Name: בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: למדו שיטות לבידוד וניתוח קהילות מיקרוביאליות בקרקע, ריזוספירה ושורשים עבור מחקר אקולוגיה מיקרוביאלית. פרוטוקולים סטנדרטיים אלו מאפשרים ניסויים שדה בקנה מידה גדול עם תוצאות ברות שחזור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפיתוח של כתב יד זה נתמך על ידי המרכז EPSCoR של קרן המדע הלאומי השורש, Rhizobiome חדשנות פרס אויה (oia)-1557417.... איסוף הנתונים נתמכה על ידי קרנות של אוניברסיטת נברסקה, מינהל המחקר החקלאי ופיתוח על ידי מענק הפתח של משרד החקלאות. אנחנו גם תמיכה של משרד החקלאות-ARS ומסכים העניקה תמיכה חקלאות, מזון המחקר יוזמת תחרותי מענק מס 2011-68005-30411 של משרד החקלאות המכון הלאומי של מזון וחקלאות להקים ולנהל את שדות אלה.

<ol><li>Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+back+to+the+roots%3A+the+microbial+ecology+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).</li>
<li>Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+the+unknown%3A+disentangling+the+complexities+of+the+soil+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome.</a> Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+microbial+communities+in+soil%2C+rhizosphere+and+roots+of+two+major+crop+systems+under+elevated+CO2+and+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15019(2017).</li>
<li>White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio+Temporal+influence+of+isoflavonoids+on+bacterial+diversity+in+the+soybean+Rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).</li>
<li>Edwards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+variation%2C+and+assembly+of+the+root-associated+microbiomes+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li>
<li>Bougoure, D. S., Cairney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblages+of+ericoid+mycorrhizal+and+other+root-associated+fungi+from+Epacris+pulchella+%28Ericaceae%29+as+determined+by+culturing+and+direct+DNA+extraction+from+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots.</a> Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).</li>
<li>Doty, S. L., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF03179967">Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow.</a> Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).</li>
<li>Gottel, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+microbial+communities+within+the+endosphere+and+rhizosphere+of+populus+deltoides+roots+across+contrasting+soil+types%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).</li>
<li>Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+three+endophytic%2C+indole-3-acetic+acid-producing+yeasts+occurring+in+Populus+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees.</a> Mycological Research. 113, 973-980 (2009).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biolology%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biolology. 12, 87(2014).</li>
<li>Gohl, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+improvement+of+amplicon+marker+gene+methods+for+increased+accuracy+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+innovations+for+high-throughput+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).</li>
<li>RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.rstudio.com/">http://www.rstudio.com/</a> (2015).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPARSE%3A+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://affect-reason-utility.com/1301/4/shannon1948.pdf">A mathematical theory of communication.</a> Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).</li>
<li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/163688a0">Measurement of diversity.</a> Nature. 163, 688(1949).</li>
<li>Chao, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4615964">Non-parametric estimation of the number of classes in a population.</a> Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).</li>
<li>Legendre, P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jpe/article/1/1/3/1130269">Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis.</a> Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).</li>
<li>Oksanen, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228975085_The_Vegan_Package">The vegan package.</a> Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).</li>
<li>Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22Ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).</li>
<li>Cole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ribosomal+Database+Project+%28RDP-II%29%3A+sequences+and+tools+for+high-throughput+rRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).</li>
<li>Wagner, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genotype+and+age+shape+the+leaf+and+root+microbiomes+of+a+wild+perennial+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant.</a> Nature Communications. 7, 12151(2016).</li>
<li>O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+community+analysis+by+large-scale+sequencing+of+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).</li>
<li>Taylor, D. L., et al. <a target="_blank" href="https://esajournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1890/12-1693.1">A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning.</a> Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).</li>
<li>Lebeis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+modulates+colonization+of+the+root+microbiome+by+specific+bacterial+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa.</a> Science. 349 (6250), 860-864 (2015).</li>
<li>Ofek-Lalzar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+and+host-associated+functional+signatures+of+the+root+surface+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome.</a> Nature Commununications. 5, 4950(2014).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li>
<li>Fitzpatrick, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+ecological+function+of+the+root+microbiome+across+angiosperm+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).</li>
