חניכה הדור, על פי דרישה חריפה פעילות התקפי. מכרסם, רקמה אנושית
19 בינואר 2019
מודלים התקף אקוטי חשובים ללמוד המנגנונים אפילפטית אירועים. יתר על כן, היכולת להפיק אפילפטית אירועים לפי-דרישה מספק שיטה יעילה במיוחד ללמוד רצף האירועים שבבסיס בהכנסתם המדויק. כאן, אנו מתארים את הדגמים פרכוס קורטיקלית פמפרידין חריפה נוסדה בשנת רקמה אנושית של עכבר.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר מנגנוני ההתקף, כגון אילו תת-תפוקות עצביות אחראיות להתקפיים אלקטרוגרפיים ולסיום. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא יכולה לשחזר אירועי התקף אלקטרוגרפי, על פי דרישה, ובמודלים vivo ו- in vitro המזכירים את אלה שנצפו קלינית. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לחפש טיפולים פוטנציאליים נגד התקפים, על ידי ניסיון לעורר אירועי התקף אלקטרוגרפי במהלך היישום של מועמדים שונים נגד התקפים סמים.
כדי להכין את פרוסות קליפת המוח, הדבק את רקמת המוח preclinical על הבמה Vibratome, באמצעות דבק דבק מיידי. מניחים בעדינות את מחזיק הדגימין במגש החיץ. תבטח שהחלק הגבי של המוח פונה ללהב של הויברטום.
פורסים את המוח לחלקים בעובי 450 מיקרומטר, בכיוון הגב עד הגחון. בצע את החתך הראשון במוח החיה preclinical כדי להסיר את נורת הריח. לאחר מכן, בצע את החתכים הבאים עד שהאזור המוטורי somatosensory הוא ציין.
השתמש פיפטה משעמם רחב. מעבירים את פרוסות הקרונטל הממוקדות לצלחת פטרי המכילה תסכולת ניתוח קרה. לפרוסות הקורונאליות, בצעו חתך רוחבי ממש מתחת לקומיסר הניאו-קליפתי, ולאחר מכן, חותכים בקו האמצע כדי להפריד בין ההמיספרות.
לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח חדש כדי לחתוך כל רקמה עודפת מהפרוסות. זה קריטי לבצע את הליך חיתוך המוח ביעילות. כל רגע רקמת המוח אינה שקועה ב- ACSF, מזיקה לאיכותה.
רקמת מוח פגומה ואיכותית פחות נוטה פחות ליצור אירועי התקף אלקטרוגרפי. מעבירים לרגע את החלק הגבי של פרוסות הקורונל, המכילות את קליפת המוח הניאו, לצלחת פטרי שנייה במילוי 35 מעלות צלזיוס ACSF. לאחר מכן, מיד להעביר את הפרוסות לתא הדגירה, המכיל 35 מעלות צלזיוס פחמימות ACSF.
השאירו את פרוסות המוח שקועות מעט בתא הדגירה ב 35 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר את תא הדגירה מן אמבט המים ולאפשר לו לחזור לטמפרטורת החדר. המתן שעה עד שפרוסות המוח יתאוששו, לפני ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
בהליך זה, לגזור נייר עדשה כי הוא קצת יותר גדול מאשר פרוסת המוח. השתמש פיפטה רחב נשא או מברשת פירוט כדי להעביר פרוסת מוח על נייר עדשה לגזור כי הוא החזיק במקום באמצעות פינצטה שיניים. לאחר מכן, להעביר את נייר העדשה עם פרוסת מוח לתא ההקלטה, ולאבטח אותו למקומו עם מסך נבל.
לאחר מכן, שפע את פרוסת המוח בתא ההקלטה עם ACSF פחמימות ב 35 מעלות צלזיוס בקצב של שלושה מיליליטר לדקה. השתמש במדחום דיגיטלי כדי להבטיח שתא ההקלטה יהיה 33 עד 36 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, למילוי לאחור אלקטרודות זכוכית עם 10 microliters של ACSF, באמצעות מזרק המילטון.
