אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה. כגון, קביעת האופן שבו יחסי תת-קבוצה של מונוציטים, או ביטוי של סמנים שונים, משתנים במצבי מחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא כי התאים קרובים למצבם המקורי, כי הוראות ברורות והצדקה משמשים, כדי לספק שיטת gating מתוקנת.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק, כי מאמרים רבים אינם נותנים הוראות ברורות על איך gating של התאים בוצע. התחל פרוטוקול זה עם איסוף דגימות דם וקביעת ספירת תאי הדם הלבנים, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לדלל את הדם עם מלוחים מאגר פוספט, כדי להתאים את הריכוז כ 5 מיליון תאי דם לבנים למיליליטר.

הכינו תערובת ראשית מספקת למספר הצינורות על ידי שילוב דם, אנטי CD14-V450, אנטי CD16-APC ואנטי HLA-DR-PerCP. וורטקס ופיגט 51.9 מיקרוליטרים של תערובת לתוך כל צינור. הוסף PE שכותרתו M1 ו M2 סמן נוגדנים, כמו גם סמנים עבור תאי T, תאי B, נויטרופילים, ותאי רוצח טבעיים לצינורות המתאימים שלהם.

מערבולת ודגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. עכשיו, להוסיף 250 microliters של תזה תאי דם אדומים משולבים ותויר תיקון תאי דם לבנים, ומיד מערבולת את התערובת, בעדינות. דגירה תערובת מערבולת במשך 10 דקות בחושך, בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר 10 דקות, להוסיף 250 microliters של PBS ולסובב את התאים ב 260g, במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את העל-טבעי, ולחץ מחדש על התאים ב- 300 מיקרוליטרים של 1%פורמלדהיד. לאחסן את התאים בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור עד ניתוח מבוצע.

ציטומטריית זרימה צריכה להיעשות תוך 48 שעות מהכנת הדגימה. כדי להתחיל, בדוק את יומן ציטומטר הזרימה כדי לוודא צוות המתקן ביצע בדיקות בקרת איכות. כדי להגדיר את ניסוי ציטומיית הזרימה, לחץ על ניסוי חדש, ואחריו דגימה חדשה צינור חדש, כדי להוסיף צינורות.

בחר התוויות bivariate, על-ידי לחיצה על הסמל ולהשתמש בתפריטים הנפתחים כדי לבחור את פרמטרי הגישה. ודא הכללה של התוויית CD16/CD14 ותוויה המציגה גלאי לצד הזמן, כדי לפקח על הרכישה. הכנס את הצינור ולחץ, לרכוש.

בדוק את הגדרות המתח של המכשיר, ודא כי אותות הגלאי אינם מחוץ לקנה המידה. שים לב לתאים הנופלים בשער המונוציטים של העלילה CD14/CD16. הגדר את סף ההקלטה ל- 5,000 אירועים עבור שער המונוציטים הקלאסי ולחץ על הקלטה.

המשך לתעד נתונים עבור הצינורות הנותרים. לאחר נתונים עבור כל הצינורות נרשם, לייצא את נתוני הזרימה כקבצי fcs לניתוח. כדי לבצע גתות מונוציטים, פתח קבצים בתוכנת הניתוח, לחץ פעמיים על שם הצינור ובחר פרמטרים מהתפריטים הנפתחים כדי להמחיש את התאים באזור פיזור קדימה לעומת התוויית גובה פיזור קדימה.

צור שער אי-הכללה כפול, על-ידי לחיצה על סמל הכלי שער מצולע והקף את התאים. בחר את התאים המגודרים על ידי לחיצה כפולה על האזור המגודר. בתיבת התצוגה החדשה, התאם פרמטרי תפריט נפתח כדי להציג את התאים באזור פיזור קדימה לעומת התוויית אזור פיזור בצד.

לחץ על סמל השער המלבני, ובחר בנדיבות את אוכלוסיית המונוציטים, המבוססת על תכונות פיזור קדימה וצד, כדי לא לכלול את רוב הלימפוציטים, תאי הרוצח הטבעיים והגרנולוקיטים. בחר את התאים המגודרים והו הצג מחדש בעלילה CD14/CD16 ובחר את הפרמטרים באמצעות התפריטים הנפתחים. לחץ על שער המצולע, כדי לבחור מונוציטים בהתבסס על הצורה האופיינית שלהם, הפוכה l.