<li>Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+effects+of+nitrogen+fertilization+on+soil+bacterial+communities+in+contrasting+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems.</a> Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).</li>
<li>Paungfoo-Lonhienne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+the+table%3A+Plants+consume+microbes+as+a+source+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients.</a> PLoS One. 5 (7), e11915(2010).</li>
<li>Yeoh, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li>
<li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li>
<li>Peiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+heritability+of+the+maize+rhizosphere+microbiome+under+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בשיטות המתוארות בכתב היד צריך לאפשר למדענים בקלות להכנס לתחום metagenomics אדמה וצמח. במהלך השנים, אנו יש מעודן השיטות שלנו מאז ביצוע הניסוי המתואר בכתב היד. שינוי אחד הוא כי עכשיו מראש מתייגים צינורות לפני היציאה לשדה מדגם. המעבדה שלנו משתמשת מערכת barcoding תווית מדפסת. המדפסת תווית לא רק חוסך זמן כאשר תיוג צינורות, אבל גם הופך את הכל קל יותר לאתר, לזהות כראוי את דגימות ללא הגחמות של כתב היד האנושית. נקודה קריטית נוספת היא שאנחנו מנסים לעבד את החומר לאחר שהבאת אותו בחזרה מן השדה בהקדם האפשרי. אנו שואפים להקפיא את הקרקע המשמש עבור ניתוח הדנ א, לעקר, להקפיא את השורשים, לסנן ואת להקפיא את rhizosphere תוך 12 עד 36 שעות לאחר שחזר מן השדה. ההליכים מיצוי הדנ א הם ממושך עם שלבים רבים, במיוחד עבור קרקע ומי rhizosphere, כך רכשנו רובוט (Flex השלדג, ThermoFisher), זה ממזער את הידיים בזמן הפרוטוקולים הפקת דנ א, מפחיתה טעויות אנוש הנובעות עשוי להיות מוצג. ומשפר את עקביות תשלימו אצוות של אדמה, שורשים או rhizosphere מעובדים. כאשר עובדים עם חומר צמחי חשוב להחליט על סוג הבסיס שילמדו או לקחת מגוון סוגי שורש כדי לקבל "מדגם מייצג". שמירה על שורשים, משאיר במצב קפוא כאשר ניצוח של עקירות הדנ א הוא חשוב, כמו זה להבטיח שיש אין זיהום צולב בין דגימות בשעת מילוי צלחות מיצוי הדנ א 96-ובכן. גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא המספר של משכפל שישמש בעת תכנון שדה ניסויים ושימוש מלא אקראי עיצוב במידת האפשר26. בשל השתנות השדה גבוהה זה יהיה חייב להיות מספר גדול של משכפל כדי לזהות הבדלים קטנים. לבסוף, מתוך הניסיון שלנו זה חיוני כדי לוודא קרקעות אינם רטובים מדי בעת סטטורי השורשים. אם קרקעות רוויים עם מים זה מבולגן לא רק לעבוד עם, אך זה גם מאוד קשה כדי להגדיר את rhizosphere וכדי להסיר את הקרקע מן השורשים.
שינוי אחד שהתבצע מוקדם מאוד במהלך הפיתוח של שיטות אלה היה במקום רועד הצינורות ביד כדי לשחרר את rhizosphere שלנו לשדרג vortexers מופעל על ידי גנרטור גז כדי להקל את עבודת השדה ועוד סטנדרטית במונחים של הזמן ואת אופן כל שפופרת היה נסער. מגבלה אחת של הגישה רצף אמפליקון היא הרזולוציה טקסונומי של התוצאות הוא מוגבל אוטוס רבים הם לא ידועים או היחיד הידוע ברמת המשפחה או סוג. תחום המחקר מתפתח במהירות רבה ולכן חשוב להיות מודעים גישות חדשות ומתפתחות, במיוחד עבור ניתוח נתונים זה עשוי לשפר את הרזולוציה של התוצאות.
פרוטוקולים אלה הם רק עבור הלומדים חיידקים, ארכאונים, לא פטריות. השימוש של תחל שונים עבור הגברה יאפשר לחקר קהילות פטרייתי שימוש באותו DNA דגימות27,28. שיטות אלה אינם דורשים הרכישה של כמויות גדולות של ציוד כי השיטות ניתן לפשט. השיטות נתאר כאן הם בעיקר לקביעת "מי זה שם", אך השדה מתפתח במהירות לתוך שואל שאלות חשובות על הפונקציה, אשר שניתן לטפל בהן באמצעות רובה רצף שיטות, בידוד ו בדיקת הפונקציונליות של חיידקים, או רצף הגנום כולו מיקרוביאלי.
התוצאות נציג להדגיש את ההבדלים בקהילות חיידקים העלולים להתגלות בשיטות המתוארות. ההבדלים ההלחנה באמצעות הגישה בטא-המגוון של ניתוח נתונים22, הוצגו בין סוגי מדגם. ההבדלים האלה נצפו בבירור במחקרים רוב אחרים כאשר endosphere, rhizosphere ואדמה מכילה קהילות חיידקים ייחודי3. המדד לגיוון שאנון מחושב כדי לקבוע את השפע ואת שויון של המין מיקרוביאלי מתנה בתוך כל מיני צמחים endosphere, rhizosphere, וכן קרקע. כפי שמוצג במחקר זה ובמקומות רבים אחרים, גיוון אלפא הוא הגבוה ביותר האדמה, להקטין מעט ב- rhizosphere, ואז להקטין באופן משמעותי5,3,endosphere29. תוצאות אלו מצביעות על השיטות המתוארות כאן מתאימים לזיהוי שינויים ההלחנה ב endosphere, rhizosphere, ו אדמה.
הדומיננטיות של פרוטאובקטריה הוא ממצא נפוץ במחקרים על endosphere וקרקע30,31,32. Endosphere יש בדרך כלל מגוון התחתון של מינים חיידקים עם השפע היחסי גבוה יותר פרוטאובקטריה. זה שוב מדגיש כי התוצאות כאן הן נציג ממצאים אחרים בספרות. ההשפעות הטיפול במחקר זה היו לא שונה באופן משמעותי, שתי סיבות הגדולות עשויים להיות כי ההבדלים המוטלים על-ידי הטיפולים לא היו גדולים מספיק כדי ליצור וריאציה מספיק כדי לזהות כי דגימה זו נעשה בסוף עונת, כאשר השדות אולי היו מספיק זמן כדי לשלוף את החנקן לרמות דומות, וזה מה נמדד בסוף עונת הצמיחה. במחקר אחר באמצעות שיעורי ההפריה דומה לאורך תקופה ארוכה יותר של זמן, רק יחסית שינויים קטנים בהרכב של microbiome היו נמדדו33. מחקרים אחרים הראו שינויים בקהילות פטרייתי והן חיידקי עקב חנקן-דשן-34,-35.
מיני צמחים ידועים לשחק תפקידים בקביעת שלהם microbiomes3,32,36 , הבדלים קטנים אפילו וריאציה הקהילה מיקרוביאלי הוכחו בין צמחים שונים אחרים בתוך אחד המינים37. במחקר זה, נמצא הבדל משמעותי בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין מיני צמחים. כל סוגי מדגם זה הופיעה שיש switchgrass הרכב מיקרוביאלי ברורים ביותר, אבל ההבדלים בין המינים היו רק משמעותי סטטיסטית ב endosphere. הרכב הקהילה rhizosphere הפכה משמעותית אם משכפל נוסף היו זמינות לניתוח.
שדה משולב, מעבדה, והפרוטוקולים אנליטי המתוארים כאן מספקות שיטה חזקה לימוד השפעת גורמים שונים איך ההרכב של הקהילות מיקרוביאלי קרקעות, rhizosphere, את endosphere של השורשים36. יש הרבה מאוד עבודה באזור של הלומדים microbiomes, במיוחד בשטחים חקלאיים. שאלות חשובות לגבי איך התשואות שונו על-ידי microbiome הקרקע טרם להיות הובהר באופן מלא. אפילו את השאלות הבסיסיות ביותר לגבי איך היבול סבבים להשפיע על אדמת microbiome, איך התזמון משנה את microbiome, מתח איך והאביוטיים הפיצולים של microbiome, כיצד סוג הקרקע אינטראקציה עם גורמים אלה כדי לשנות את microbiome, ולבדוק אם קיימים יוניברסל חיידקים מסוימים יבולים או אזורים של ארה ב הם כל שאלות פתוחות. שיטות אלה יהיה גם שימושי עבור מחקרים אפידמיולוגיים לזהות את הנוכחות ואת ההתמדה של חיידקים פתוגניים, ומוצלח. אופק עתידי אחר ששיטות אלה יהיה להתחיל שילוב ה-DNA בשיטות המתוארות כאן עם הצמח, חיידק ה-RNA, מטבוליט נתונים. שיפור נוסף ובדיקות של משתנים נוספים יהיה חשוב עבור נוספים מיטוב של פרוטוקולים אלה.

