וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה
25 ביוני 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.
ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלת מפתח בתחום הסומטו-סנסציה, המנגנון שבאמצעותו בעל חיים, כגון דרוזופילה מלנוגסטר, בוחר את הטמפרטורה הסביבתית המועדפת עליו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לקבוע את הטמפרטורה המועדפת על קבוצת הזחלים בבדיקה אחת כאשר היא מתמודדת עם טווח טמפרטורות רציף. בנוסף למתן תובנה לגבי העדפות הטמפרטורה של זחלי דרוזופילה, ניתן להתאים את צלחת ההטבעה גם לשימוש עם אורגניזמים מודלים אחרים כגון התולעת, C elegans.
ראשית, הכינו משחת שמרים להכנת בקבוקונים לצלב. מערבבים גרגירי שמרים במים מזוקקים וטוחנים אותם לעיסה עם עלי. לאחר מכן, הוסיפו מעט רסק שמרים קרוב לדפנות הפנימיות של בקבוקוני דרוזופילה סטנדרטיים ממש מעל פני האוכל.
כדי לייצר את הזחלים, אספו 12 עד 35 נקבות ועד מחצית ממספר הזכרים, אך לא יותר מ-10 זכרים. שלב את הקבוצות הללו בבקבוקון המכיל משחת שמרים. טען את הבקבוקונים המוכנים למגש של 100 בקבוקונים.
כלול 20 בקבוקונים פתוחים עמוסים במים במגש כדי לספק לחות. לאחר מכן, אטמו את המגש בשקית ניילון שקופה ודגרו אותו בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות של האכלה והזדווגות, העבירו את הזבובים לבקבוקוני מזון חדשים כדי לאסוף ביצים.
הקש עליהם. אין להשתמש בפחמן דו חמצני. לאחר מכן, אפשרו לזבובים להטיל ביצים במשך שלוש שעות בחום של 25 מעלות צלזיוס.
מאוחר יותר, הוציאו את הבוגרים והניחו את הבקבוקונים המכילים את הביצים בחזרה למגש עם בקבוקוני מים וסגרו את השקית. לאחר מכן, פתחו את הביצים ב-25 מעלות צלזיוס לשלב הזחל הרצוי. כדי להכין שיפוע חד-כיווני, תחילה צור סביבת סביבה אנושית לבדיקה.
הניחו שני גושי אלומיניום המחוברים לאמבטיות מים נפרדות על מגבות נייר רטובות, במרחק של 10 סנטימטרים זה מזה. יש לחמם את אמבטיות המים מראש. לאחר מכן, הכינו 100 מיליליטר של 1% אגרוז והוסיפו 25 מיליליטר לכל לוחית בדיקה על משטח ישר.
לאחר שהאגרוז התמצק, שפשפו בעדינות את המשטח עם ספוג מלמין כדי להפוך את המשטח לגס מעט. לאחר מכן, כדי לקדם העברת טמפרטורה יעילה, מלא את כל הרווחים בין גושי האלומיניום בלוחות הבדיקה במים המועברים מבקבוק ריסוס. כעת, הנח את לוחות הבדיקה על גושי האלומיניום וודא שהתיחומים הם שני סנטימטרים משני הקצוות כדי להתאים בדיוק לקצוות גושי האלומיניום.
לאחר מכן, רססו סרט מים על פני הצלחות כדי שהג'לים לא יתייבשו. לאחר מכן, מכסים את המערכת בקופסת קרטון כדי להפחית את האידוי ולעזור לייצב את הטמפרטורה של משטח הג'ל. המתן חמש עד 10 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה להתאזן
לאחר מכן, בדוק את טמפרטורת פני השטח על הצלחת ב-12 מקומות לפחות כדי לוודא שיש טמפרטורה אחידה לאורך כל הדרך, תן או קח שתי מעלות צלזיוס. לאחר מכן החזר את מכסה הקופסה למקומו עד לביצוע הבדיקה. כדי לבודד זחלים נקיים, הוסף תחילה כ-40 מיליליטר של תמיסת סוכרוז 18% למבחנה של 50 מיליליטר.
