצינור חדש עם תווית של 50 מיליליטר. הנח גם את הצינור המכיל את הריזוספרה וגם את זה המכיל שורשים על קרח. הוסף כ-35 מיליליטר של 50% אקונומיקה בתוספת 0.01% טווין 20 לצינורות של 50 מיליליטר עם שורשים שנאספו בשדה.

מערבל או מנער את הצינורות למשך 30 עד 60 שניות. יוצקים את האקונומיקה, מוסיפים 35 מיליליטר אתנול 70%, ומערבלים או מנערים את השורשים למשך 30 עד 60 שניות נוספות. לאחר הטלטול, שפכו את האתנול 70% והוסיפו 35 מיליליטר מים סטריליים וטהורים במיוחד ומערבולת או נערו את הדגימה למשך דקה.

חזרו על שלב השטיפה במים פעמיים נוספות כדי שהשורש יקבל בסך הכל שלוש שטיפות במים סטריליים וטהורים במיוחד. כתם את השורשים על מגבות נייר יבשות ונקיות והשתמש במגבת נייר נקייה לכל דגימה. בעזרת מלקחיים סטריליים ומספריים גיזום, חותכים את השורשים לחתיכות של כחמישה מילימטר ומניחים שורשים חתוכים בצינור חרוטי נקי ומסומן בנפח 15 מיליליטר, ואז מאחסנים את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.

נער את הצינורות של 50 מיליליטר המכילים דגימות ריזוספרה מהשדה למשך 20 עד 30 שניות כדי להשעות מחדש את הדגימה כולה. בעזרת מסננת תאי רשת סטרילית של 100 מיקרון, סנן את הדגימה המושעה מחדש לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב -3, 000 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

שפכו מיד והשליכו את הסופרנטנט. הניחו את כדורי הריזוספרה בצינורות של 50 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר של מאגר פוספט סטרילי ללא פעילי שטח לכדורי הריזוספרה ומערבל אותם כדי להשעות מחדש את הדגימה.

הכניסו את הנוזל המרחף לתוך צינור מיקרופוגה נקי ומסומן בנפח שני מיליליטר. סובב את הצינורות בחום של 15, 871 פעמים גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. שופכים מיד את הסופרנטנט ומסננים את הצינורות על מגבות נייר נקיות.

אחסן את הכדורים במינוס 20 מעלות צלזיוס עד להמשך עיבוד. בעזרת מרית מתכת סטרילית, מלאו צינור נקי ומסומן של שני מיליליטר בכשלושה גרם אדמה למיצוי DNA והימנעו מחתיכות שורש קטנות ופסולת. שטפו את מרית המתכת ב-70% אתנול בין כל דגימה.

אחסן את דגימת האדמה הזו במינוס 20 מעלות צלזיוס. במחבת כביסה נקייה, רוקנו את שקית האדמה למסננות מוערמות עם המסננת הגדולה יותר על גבי המסננת הקטנה יותר ונפו ידנית את האדמה דרך שתי המסננות. השתמש במברשת כדי לנקות בזהירות את המסננות בין הדגימות.

הניחו בצד 100 עד 125 גרם אדמה מנופה בשקית עם רוכסן בגודל 17.7 על 19.5 ס"מ לניתוח פיזיקוכימי ומרקם עתידי של הקרקע. הניחו את שקיות האדמה בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר. לאחר מכן, שפכו חנקן נוזלי לכוס פלסטיק עם מרית נקייה ובמכתש נקי.

מניחים את הרקמה הקפואה במכתש וטוחנים אותה עם העלי לאבקה דקה. הוסף ללא הרף חנקן נוזלי במהלך הטחינה כדי לשמור על דגימות קפואות. השתמש במרית כדי להעביר את רקמת הקרקע בצינור נקי ומסומן של שני מיליליטר ולאחר מכן אחסן את הרקמה במינוס 80 מעלות צלזיוס.

נגב את אזור העבודה עם 70% אתנול ו-1% אקונומיקה ביתית. הסר את דגימות האדמה מהאחסון של מינוס 20 מעלות צלזיוס והפשיר אותן בדלי קרח. הסר את מכסה שטיח האיטום מצלחת חילוץ של 96 בארות והנח את המכסה בין שני מגבוני נייר כדי לשמור על ניקיונו בזמן שאינו בשימוש.

מכסים את 12 עמודות הצלחת ברצועות PCR דביקות עם 8 בארות כדי למנוע זיהום. משפך משקל סטרילי בגודל קטן על משקל ושוקל 200 עד 250 מיליגרם אדמה. הרם בזהירות את רצועת הדבק כלפי מעלה, הנח את צוואר משפך השקילה המלא לבאר המתאימה, והנח בעדינות את דגימת האדמה לבאר המתאימה.

החזר את רצועת ההדבקה לכיסוי הבאר. חזור על תהליך זה עבור כל באר, באמצעות משפך סטרילי חדש לכל דגימה. החזר את מכסה שטיח האיטום על צלחת החילוץ ואחסן את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה למיצוי DNA.

הסר את דגימות הריזוספרה מהאחסון של מינוס 20 מעלות צלזיוס והפשיר בדלי קרח. הכן את צלחת מיצוי ה-DNA כפי שנעשה בסעיף הקודם. הניחו מגבון נייר נקי על סולם, ואז טרפו מרית מתכת סטרילית על המשקל.

השתמש במרית כדי לגרוף בזהירות חלק מכדור הריזוספרה מצינור דגימה. שוקלים בין 200 ל-250 מיליגרם של דגימת הריזוספרה. הרם בזהירות את רצועת ההדבקה כדי לחשוף את הבאר הראשונה של לוחית החילוץ.

זווית את המרית המלאה לבאר ומגרדים את חומר הריזוספרה לבאר המתאימה בעזרת קיסם סטרילי. שוטפים את מרית המתכת במים ואחריה 70% אתנול בין הדגימות. לבסוף, חזור על תהליך זה עבור כל באר בצלחת עד שהצלחת מתמלאת, והשאיר באר אחת ריקה כבקרת חילוץ ריקה.

במערך נתונים מייצג זה, היו הבדלים משמעותיים ביותר בין סוגי הדגימה, ונראה כי הריזוספרה והקרקע דומים יותר בהרכבם זה לזה מאשר השורש. ניתוח נוסף מראה שהיו גם הבדלים משמעותיים ביותר בהרכב הקהילה המיקרוביאלית בין ריזוספרה לאדמה. ניתוח מגוון אלפא מראה שהקהילות המיקרוביאליות באנדוספרה היו נמוכות יותר מקהילות באדמה ובריזוספרה.

ההבדל המשמעותי היחיד במגוון בין מיני העשב היה בין דגימות האנדוספרה של גבעול כחול גדול ועשב מתג. ניתוח השפע היחסי מדגיש את הדומיננטיות של פרוטאובקטריה ואחריה אקטינובקטריה בכל סוגי הדגימות. הקרקע והריזוספרה נשלטים על ידי חומצה וכלורופלקסי, בעוד שבשורשים היה שפע יחסי גדול יותר של בקטריודטים.

ניתוח PERMANOVA של כל סוגי הדגימות הבהיר הבדל משמעותי ביותר בהרכב הקהילה המיקרוביאלית עקב מיני צמחים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע סדרה של צעדים לשימוש בחקר המיקרוביום של אדמה, אנדוספרה וריזוספרה. ברצוננו להודות ל-EPSCoR של נברסקה ולתוכנית תשתית המחקר EPSCoR של הקרן הלאומית למדע על המימון החלקי של הסרטון החינוכי הזה.