מחקר Microbiome יש השלכות חשובות על הבנה וטיפול האקולוגית תהליכים כגון מזין רכיבה על אופניים, תחלופת חומר אורגני, לבין פיתוח או עיכוב של אדמת פתוגנים1,2. המחקר בתחום זה מחזיקה גם פוטנציאל גדול עבור הבנת ההשפעות של אדמה חיידקים על הפרודוקטיביות של קהילות צמחים טבעית ו- agroecosystems. אמנם ישנם מחקרים רבים התמקדו microbiome אדמה ב הטבעיות, דבר פחות התמקדו צמח חיידקים rhizosphere ו- endosphere agroecosystems3. בנברסקה, החקלאות חולש על הנוף על פני חלקים גדולים של המדינה, ביצוע המחקרים של קרקעות אלה איפה בחקלאות הגידולים גדלים נושא חיוני למחקר. מטרת המאמר שיטות היא להעניק חוקרים ערכה רגילה של פרוטוקולים כדי לתאר את החיידקים המצויים agroecosystems, כדי לקבוע כיצד שורשי צמחים לשנות את הקהילות מיקרוביאלית ב rhizosphere ו endosphere, בסופו של דבר להבין את הפונקציות שהחיידקים האלה לשחק את התפוקה ובריאות הצמח בקרקע.
השיטה המוצגת כאן שונה במקצת מן שננקטו על-ידי אחרים4,5 ב כי הנייר הזה מכוון למידה אילו חיידקים נמצאים אך ורק בתוך הבסיס, איך הם שונים חיידקים מיד מחוץ לשורש rhizosphere. רצף אמפליקון השתמשו במחקר זה מזהה את taxa חיידקים הנמצאים לדנ ומאפשר לחוקרים כדי לקבוע כיצד הקהילות לשנות בהתאם סוג הדגימה או טיפול. לאחד ההבדלים העיקריים בין פרוטוקול זה פרוטוקול דומה מאוד בשימוש על-ידי. Lundberg et al. 6 הוא כי במקום sonication, פרוטוקול זה משתמש עיקור משטח עם אקונומיקה, אתנול כדי להסיר את rhizosphere מן השורשים. אחרים החלו להשתמש בו גם משטח עיקור ביעילות7,8,9,10. שיטות אלה אינן יתרון יותר מאשר שיטות אחרות, אך שונה במקצת. שיטות אלה מתאימים במיוחד בשביל ניסויי שדה גדול משום עם מספיק אנשים ניתן לעיבוד חלקות השדה מעל 150 ליום, אשר מוסיפה עד בערך 450 דוגמאות כאשר לחלקו ל endosphere, rhizosphere ואדמה. כתב יד זה מתאר בפירוט את שיטות השתמשו כדי לדגום בשדה, לעבד את החומר במעבדה, לחלץ, רצף ה-DNA, ומספק סקירה קצרה של צעדים כדי לנתח את הנתונים המתקבלים רצף.

<table><tbody><tr><td>ערכת Dneasy PowerSoil HTP 96</td><td>Qiagen / MoBio</td><td>12955-4</td><td>ערכת מיצוי לאדמה וריזוספרה</td></tr><tr><td>ערכת Dneasy PowerPlant HTP 96</td><td>Qiagen / MoBio</td><td>13496-4</td><td>ערכת מיצוי לשורשים</td></tr><tr><td>את חפירה ידית D, 101 ס"מ L</td><td>Fiskars</td><td>9669</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Tiller, 40 ס"מ L</td><td>Truper</td><td>34316</td><td></td></tr><tr><td>שקיות Ziploc, 17.7 ס"מ x 19.5 ס"מ</td><td>Ziploc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA Cooler</td><td>כל</td><td></td> מחבת כביסה NA <td></td></tr><tr><td></td><td>כל</td><td></td> דלי פלסטיק NA <td></td></tr><tr><td></td><td>כל</td><td></td> כפפות NA <td></td></tr><tr><td>(עבודה ומעבדה)</td> <td>כל</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>קוטר 20 ס"מ מסננת אדמה #8, 2360 &mu; m גודל רשת</td><td>Dual Manufacturing Co., שיקגו IL</td><td>US8-8FS</td><td></td></tr><tr><td>קוטר 20 ס"מ מסננת אדמה #4, 4750 &mu; m גודל רשת</td><td>Dual Manufacturing Co., שיקגו IL</td><td>US8-4FS</td><td></td></tr><tr><td>גנרטור נייד</td> מותג <td>הונדה עובד היטב</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאים סטריליים 100 &mu; m גודל רשת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>VWR</td><td>0823</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>VWR</td><td>0404</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Lehman Seeds</td><td>VIS-30</td><td></td></tr><tr><td>אוטוקלאבים</td> פעילי שטח <td>כל</td><td></td> תנור ייבוש NA <td></td></tr><tr><td></td><td>כל</td><td></td> סולם NA <td></td></tr><tr><td></td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה</td><td>CLOROX - חוזק ביתי</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>כל</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>כל</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>כדורי קרח יבש</td><td>כל</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>כל</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>11 ס"מ דיוק פינצטה עדינה</td><td>פישר</td><td>17456209</td><td></td></tr><tr><td>18 ס"מ מלקחיים דגימה נקודה ישרה</td><td>VWR</td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>13.5 ס"מ מספריים גיזום</td><td>Fiskars</td><td>9921</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צינור</td><td></td> כל <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל PP צינור חרוטי</td><td>MIDSCI</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל PP צינור חרוטי</td><td>MIDSCI</td><td>C50B</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים</td><td>במיוחד Millipore-sigma</td><td>Milli-Q אינטגרל, Q-POD</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 פלואורומטר</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>לכימות DNA של דגימות שהוסרו</td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>לכימות DNA</td></tr><tr><td>96-Well שחור עם צלחות תחתונות שטוחות שקופות</td><td>קורנינג</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>pPNA PCR חוסם</td><td>PNA Bio</td><td>PP01-50</td><td></td></tr><tr><td>mPNA PCR חוסם</td><td>PNA Bio</td><td>MP01-50</td><td></td></tr><tr><td>DNA גנומי מקהילה מיקרוביאלית מדומה B (אפילו ריכוז נמוך) v5.1L, לריצוף גנים של 16 שניות rRNA</td><td>משאבי BEI דבק</td><td>HM782D</td><td></td></tr><tr><td>8 רצועות באר לצלחות</td><td>VWR</td><td>89134-434</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי נירוסטה, קוטר 3.2 מ"מ</td><td>Next Advance</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל בלוק בדיקה (צלחת מיצוי DNA עבור Qiagen / MoBio Dneasy ערכת PowerPlant HTP)</td><td>CoStar</td><td>3959</td><td></td></tr><tr><td>משפך שקילה PP אנטי סטטי, גודל קטן עבור אדמה/ריזוספרה</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWF1SPK</td><td></td></tr><tr><td>משפך שקילה PP אנטי סטטי, גודל x-small עבור שורש/עלה</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWFXSCS</td><td></td></tr><tr><td>Genie 2 Digital</td><td>Vortex Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>מתאם מערבולת לצינורות</td> <td>50 מ"לScientific Industries</td><td>SI-H506</td><td></td></tr><tr><td>טיט (100 מ"ל) ועלי</td><td>כל</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מתכת מיקרו-מרית</td><td>VWR</td><td>80071-672</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומרית אנטי סטטית חד פעמית</td><td>VWR</td><td>231-0106</td><td></td></tr><tr><td>שקית נייר חומה 2# (10.95 ס"מ x 6.19 ס"מ x 20 ס"מ)</td> <td>Duro</td><td>18402</td><td></td></tr><tr><td>5424 צנטריפוגה לצינור 2 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה לצלחת 96 בארות</td><td>Sigma4-16S</td><td>81510</td><td></td></tr><tr><td>רוטור צנטריפוגה לצינורות 50 מ"ל</td><td>Sigma4-16S</td><td>12269 - Biosafe</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi DNA פולימראז</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