מתחת לסטריאומיקרוסקופ פי 20, הנחה את אלקטרודה הזכוכית ההקלטה לשכבה הקורטיקלית השטחית, שתיים, שלוש, באמצעות מניפולטורים ידניים. הצג את הפעילות החשמלית של פרוסת המוח עם תוכנה סטנדרטית. כדי לגרום לפעילות דמוית התקף אלקטרוגרפי, יש לפזר את פרוסת המוח ב-ACSF המכילה 4-AP ב-100 מיקרו-מולאר.
הצג את הפעילות החשמלית של פרוסת המוח עם תוכנה סטנדרטית. כדי ליצור אירועים דמויי התקף אלקטרוגרפי, באמצעות אסטרטגיה אופטוגנטית על פרוסות המוח מעכברים אופטוגנטיים, השתמש מניפולטור ידני כדי למקם סיב אופטי בקוטר 1,000 מיקרון ישירות מעל אזור ההקלטה. החל פולס קצר של אור כחול כדי ליזום אירוע ictal.
תוכנית מבוססת MATLAB ידידותית למשתמש פותחה במיוחד כדי לזהות ולסווג את הסוגים השונים של אירועי אפילפטיפורם המתרחשים במבחנה ובמודלים התקפים 4-AP. תוכנית זיהוי זו זמינה ממחזר GitHub של מעבדות ואליאנטה. היישום של 100 micromolar 4-AP באיכות טובה 450 מיקרון בגודל פרוסות המוח קליפת המוח מעכבר VGAT channelrhodopsin לנוער, אמין המושרה אירועים דמויי ictal חוזרים בתוך 15 דקות.
היישום של 100 micromolar 4-AP לפרוסות באיכות ירודה, הביא אירועים מתפרצים או פעילות spiking. בממוצע, 40% מהפרוסות מכל מוח פרה-קליני נותח, יצרו בהצלחה אירועים דמויי ictal. יתר על כן, 83% מהעכברים שנותרו גרמו לפחות לפרוסת מוח אחת שיצרה בהצלחה אירועים דמויי ictal.
בפרוסות מוח עם אירועים דמויי ictal המתרחשים באופן ספונטני, היישום של פעימת אור קצרה של 30 אלפיות שנייה על פרוסת המוח, עורר באופן אמין אירוע דמוי ictal שהיה זהה במורפולוגיה. אותם ממצאים נעשו בפרוסות מוח מתעלה אחת שלך שני עכברים. לכן, ללא קשר לאיזה תת-תפוקה עצבית הופעלה, כל אירוע סנכרון קצר ברשת העצבית הקורטית המבודדת, הוביל להתפרצות של אירוע דמוי ictal.
אירועים דמויי ictal אלה הורכבה מספייק סנטינל, ירי דמוי טוניק, ירי דמוי קלוני ופעילות דמוית פרץ לקראת הסוף. הם היו דומים בטבע לחתימות האלקטרוגרפיות הקשורות להתקפים קליניים. בעקבות הליך זה, סוגים אחרים של מעברים מצב המוח יכול להתבצע כדי לענות על שאלות כמו, מה הם מנגנונים ביולוגיים נוירו שבבסיס מעברי מצב המוח?
וכיצד אנו יכולים לווסת את המעברים האלה כדי למנוע כניסה למצבי מוח פתולוגיים שונים?
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בשימוש במודלים של פרכוסים חריפים, ובפרט בשימוש ב-4-aminopyridine, כדי לחקור את המכניזמים של פעילות אפילפטית ברקמות קורטיקליות של עכברים ובני אדם. היכולת להשרות אירועי פרכוסים אלקטרוגרפיים לפי דרישה מאפשרת בחינה מפורטת של התנהגות נוירונלית הקשורה לתחילת הפרכוס ולסיומו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- מחקר על אפילפסיה
רקע
- הבנת המנגנונים העומדים בבסיס פרכוסים היא קריטית לפיתוח טיפולים יעילים.