לאחר מכן העבירו זחלים מערימות המזון לתמיסה, בעזרת סקופה. לאחר מכן, מערבבים היטב את הזחלים בתמיסה, בעזרת הסקופולה. כעת, המתינו 30 עד 60 שניות עד שהזחלים יצופו לשכבה העליונה של הצינור.
לאחר מכן שפכו את התמיסה עם הזחלים לתוך צינור נוסף של 50 מיליליטר ומלאו אותה בסוכרוז טרי של 18%. שוב, חכו שהזחלים יצופו למעלה. נוכחות מזון יכולה להשפיע על התוצאות.
לכן, על מנת להשיג תוצאות הניתנות לשחזור, חשוב לנקות היטב את הזחלים כדי למזער את הזיהום במזון. עשו זאת בעדינות, כדי למנוע נזק לזחלים. לאחר מכן, הנח מסננת תאים של 300 מיקרון על גבי צינור של 50 מיליליטר, ולאחר מכן הסר את כל הגופות הבוגרות המתות והפסולת הצפה מפני השטח של תמיסת הסוכרוז.
כעת, שפכו את הזחלים דרך המסננת כדי לאסוף אותם על מסך הרשת. לאחר מכן, העבירו כ-50 מיליליטר מים דרך המסננת פעמיים כדי לנקות עוד יותר את הזחלים. לאחר מכן, על צלחת ריקה של 35 מילימטר, שטפו את רוב הזחלים מהמסננת בעזרת מים.
השתמש במכחול כדי להעביר את הזחלים הנותרים על הרשת. לאחר מכן, שואבים את רוב המים מהצלחת באמצעות מיקרו פיפטה. לאחר מכן הניחו את המכסה על הכלי הפוך כך שהזחלים לא יוכלו לברוח.
כעת, אפשר לזחלים להתאושש במשך 10 עד 20 דקות לפני תחילת הבדיקה. ראשית, הסר את קופסת הקרטון מעל הג'ל ובדוק במהירות את טמפרטורת פני הג'ל. אם המשטח יבש, יש לרסס כמות קטנה של מים על פני השטח.
אם הג'ל טוב, טען 100 עד 200 זחלים במרכז כל צלחת, בעזרת מברשת צבע קטנה. לאחר מכן, הניחו מכסה על כל לוחית בדיקה כדי ללכוד את הזחלים וכסו את הסט בקופסת קרטון כדי למנוע חשיפה לאור. הבדיקה נמצאת כעת בעיצומה.
לאחר 10 עד 30 דקות, הסר את קופסת הקרטון ואת מכסה המיקרופלייט. לאחר מכן, צלם את הלוחות מלמעלה כדי לתעד את מיקום הזחלים. הנח את הקופסה מעל המצלמה כדי למנוע השתקפות על פני הג'ל.
כדי לנקות את הצלחת, שאפו את כל הזחלים בכל מקום שבו הם התפזרו. כעת, חשב את התפלגות אחוזי הזחלים בכל אזור, באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. צרו קווים כל שני סנטימטרים, על סמך התיחומים על לוחית הבדיקה וספרו את מספר הזחלים בכל אזור.
בעת הספירה, התעלם מהזחלים המופצים ברכסים של 0.5 סנטימטר מכל קצה מכיוון שעובי הג'ל ותנאי הטמפרטורה אינם אחידים ליד הקצה. ב-18 מעלות צלזיוס עד 28 מעלות צלזיוס, שיפוע חד-כיווני נעשה באמצעות אמבטיות מים שהוגדרו ל-16.8 מעלות צלזיוס ו-31 מעלות צלזיוס. התפלגות הטמפרטורה לאורך השיפוע נמצאה כמעט ליניארית.
זחלי ביקורת נבדקו בגילאים שונים. זחלי הכוכב הראשון, השני והשלישי הראו העדפות שיא לאזור 24 מעלות צלזיוס. במהלך אמצע הכוכב השלישי, רוב הזחלים הצטברו באזור 18 מעלות צלזיוס.