מחקרים microbiome צמחים ואדמה הופכים יותר ויותר חשוב להבנה שמיקרואורגניזמים התפקידים לשחק את התפוקה החקלאית. מטרתו של כתב יד זה נועד לספק פירוט כיצד לדגום קרקע, rhizosphere ו- endosphere של ניסויי שדה משוכפל ולנתח שינויים שעלולות להתרחש בקהילות מיקרוביאלי סוג הדגימה, טיפול וכתוצאה צמח גנוטיפ במהירות. הניסוי נעשה שימוש כדי להדגים שיטות אלה מורכב חלקות השדה משוכפל המכיל שני, טהור, חמים-העונה עשבי (ושכנותיה virgatum ו gerardii זקניים) ותערובת נמוך-המגוון דשא (א gerardii, Sorghastrum נטויה, , Bouteloua curtipendula). בקצרה, צמחים הם חפרו, מגוון רחב של השורשים הם לחתוך להציב במאגר פוספט ואני מזועזע ואז לאסוף את rhizosphere. שורשים מובאים למעבדה על קרח, משטח לעקר עם אקונומיקה, אתנול (EtOH). Rhizosphere הוא מסונן, מרוכז על ידי צנטריפוגה. חפירות ארכיאולוגיות מהאדמה סביב כדור הבסיס להציב לתוך שקיות פלסטיק, הובאו למעבדה שבו כמות קטנה של אדמה נלקח DNA עקירות. ה-DNA שחולצו מן השורשים, קרקע, rhizosphere, ואז מוגבר עם צבעי יסוד האזור V4 של הגן rRNA מטוסי אף-16. Amplicons הם וסודרו, ואז נותחו בכלים לביואינפורמטיקה גישה פתוחה. שיטות אלה לאפשר לחוקרים לבדוק איך הקהילה מיקרוביאלי גוניות משתנה בשל סוג הדגימה, טיפול, ולשתול גנוטיפ. באמצעות שיטות אלו יחד עם מודלים סטטיסטיים, התוצאות נציג מדגימים ישנם הבדלים משמעותיים בקהילות מיקרוביאלית של שורשים, rhizosphere אדמה. השיטות המובאות כאן מספקים ערכה מלאה של צעדים כיצד לאסוף דגימות שדה בודד, לחלץ, לכמת, להגביר, רצף ה-DNA, לנתח את הקהילה מיקרוביאלי גיוון והרכב במשפטי שדה משוכפלת.