- מודלים של פרכוסים חריפים מאפשרים תצפית בזמן אמת על דינמיקת הפרכוסים.
- הקלטות אלקטרופיזיולוגיות חושפות תובנות לגבי התחלה והפצה של פרכוסים.
- לטכניקה זו פוטנציאל ליישומים בבדיקת תרופות אנטי-אפילפטיות.
מטרת המחקר
- לחקר תתי-אוכלוסיות עצביות האחראיות לתחילתן ולסיומה של פרכוסים.
- להערכת היעילות של טיפולים פוטנציאליים נגד פרכוסים באופן מבוקר.
- לבחינת האפיון של אירועים דמויי-פרכוס (ictal-like events) בחתכי מוח קורטיקליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המחקר השתמש בפרוסות חריפות של קליפת המוח שהוכנו מרקמות של עכברים ובני אדם.
- בוצעו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת פעילויות דמויות פרכוס שהושרה על ידי 4-aminopyridine.
- נעשה שימוש בפרוטוקולי חיתוך ודגירה מפורטים כדי להבטיח את חיוניות הרקמה.
- שולבו אסטרטגיות אופטוגנטיות להפעלת אירועים איקטליים באמצעות גרייה מדויקת באור.
- פותחה תוכנה מבוססת MATLAB לזיהוי וסיווג של אירועים אפילפטיפורמיים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול השראו באופן מהימן אירועים דמויי פרכוס (ictal-like events) בפרוסות מוח באיכות גבוהה תוך 15 דקות מהחלת 4-AP.
- נמצא כי ב-40% מהפרוסות נוצרו אירועים אלו בהצלחה, דבר המעיד על הכנה יעילה של הרקמה.
- התגובות כללו spikes מאותהימים (sentinel spike) אופייניים ושלבים שונים של פריקה המעידים על פעילות אפילפטית.
- תוצאות דומות נצפו במודלים שונים של עכברים, מה שמדגיש את חוסנו של הפרוטוקול.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה מהימנה להשראה ובחינה של פרכוסים אלקטרוגרפיים, ומספק תובנות לגבי המנגנונים הנוירונליים המעורבים באפילפסיה.
- הממצאים תומכים בחקר דינמיקת הפרכוסים in vivo ו-in vitro.
- הבנת מנגנונים אלו עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפול טובות יותר עבור אפילפסיה והפרעות קשורות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השראה לפי דרישה של אירועי פרכוסים אלקטרוגרפיים במודלים קורטיקליים אקוטיים מאפשרת חקירה מדויקת של המנגנונים העצביים העומדים בבסיס תחילתם וסיומם של פרכוסים. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות לאפילפסיה, על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית וניתנת לשחזור של השפעותיהם של תרכובים נוגדי פרכוסים על פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים מוגדרים. הרלוונטיות התרגומית מועצמת הודות לישימותה הן לרקמות של מכרסמים והן לרקמות אנושיות, מה שמקל על תיקוף בין-מיני של היפותזות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תתי-אוכלוסיות עצביות ספציפיות האחראיות על תחילת וסיום התקפים אלקטרוגרפיים באמצעות טריגר אופטוגנטי או פרמקולוגי.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכה האם מודולציה של מסלולים עצביים ספציפיים מונעת או משנה אירועים דמויי-אקטליים, ובכך תומך בבדיקת היפותזות לגבי מטרות טיפוליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר אירועים אלקטרוגרפיים דמויי פרכוסים הניתנים לכימות עם מורפולוגיה מוגדרת (spike מאותב, פריקה טונית-קלונית, פעילות התפרצויות) המתאימים לסריקה בעלת תוכן גבוה.
- ערך תפעולי: מאפשר השראה סטנדרטית של אירועים איקטליים באמצעות 4-AP, פולסים אופטוגנטיים או נפיחות של מוליכים עצביים, מה שמאפשר בדיקה עקבית של תרכובות בין מעבדות שונות.