זחלי כוכב סוף שליש שאינם נודדים היו מקובצים היטב באזור 18 מעלות צלזיוס. הנטייה להצטבר באזור 18 מעלות צלזיוס בזן הבקרה, שהיה לבן 1118, לא נבעה מאפקט קצה, מכיוון שזחלי הכוכב השלישי המאוחר עדיין הצטברו באזור 18 מעלות צלזיוס, תוך שימוש בשיפוע דו-כיווני. כאשר ניתחנו מוטציות של זחלי כוכב השלישי המאוחר הנדרשות להבחנה בין טמפרטורה, התוצאות השתנו.
זחלים עם מוטציה אפסית ב-trpA1 מפוזרים באופן שווה על פני כל השיפוע של 18 מעלות צלזיוס עד 28 מעלות צלזיוס. זחלים שחסרו רק את האיזופורמים A ו-B או את האיזופורמים C ו-D של trpA1 הראו גם הם ליקויים חמורים. זחלים עם מוטציה באחד משני הגנים המקודדים פוספוליפאז c בטא, norpA, שובשו גם הם.
עם זאת, זחלים עם מוטציה בגן המקודד את הפוספוליפאז c בטא האחר, plc21c, התנהגו כרגיל. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה ברורה כיצד להשיג תוצאות הניתנות לשחזור באמצעות שיפוע תרמי רציף, שיאפשר לך להשוות את העדפות הטמפרטורה של זחלי דרוזופילה מסוג בר וזחלי דרוזופילה מוטנטיים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות לבדיקה אחת.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשים לב למצב בקבוקוני הזבוב ולא להשתמש בזחלים אם הם מיובשים. טכניקה זו מפשטת את גילוי הגנים החדשים הנדרשים על ידי זחלי דרוזופילה לבחירת הטמפרטורה המועדפת עליהם בטווח הנוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לקביעת טמפרטורת הסביבה המועדפת של זחלי דרוזופילה באמצעות מדרג טמפרטורה רציף. המחקר בוחן את המנגנונים שבאמצעותם Drosophila melanogaster בוחרת את הטמפרטורה האידיאלית שלה בהקשר של תחושת סומטוסנסציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מדעי ההתנהגות
- אנטומולוגיה
רקע
- לרואות של Drosophila משמשות לעיתים קרובות למחקר של העדפות טמפרטורה.
- הבנת הבחירה בטמפרטורה תורמת לתובנות על תחושה סומטוסנסורית.
- ניתן להתאים את השיטה המוצגת לאורגניזמים מודלים אחרים, כגון C. elegans.
מטרת המחקר
- קביעת טמפרטורת הסביבה המועדפת של פשוש (Drosophila) בשלב הזחלים במסגרת מבוקרת.
- הערכת היעילות של בדיקה המבוססת על מדרג טמפרטורה רציף.
- שיפור השחזוריות של תוצאות הנוגעות להעדפות טמפרטורה.
שיטות שנבחרו
- נעשה שימוש במערך של בדיקת מדרגה תרמית רציפה באמצעות בלוקים של אלומיניום ופלטות אגרוז.
- larvae של *Drosophila melanogaster* הוכנו באמצעות פרוטוקול רבייה מבוקר.
- הפיזור של הטמפרטורה נוטר כדי להבטיח מדרגי טמפרטורה אחידים.
- הזחליים ננקו כדי לצמצם זיהום ממזון לפני הבדיקות.
- תוכנה לניתוח תמונות שימשה לכימות התפלגות הזחלים בין אזורי הטמפרטורה.
תוצאות עיקריות
- העדפות הזחלים השתנו בהתאם לשלב השילטה (instar), כאשר אזורי טמפרטורה ספציפיים הועדפו בשלבים שונים של ההתפתחות.
- זחלים בשילטה הראשונה והשנייה הראו שיא העדפה ב-24°C, בעוד שזחלים בשלב אמצע השילטה השלישית העדיפו 18°C.
- זחלים בשלב השילטה השלישית המאוחרת, שאינם בשלב נדידה, התקבצו בצורה הדוקה בטמפרטורות קרירות יותר.
מסקנות
- המחקר מדגים שיטה חסונה להערכת העדפות טמפרטורה בזחלי Drosophila.