התוצאות נציג שהוצגו בכתב יד זה בא מתוך אתר שדה נוסדה בשנת 2012 לחווה חטיבת המחקר של החקלאות אוניברסיטת נברסקה לינקולן ליד מיד, נברסקה לפני הניסוי, האתר כבר הצליח כמו סיבוב תירס-סויה . האתר המחקר ממוקם על שלושה סוגים שונים של קרקעות, אך הנתונים נותחו כאילו כל השינויים במאפייני הקרקע נמדד בשל הטיפולים שהוטלו.
אתר שדה הכיל שני, טהור, עומד של switchgrass (virgatum פ קורות חיים ליברטי) ו bluestem גדול (gerardii א), כמו גם תערובת עשב נמוך-המגוון המכילה bluestem גדול, indiangrass (ס' נטויה) ו- (גראמה sideoats 'בבוט' נולד ב- curtipendula). החלקות דשא חמים-העונה שלוש היו בעיצוב בלוק שלם אקראי ששוכפל שלוש פעמים. מקונן לתוך שלוש החלקות דשא שונים היו שני טיפולי הפריה חנקן (N), אשר היו 56 (N1) ו- (N2) 112 ק ג N חה-1 של אוריאה יישומית. בזמן microbiome הדיגום בסוף עונת הצמיחה, הכיל 8.0 ± 1.1 (זאת אומרת ± SD) ppm החנקני החלקות מופרית עם 112 ק ג N חה-1 ו- 6.8 ± 0.7 (ממוצע + SD) ppm החנקני החלקות מופרית עם 56 ק ג N חה-1. החלקות היו כבר מופרית פעם בשנה. הדשא חמים-עונת מגרשים נקבעו חלקות הראשי (8000 מ'2) ו- N טיפולים היו החלקות פיצול (4000 מ'2). Bluestem גדול היה נזרע כמו תערובת 50: 50 של "בוננזה" 'מכרה זהב', Indiangrass היה נזרע כמו תערובת 50: 50 של 'הצופים' 'לוחם'. החלקות ניטעו בשנת 2012, היישום N הראשון התרחש באביב 2013.
הקרקע ואת שורש דגימה נערך ב- 15 בספטמבר 2014. העבודה המתוארות להלן נערכה על שדה זה הוקם מגרש המפוצל עיצוב אקראי עם שלושה משכפל (איור 1). העומק הממוצע רצף של כל הדגימות עבור endosphere היו כדלקמן: 4871 rhizosphere (זאת אומרת ± SD), ± 5711: אדמת, ± 14684 40726: 38184 ± 9043. אחד המקורות הגדולים ביותר של וריאציה בניסויים אלה, בשיטות המתוארות, ההבדל בקהילות חיידקים שנמצאו בין סוגי מדגם (איור 2). בערכת נתונים ייצוגית זו, rhizosphere ואת אדמת להיראות יותר דומים בהרכב אחד לשני מאשר endosphere (איור 2 א). עם זאת, היו גם מאוד משמעותי (p = 0.001) הבדלים בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין rhizosphere לבין אדמה (איור 2B). וריאציית הכולל היוו בניסויים אלה נותחו על ידי סוג המדגם היה 26%.
ניתוח גיוון אלפא הראה כי הקהילות מיקרוביאלית endosphere היו נמוכות במדגם גיוון לעומת קרקע ו rhizosphere (איור 3). ההבדלים המשמעותיים היחידים בשונות בין המינים דשא בתא כלשהו היו בין הדגימות endosphere של bluestem גדול switchgrass, עם switchgrass שיש מגוון מינים חיידקים גבוה משמעותית (איור 3). הניתוח השפע היחסי (איור 4) מדגיש את הדומיננטיות של פרוטאובקטריה ואחריו Actinobacteria בכל סוגי הדגימה. אדמת ו rhizosphere גם נשלטים על ידי Acidobacteria ו- Chloroflexi , ואילו endosphere היה שפע יחסי גדול יותר Bacteriodetes.
בניסוי זה, הצמחים גדלו עם שתי כמויות שונות של דשן N, ולכן ניתחנו את הנתונים כדי לקבוע היו תופעות הטיפול. השפעות הטיפול היוו 12% וריאציית הכולל אך לא היו שונים באופן משמעותי למרות ב ההסמכה שני הטיפולים נראים שונים (איור 5). זה מדגיש את החשיבות של ניתוחים סטטיסטיים עבור אלה datasets ולא בדיקה ויזואלית או פסקי דין איכותי.
הבדלים בהשפעה הצמח microbiome של רקמות הצמח וקרקע היו visualized באמצעות שיטה המאולץ של ההסמכה. הבדלים סטטיסטיים היו נחושים באמצעות ניתוח PERMANOVA כדי לבדוק אם משתנים מסוימים, כמו מינים, לגרום בהרכב הקהילה חיידקים שונים באופן משמעותי בין הדגימות. כאשר כל סוגי דגימה נותחו יחד, הבדל מאוד משמעותי נמצאה בהרכב הקהילה מיקרוביאלית עקב מיני צמחים (איור 6). בניסוי זה, הסכום של וריאציה מהיבול על-ידי מיני צמחים היה 6.7%. לבסוף, כל סוג הדגימה נותחו בנפרד כדי לקבוע אשר של סוגי דגימה עלול לדחוק את האפקט מינים צמח משמעותית. רק ב endosphere היה הבדל מאוד משמעותי (p = 0.001) בין היצירות הקהילה מיקרוביאלית של מינים שונים (איור 7). סוגי דגימה אחרים, האפקט מינים לא היה משמעותי כאשר מנותח בנפרד. Endosphere, הווריאציה אחוז עקב מינים היה 27%, ואילו זה היה נמוך ב- rhizosphere (18%) וקרקע (15%). זה מדגיש עוד יותר את חשיבות ניתוח בנפרד כל סוג הרקמה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> איור 1: דוגמה של עיצוב ניסיוני שדה. תכנון ניסויי שדה הממחישות עיצוב בלוק שלם אקראי שהפקידים של אתר שדה הממוקם ב אוניברסיטת נברסקה לינקולן מחקר נברסקה המזרחי ומרכז סיומת של יד מיד, נברסקה לקבלת תיאור מלא באתר בסעיף התוצאות. N1 היא הנמוכה (56 ק ג N חה אוריאה-1 ) ו- N2 (112 ק ג N חה אוריאה-1 ) הוא הקצב חנקן גבוה יותר היה מוחל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> איור 2: בטא גיוון ניתוח משווה