- ערך מדעי: מקל על הערכת מועמדים לתרופות אנטי-אפילפטיות על ידי מדידת השפעתן על תדירות הפרכוסים, משכם או מאפיינים אלקטרוגרפיים במהלך השראה לפי דרישה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שימוש ברקמה קורטיקלית אנושית ליצירת אירועים דמויי-פרכוס (ictal-like events) בעלי רלוונטיות קלינית, דבר המשפר את הביטחון החזוי לגבי יעילות טיפולית.
- ערך תפעולי: תומך ברציפות מסריקה חריפה למודלים של אפילפסיה כרונית על ידי תיקוף העובדה שאירועים המושרים משחזרים חתימות אלקטרוגרפיות קליניות.
- ערך מדעי: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור מניפולציות נוירונליות ספציפיות לשינויים בדינמיקה של הפרכוסים, דבר המסייע בבחירת מטרה להמשך פיתוח פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת בדיקה רלוונטית פיזיולוגית לתיקוף מטרה וסריקת תרכובות לפני אופטימיזציה של מולקולות מובילות.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מנגנונים עצביים העומדים בבסיס התחלת פרכוסים, באמצעות השראה מדויקת ועל-פי דרישה של אירועים אפילפטיים (ictal events) ברשתות קורטיקליות.
- סריקה: מספק תוצאי אלקטרופיזיולוגיה כמותיים וניתנים לשחזור (תדירות אירועים, מורפולוגיה, משך זמן), החיוניים לסטנדרטיזציה של הבדיקה ולהשוואת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר זיהוי וסיווג של אירועים אפילפטיים באמצעות תוכנה מבוססת MATLAB, ובכך מספק מדדים אובייקטיביים להערכת השפעות של תרכובות על דינמיקת הפרכוסים.
- מחקר תרגומי: משתמש ברקמה אנושית כדי להבטיח רלוונטיות למחלה, ובכך מגשר בין ממצאי הגילוי למחקר קליני ופרה-קליני על אפילפסיה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה להערכת מנגנונים מגוונים למניעת פרכוסים במספר פרויקטים ובשיטות טיפול שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות במנגנונים נוירונליים של יצירת התקפים והפצתם.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והיכולת להרחבה של השראת התקפים ברקמות מכרסמים ובני אדם, ובכך תומך במכמרי סריקה רב-אתריים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות של קבלת החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית מהירה של השפעות תרכובים אנטי-אפילפטיים על נקודות קצה אלקטרופיזיולוגיות מוגדרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף תרכובים מותאם סיכון, בהתבסס על יכולתם לדכא או לשנות אירועים דמויי-איקטליים במודלים בעלי רלוונטיות קלינית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, חיתוך רקמות, וטכניקות להשראת פרכוסים באמצעות אופטוגנטיקה או פרמקולוגיה.
- תלוי במיכשור להקלטה אלקטרופיזיולוגית, פרפוזיה מדויקת של נוזלים (למשל, 4-AP, ACSF), וגירוי אופטי (להפעלה אופטוגנטית).
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת רקמות כדי להבטיח את חיוניות הפרוסות ויצירה עקבית של אירועים איקטליים, שכן איכות הרקמה משפיעה ישירות על שיעורי ההצלחה.
- דורש התאמה של פרמטרי ההשראה (למשל, ריכוז 4-AP, משך פולס האור, נפח ה-puff של מוליך עצבי) בעת מעבר בין מודלים של רקמת מכרסמים לרקמה אנושית.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות באיכות הפרוסות והצורך בטיפול מיומן לשמירה על בריאות הרקמה במהלך ההכנה וההקלטה.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Preparation of Cortical Slices from the Somatosensory-motor Cortex
2:40
Electrophysiological Recordings of the Superficial Cortical Layer and Seizure Induction
4:43
Results: Acute In Vitro 4-AP Cortical Seizure Model and Ictal Events Generated by Optogenetics
6:19
Conclusion