אם האוכלוסייה הלא קלאסית אינה נבדלת מהתאים משמאלה, אז זיהום סביר ויש לחקור אותו. בחר את התאים המגודרים והצג את המונוציטים בעליווית CD/16 HLA-DR, באמצעות התפריטים הנפתחים כדי לבחור פרמטרים. לחץ על שער מצולע כדי לבחור את התאים החיוביים HLA-DR, ולא לכלול את כל התאים הרוצח הטבעי הנותרים נויטרופילים.

בחר את התאים המגודרים והצג את התאים החיוביים HLA-DR בעלילה CD14/HLA-DR באמצעות תפריטים נפתחים לבחירת פרמטרים. לחץ על שער מצולע, ולצייר שער כדי לא לכלול את HLA-DR גבוה / CD14 תאים B נמוך. בחר את התאים המגודרים ולהשתמש בתפריטים הנפתחים כדי להציג אותם בעלילה CD16/CD14.

מתוך אפשרויות התוויית נתונים, בחר חלקת זברה, שתאפשר לצייר שערי תת-קבוצה של מונוציטים, כדי לקבוע פרופורציות של תת-קבוצה. עכשיו, לחץ על סמל השער המלבני, ובחר את המונוציטים הקלאסיים על ידי ציור שער מלבני משוער סביב CD14 גבוה / CD16 אוכלוסיית מונוציטים קלאסית נמוכה. תחת תצוגה, בחר, הצג חציונים, כדי להציג את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית עבור מונוציטים קלאסיים.

התאם את השער כך שלאוכלוסייה יש התפלגות שווה מהחציון משמאל ומימין, והוא מקיף את כל התאים משמאל. בחר את אוכלוסיית הביניים על-ידי ציור שער מלבני המקיף את התאים מימין לשער הקלאסי. התאם את תחתית השער כך שלא יכלול את התאים הלא קלאסיים, על-ידי יישור השער לתחתית המעגלים הקונצנטריים, שהם לגמרי בתוך שער המונוציטים הקלאסי.

שער את קבוצת המשנה הלא קלאסית, על-ידי ציור תיבה מלבנית כלפי מטה מהקצה התחתון של קבוצת המשנה הבינונית, תוך בחירת כל התאים לתחתית האוכלוסיה. תחת תצוגה, בחר, הצג תדרי שער, כדי לקבוע את האחוז של כל קבוצת משנה של מונוציטים. לבסוף, בחר תאים מכל קבוצת משנה של מונוציטים.

שנה את הפרמטרים הנפתחים כדי ליצור היסטוגרמה עבור כל קבוצת משנה של מונוציטים, המציגה כל סמן. לאחר מכן, חשב את מידת הביטוי, באמצעות ממוצע חציוני או גיאומטרי, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. אוכלוסיות מונוציטים מגודרות בהצלחה מוצגות כאן.

והממדים בקנה אחד עם אלה בספרות. הפרופורציות עבור מדגם זה חושבו כ- 88.1% קלאסי, 4.33% ביניים ו- 7.49% לא קלאסיים. על ידי הערכת המיקום היחסי של אוכלוסיות אחרות, ברור כי תאי T ונויטרופילים המוצגים כאן בכחול, בצע גם מחוץ למונוציטים, צורה l הפוכה, על עלילה CD16/CD14.

עם זאת, הן תאי הרוצח הטבעיים והן אוכלוסיות תאי B, המוצגים כאן בכחול, חופפים לאוכלוסיית המונוציטים הלא קלאסית. מפות חום המאשרות כי סוגי תאים מזהמים הוסרו, מוצגות כאן. התאים הרוצח הטבעי כבר מגודרים על ידי שלב HLA-DR CD16, ואילו, תאי B כבר מגודרים על ידי שלב HLA-DR CD/14.

הביטוי של סמני M1 ו- M2 בכחול, יחסית לפקדי האיאוטיפ שלהם באדום, מוצג כאן. CD120b סמן M1, מציג תזוזה ברורה מעל פקד האיסוטיפ שלו, עבור כל קבוצות המשנה של המונוציטים. זה גם המקרה עבור CD93 סמן M2, עם ביטוי להיות גבוה יותר קלאסי, מתון על ביניים נמוך על לא קלאסי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כדי להבטיח תאים מזהמים מגודרים החוצה, כפי שהם יכולים אחרת לתרום ביטוי לכמת. בעקבות הליך זה, סמנים אחרים עשויים להיבדק. על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון, כיצד ביטוי סמן מונוציטים משתנה במחלה.

אל תשכח כי עבודה עם דם אנושי פורמלדהיד יכול להיות מסוכן, ולכן אמצעי זהירות כגון, ציוד מגן אישי, ושימוש מכסה המנוע biohazard, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.