את ההרכב מיקרוביאלית סוגי דגימה שונים כולל endosphere, rhizosphere מהאדמה הדגימה עשב רב שנתי בשנת 2014- הניתוח בוצע באמצעות סקריפט פיתון ב QIIME1.9.1 כדי לייצר המטריקס dissimilarity קרטיס בריי. ניתוח נקודות הציון העיקריות (PCoA) המבוסס על המטריצה dissimilarity בריי קרטיס היה מדמיין ב- RStudio. PCoA1 ו- PCoA2 לציין את השונות הראשון והשני בגודלו מוסברת על ידי הניתוח PCoA. ניתוח סטטיסטי PERMANOVA בוצעה כדי לקבוע את המשמעות בין סוגי מדגם, ו p הערך מוצג בפינה הימנית העליונה. לכל סמל ספרתית מייצגים את הקהילה כולה מיקרוביאלי עבור כל דגימה. (א) סוגי מדגם Endosphere, rhizosphere ואדמה נותחו ביחד. כל הדגימות 87 היו לשאוף כדי רצפים 486 לדגימה. (B) Rhizosphere וקרקע נותחו ביחד. כל הדגימות 59 היו דליל עם רצפי 8231. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> איור 3: אלפא גיוון ניתוח באמצעות שאנון אינדקס עבור כל המינים endosphere, rhizosphere, אדמת. הניתוח בוצע באמצעות סקריפט פיתון ב QIIME1.9.1. Rarefaction נעשה עבור endosphere, rhizosphere, סוגי קרקע מדגם בהתאמה עם רצפי 486, 17154, 8231 לדגימה. תיבות מציינות את percentiles 25 ו-75 (רביעונים הראשון והשלישי). הקו האופקי בתוך התיבה מציינת את החציון ואת האדום בנוסף מציג את הממוצע. . שפם להציג את טווח הנתונים למעט ליניאריים (אשר מוצגים כנקודות שחורות) שנפל פי 1.5 יותר מאשר את טווח בין רבעוני (n = 6 עבור כל דגימה. אלא בשביל גראמה sideoats לערבב איפה n = 5). האינדקס שאנון של כל חמישה מינים endosphere היו נמוכות יותר הן rhizosphere והן אדמה. מבחן-פרמטרית של סכום דרגה Wilcoxon שימש כדי לקבוע את המשמעות בין המינים, רק הבדלים משמעותיים בין המינים הוצגו על גבי הארגזים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> איור 4: השפע היחסי על רמת מערכה ב endosphere, rhizosphere, ו אדמה. דוגמאות נותחו כדי להשוות בין השפע של חיידקים phyla בין סוגי מדגמים שונים (n = 29 לכל סוג הדגימה). הניתוח בוצע באמצעות סקריפט פיתון ב QIIME1.9.1 מן הטבלה OTU. הצבעים השונים בתוך תרשים העוגה מציינות את phyla. האחוז מציין שפע יחסי של כל מערכה ב כל סוג הדגימה. המידע מערכה היה להן ביאורים באמצעות Ribosomal מסד נתונים פרוייקט מסווג (RDP)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> איור 5: ניתוח באמצעות טיפול כגורם מגבילה בין כל סוגי דגימה. ניתוח הקנוני של נקודות הציון העיקריות (CAP) ניתוח בוצע כדי לקבוע אם היו הבדלים בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין הטיפולים. הטיפול N, n = 42 עבור N1 (56 ק ג N חה-1) ו- n = 45 עבור N2 (112 ק ג N חה-1). המטריצה dissimilarity קרטיס בריי נוצר באמצעות סקריפט פיתון ב QIIME1.9.1. ניתוח שווי בהתבסס על המטריצה dissimilarity קרטיס בריי נעשה על ידי הגבלת הטיפול כגורם ב- RStudio. PERMANOVA ניתוח בוצע כדי לקבוע אם היו הבדלים טיפול משמעותי, ואת הערך p מוצג בפינה הימנית העליונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> איור 6: ניתוח באמצעות מיני צמחים כגורם מגבילה בין כל סוגי דגימה. הניתוח נערך כדי לקבוע אם היו הבדלים בהרכב הקהילה מיקרוביאלי בין מינים בכל סוגי הדגימה. תיאום קואורדינטות העיקרי וניתוח כובע של כל סוגי דגימה (endosphere, rhizosphere ואדמה) עשו שימוש במטריצה dissimilarity קרטיס בריי. המטריצה dissimilarity קרטיס בריי נוצר באמצעות קובץ ה-script פיתון ב- QIIME1.9.1. ניתוח שווי בהתבסס על המטריצה dissimilarity קרטיס בריי נעשה על ידי המגביל את מיני צמחים כגורם ב- RStudio. ניתוח סטטיסטי PERMANOVA בוצעה כדי לקבוע את המשמעות בין מיני צמחים, ו P הערך מוצג בפינה הימנית העליונה. לכל סמל ספרתית מייצג את הקהילה כולה מיקרוביאלי עבור הדגימה. n = 18 עבור כל המינים בכל סוגי דגימה פרט n = 15 המיקס גראמה sideoats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> איור 7: דוגמה של ניתוח שווי שימוש מינים כגורם מגבילה עבור כל סוג הדגימה בנפרד. תיאום קואורדינטות העיקרי וניתוח כובע של כל סוג הדגימה (endosphere, rhizosphere ואדמה) באמצעות מטריצת dissimilarity קרטיס בריי. כל סוג המדגם היה דליל 486, 17154 של קריאות 8231 לדגימה בהתאמה ב endosphere, rhizosphere ו אדמה. מינים שימש כגורם כדי להגביל את ההסמכה. ניתוח סטטיסטי PERMANOVA בוצעה כדי לקבוע את המשמעות בין מינים בסוג כל דגימה, ו p הערך מוצג בפינה הימנית העליונה. לכל סמל באיור מייצג את הקהילה כולה מיקרוביאלי עבור כל דגימה. גודל המדגם הוא n = 29 לכל סוג הדגימה, n = 6 עבור כל מיני צמחים לכל סוג הדגימה חוץ המיקס גראמה sideoats (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

חפירה של שורשי צמחים מן השדה, כמו גם עיבוד של דגימות לתוך endosphere, rhizosphere ואדמה מתוארים בפירוט, כולל הפקת דנ א ושיטות ניתוח הנתונים. נייר זה נועד לאפשר מעבדות אחרות שימוש בטכניקות אלה לצורך המחקר של קרקע, endosphere, rhizosphere microbiomes.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביום של הקרקע, הריזוספרה והאנדוספרה של השורש, כגון כיצד מגוון הקהילה המיקרוביאלית משתנה בתגובה לסוג הדגימה, הטיפול והגנוטיפ של הצמח. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהיא מתאימה היטב לניסויי שדה הדורשים מספרי דגימה גדולים ושכפול. מי שמדגים את ההליך יהיו אני וסטפני פוטרל, סטודנטית לתואר שני וטכנאית מחקר מהמעבדה שלי.כדי להתחיל את הפרוטוקול, סמן תבנית כביסה ודלי עם פתק דביק עם פרטי דגימת הצמח. נשא את הדלי המסומן למגרש והשאיר את מחבת הכביסה בתחנת העבודה שהוקמה בשטח. בחר ואסוף באופן אקראי שני צמחים לכל חלקה מאזורים שונים בתוך החלקה.לאחר מכן, חודרים את האדמה בעזרת חפירה לעומק של 30 סנטימטרים כדי לחתוך כל אחד מהשורשים הרוחביים המחזיקים את הצמח באדמה. חפרו את שורשי הצמח על ידי מינוף האת והניחו את כדור השורש בדלי המסומן. החזר את הדלי לעמדת העבודה בשטח.נענע את השורשים והשתמש בכף או במשיכה ידנית כדי להסיר אדמה מהשורשים. ללבוש כפפות ולהניח את השורשים ליד תחנת העיבוד. לאחר ניעור השורשים, מערבבים את האדמה בתבנית הכביסה ומפרקים את כל גושי האדמה בעזרת טילר כף יד.הניחו דגימת אדמה נקייה מפסולת לתוך שקית אחסון עם רוכסן בגודל 17.7 על 19.5 ס"מ והניחו אותה על קרח. עקר מספריים גיזום באתנול 70%. השתמש במספריים הסטריליים כדי לכרות מגוון שורשים, כארבעה עד שישה שורשים לצמח וכל שורש באורך של כ-9 עד 12 סנטימטרים.הנח את השורשים הכרותים בשפופרת מסומנת של 50 מיליליטר המכילה 35 מיליליטר של מאגר פוספט אוטוקלאב עם חומר פעילי שטח כגון Silwet L-77. לנער את הצינורות במשך שתי דקות כדי לשחרר את הריזוספרה מפני השטח של השורשים. שפר את הטלטול בעזרת גנרטור ומערבולת.בעזרת מלקחיים מעוקרים באתנול 70%, הוציאו את השורשים מהצינור, נגבו אותם לזמן קצר על מגבות נייר והניחו אותם בצינור חדש עם תווית של 50 מיליליטר. הנח גם את הצינור המכיל את הריזוספרה וגם את זה המכיל שורשים על קרח. הוסף כ-35 מיליליטר של 50% אקונומיקה בתוספת 0.01% טווין 20 לצינורות של 50 מיליליטר עם שורשים שנאספו בשדה.מערבל או מנער את הצינורות למשך 30 עד 60 שניות. יוצקים את האקונומיקה, מוסיפים 35 מיליליטר אתנול 70%, ומערבלים או מנערים את השורשים למשך 30 עד 60 שניות נוספות. לאחר הטלטול, שפכו את האתנול 70% והוסיפו 35 מיליליטר מים סטריליים וטהורים במיוחד ומערבולת או נערו את הדגימה למשך דקה.חזרו על שלב השטיפה במים פעמיים נוספות כדי שהשורש יקבל בסך הכל שלוש שטיפות במים סטריליים וטהורים במיוחד. כתם את השורשים על מגבות נייר יבשות ונקיות והשתמש במגבת נייר נקייה לכל דגימה. בעזרת מלקחיים סטריליים ומספריים גיזום, חותכים את השורשים לחתיכות של כחמישה מילימטר ומניחים שורשים חתוכים בצינור חרוטי נקי ומסומן בנפח 15 מיליליטר, ואז מאחסנים את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.נער את הצינורות של 50 מיליליטר המכילים דגימות ריזוספרה מהשדה למשך 20 עד 30 שניות כדי להשעות מחדש את הדגימה כולה. בעזרת מסננת תאי רשת סטרילית של 100 מיקרון, סנן את הדגימה המושעה מחדש לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב -3, 000 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.שפכו מיד והשליכו את הסופרנטנט. הניחו את כדורי הריזוספרה בצינורות של 50 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר של מאגר פוספט סטרילי ללא פעילי שטח לכדורי הריזוספרה ומערבל אותם כדי להשעות מחדש את הדגימה.הכניסו את הנוזל המרחף לתוך צינור מיקרופוגה נקי ומסומן בנפח שני מיליליטר. סובב את הצינורות בחום של 15, 871 פעמים גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. שופכים מיד את הסופרנטנט ומסננים את הצינורות על מגבות נייר נקיות.אחסן את הכדורים במינוס 20 מעלות צלזיוס עד להמשך עיבוד. בעזרת מרית מתכת סטרילית, מלאו צינור נקי ומסומן של שני מיליליטר בכשלושה גרם אדמה למיצוי DNA והימנעו מחתיכות שורש קטנות ופסולת. שטפו את מרית המתכת ב-70% אתנול בין כל דגימה.אחסן את דגימת האדמה הזו במינוס 20 מעלות צלזיוס. במחבת כביסה נקייה, רוקנו את שקית האדמה למסננות מוערמות עם המסננת הגדולה יותר על גבי המסננת הקטנה יותר ונפו ידנית את האדמה דרך שתי המסננות. השתמש במברשת כדי לנקות בזהירות את המסננות בין הדגימות.הניחו בצד 100 עד 125 גרם אדמה מנופה בשקית עם רוכסן בגודל 17.7 על 19.5 ס"מ לניתוח פיזיקוכימי ומרקם עתידי של הקרקע. הניחו את שקיות האדמה בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר. לאחר מכן, שפכו חנקן נוזלי לכוס פלסטיק עם מרית נקייה ובמכתש נקי.מניחים את הרקמה הקפואה במכתש וטוחנים אותה עם העלי לאבקה דקה. הוסף ללא הרף חנקן נוזלי במהלך הטחינה כדי לשמור על דגימות קפואות. השתמש במרית כדי להעביר את רקמת הקרקע בצינור נקי ומסומן של שני מיליליטר ולאחר מכן אחסן את הרקמה במינוס 80 מעלות צלזיוס.נגב את אזור העבודה עם 70% אתנול ו-1% אקונומיקה ביתית. הסר את דגימות האדמה מהאחסון של מינוס 20 מעלות צלזיוס והפשיר אותן בדלי קרח. הסר את מכסה שטיח האיטום מצלחת חילוץ של 96 בארות והנח את המכסה בין שני מגבוני נייר כדי לשמור על ניקיונו בזמן שאינו בשימוש.מכסים את 12 עמודות הצלחת ברצועות PCR דביקות עם 8 בארות כדי למנוע זיהום. משפך משקל סטרילי בגודל קטן על משקל ושוקל 200 עד 250 מיליגרם אדמה. הרם בזהירות את רצועת הדבק כלפי מעלה, הנח את צוואר משפך השקילה המלא לבאר המתאימה, והנח בעדינות את דגימת האדמה לבאר המתאימה.החזר את רצועת ההדבקה לכיסוי הבאר. חזור על תהליך זה עבור כל באר, באמצעות משפך סטרילי חדש לכל דגימה. החזר את מכסה שטיח האיטום על צלחת החילוץ ואחסן את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה למיצוי DNA.הסר את דגימות הריזוספרה מהאחסון של מינוס 20 מעלות צלזיוס והפשיר בדלי קרח. הכן את צלחת מיצוי ה-DNA כפי שנעשה בסעיף הקודם. הניחו מגבון נייר נקי על סולם, ואז טרפו מרית מתכת סטרילית על המשקל.השתמש במרית כדי לגרוף בזהירות חלק מכדור הריזוספרה מצינור דגימה. שוקלים בין 200 ל-250 מיליגרם של דגימת הריזוספרה. הרם בזהירות את רצועת ההדבקה כדי לחשוף את הבאר הראשונה של לוחית החילוץ.זווית את המרית המלאה לבאר ומגרדים את חומר הריזוספרה לבאר המתאימה בעזרת קיסם סטרילי. שוטפים את מרית המתכת במים ואחריה 70% אתנול בין הדגימות. לבסוף, חזור על תהליך זה עבור כל באר בצלחת עד שהצלחת מתמלאת, והשאיר באר אחת ריקה כבקרת חילוץ ריקה.במערך נתונים מייצג זה, היו הבדלים משמעותיים ביותר בין סוגי הדגימה, ונראה כי הריזוספרה והקרקע דומים יותר בהרכבם זה לזה מאשר השורש. ניתוח נוסף מראה שהיו גם הבדלים משמעותיים ביותר בהרכב הקהילה המיקרוביאלית בין ריזוספרה לאדמה. ניתוח מגוון אלפא מראה שהקהילות המיקרוביאליות באנדוספרה היו נמוכות יותר מקהילות באדמה ובריזוספרה.ההבדל המשמעותי היחיד במגוון בין מיני העשב היה בין דגימות האנדוספרה של גבעול כחול גדול ועשב מתג. ניתוח השפע היחסי מדגיש את הדומיננטיות של פרוטאובקטריה ואחריה אקטינובקטריה בכל סוגי הדגימות. הקרקע והריזוספרה נשלטים על ידי חומצה וכלורופלקסי, בעוד שבשורשים היה שפע יחסי גדול יותר של בקטריודטים.ניתוח PERMANOVA של כל סוגי הדגימות הבהיר הבדל משמעותי ביותר בהרכב הקהילה המיקרוביאלית עקב מיני צמחים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע סדרה של צעדים לשימוש בחקר המיקרוביום של אדמה, אנדוספרה וריזוספרה. ברצוננו להודות ל-EPSCoR של נברסקה ולתוכנית תשתית המחקר EPSCoR של הקרן הלאומית למדע על המימון החלקי של הסרטון החינוכי הזה.

isolation-analysis-microbial-communities-soil-rhizosphere-roots

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

אנו מציגים שיטות להערכת סיכון טריפה איך יכול לשנות את האיכות הכימית של טרף אוכלי עשב על ידי גרימת שינויים תזונתיים כדי לעמוד בדרישות מוגבר של לחץ, ואיך הריקבון של פגרים מאוכלי עשב הלחוצים אלה מאט פירוק המלטת צמח לאחר מכן על ידי חיידקי קרקע.

קישור סיכוני טריפה, מתח פיסיולוגי אוכלי עשב ופירוק מיקרוביאלית המלטת צמח

הבנת התפקיד של הטרוגניות סביבתית בקיום מין יש בדרך כלל מתמקד בסוגים של הטרוגניות שהם חיצוניים להרכב המינים של הקהילה. אנו מספקים שיטות מפורטות רומן ליצירת טיפולי ההטרוגניות אדמה באמצעות קרקעות כפופות לאוויר צמח אדמת משוב, או הטרוגניות מהותית בהרכב הקהילה.

פרוטוקול ניסוי להטרוגניות קרקע מושרה צמח מניפולציה

המאמר מתאר שיטה מגדילה את התפוקה תוך איזון המאמץ והדיוק של מיצוי שומנים מתוך קרום התא של מיקרואורגניזמים לשימוש באפיון שתי ליפידים סה"כ ואת השפע היחסי של שומנים מחוון כדי לקבוע מבנה הקהילה מיקרוביאלית הקרקע במחקרים עם דוגמאות רבות.

ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

כאן אנו מתארים ידרופוני צמח שיטת הצמיחה כדי נוכחות המינים ככמת ולהמחיש את התפלגות מרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברתם לסביבות צמיחה שונות.

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

אנו מתארים פרוטוקול לדוגמה, שימור וקטע שורשים שלמים ואת אדמת הריזוספירה שמסביב מסביבות ביצות באמצעות אורז(Oryza sativa L.) כמין לדוגמה. לאחר שהשתמרה, ניתן לנתח את הדגימה באמצעות טכניקות הדמיה אלמנטריות, כגון הדמיית פלואורסצנטיות כימית של קרני רנטגן סינכרוטרון (XRF).

שיטה לשימור שורשי ביצות וריזוספרות להדמיה יסודית

מוצרים מבוססי גלייפוסט (GBP) הם קוטלי העשבים הנפוצים ביותר בספקטרום רחב ברחבי העולם. במאמר זה אנו מציגים קווים מנחים כלליים לכימות ההשפעה של GBP על מיקרוביום, מניסויי שדה ועד ניתוחי ביואינפורמטיקה.

כימות ההשפעה הפוטנציאלית של מוצרים מבוססי גלייפוסט על מיקרוביום

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

פרוטוקול זה מציג סיכום מפורט של אסטרטגיות לחיסון שורשי צמחים עם מיקרובים הנישאים באדמה. דוגמאות לפטריות Verticillium longisporum ו-Verticillium dahliae, מתוארות שלוש מערכות שונות של זיהום שורשים. יישומים פוטנציאליים וניתוחים אפשריים במורד הזרם מודגשים, ויתרונות או חסרונות נדונים עבור כל מערכת.

אסטרטגיות חיסון להדבקת שורשי צמחים במיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע

כאן מוצג הליך מהיר וסטנדרטי להקמת קהילות ביופילם סינרגטיות מרובות מינים מקרקעות ריזוספרה שונות. זהו פרוטוקול ייחודי שנועד לחקור ולדמות את המיקרוביוטה המורכבת של קרקע ריזוספרה.

גישה לבניית קהילות ביופילם רב-מינים מאדמת ריזוספרה

כאן אנו מציגים מחקר שהוקם ב-iDiv Ecotron, תאי מזוקוסמוס יבשתיים עם תנאים סביבתיים מבוקרים מעל ומתחת לאדמה, כדי לחקור את ההשפעות העצמאיות והאינטראקטיביות של היסטוריית הצמחים וההיסטוריה של הקרקע על תפקוד המערכת האקולוגית של קהילות עשב לאורך שיפוע מגוון צמחים.

JenaTron - גישה ניסויית לחקר ההשפעות של היסטוריית הצמח וההיסטוריה של הקרקע על תפקוד המערכת האקולוגית של העשב

למדו שיטות לבידוד וניתוח קהילות מיקרוביאליות בקרקע, ריזוספירה ושורשים עבור מחקר אקולוגיה מיקרוביאלית. פרוטוקולים סטנדרטיים אלו מאפשרים ניסויים שדה בקנה מידה גדול עם תוצאות ברות שחזור.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

גלה סרטונים נוספים