- הוא מדגיש את חשיבותם של גורמים סביבתיים על התנהגויות התפתחותיות.
- התובנות שהושגו עשויות לשפר את ההבנה של מנגנונים חושייים והעדפות הקשורות לטמפרטורה באורגניזמים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת מנגנוני העדפת הטמפרטורה באורגניזמי מודל תומכת בתיקוף מטרות במחקר סומטוסנסורי, ומאפשרת הפחתת סיכונים מנגנונית של נתיבי TRP channel ו-phospholipase C. בדיקה זו מספקת תוצאות פנוטיפיות כמותיות ו可-שחזרות המגבירות את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי קישור הפרעות גנטיות לתוצרי התנהגות מוגדרים. יכולת ההסתגלות של השיטה בין מינים ושלבים התפתחותיים שונים מחזקת את הרצף התרגומי לסריקת מטרות נוירו-התנהגותיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד גנים תרמו-סנסוריים על ידי מדידת התפלגות זחלים על פני אזורי טמפרטורה מוגדרים.
- ערך תפעולי: תומך בסריקה פנוטיפית ברמת ודאות גבוהה של מוטציות המשפיעות על תעלות TRP ואיסופורמים של phospholipase C.
- ערך אסטרטגי: מסייע בהפחתת סיכונים של מטרות (target de-risking) באמצעות הערכה רציפה של מפל טמפרטורה להעדפות חום, ללא תלות במינון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים וסטנדרטיים של מיקום הזחלים לצורך נרמול הבדיקה ואישור פגיעות (hits).
- ערך תפעולי: משתמש בלוחיות מצופות אגרוז ובטיהור זחלים מבוסס סוכרוז כדי להבטיח הדירות בין הרצות.
- ערך אסטרטגי: יוצר פלטפורמה ניתנת להרחבה לסריקת תחושת חום בין-מינית, כולל התאמה ל-C. elegans.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין שינויים בהעדפות תרמיות של זחלים לבין דרישות גנטיות הספציפיות לשלב ההתפתחות, ובכך מספק מידע לאימות מטרות המלווה בסטרטפיקציה של הגיל.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואה ראשית בין זני פרא לזני מוטציה תחת תנאי מדרג זהים.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי זיהוי שיבושים פנוטיפיים חמורים במסלולים של תחושת חום (thermosensory).
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
הבדיקה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת קריאה פונקציונלית של מעורבות המטרה התרמו-סנסורית לפני זיהוי המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של הגילוי: בודקת היפותזות לגבי תפקידים ספציפיים של גנים באפליה של טמפרטורה, תוך שימוש בהתפלגות מרחבית של זחלים כמדד פנוטיפי.
- סריקה: מספקת זחלים מטוהרים ומוכנים לבדיקה על מדרג טמפרטורה סטנדרטי, לצורך סריקה עקבית של תרכובות או מוטציות גנטיות.
- אנליטיקה: עושה שימוש בניתוח תמונות כדי לכמת את אחוזי הזחלים באזורים ספציפיים, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית של העדפות טמפרטורה.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שינויים תחושתיים תרמיים במהלך ההתפתחות לבין דפוסי ביטוי גנים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות המותאמות לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר של מדרג טמפרטורה לסריקת תחושות גוף (somatosensation) במגוון אורגניזמים ובשלבי התפתחות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במסלולים תרמו-סנסוריים על ידי בידוד השפעות ספציפיות לגנים על העדפת טמפרטורה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות בין הרצות באמצעות ניקוי סטנדרטי של הזחלים, איזון הגרדיאנט וסימון אזורים.
- ערך אסטרטגי: משפר את תעדוף תיק הפיתוח על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של מטרות עם תיקוף פנוטיפי חזק בתחושת סומטוסנסציה.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי אישור מעורבות המטרה באמצעות שינויים מדידים בהתפלגות התרמית של הזחלים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, קביעת שלבי התפתחות הזחלים וטכניקות ניקוי מבוססות סוכרוז.
- תלוי בשימוש במקבבות מים כפולות, בלוקים בעלי מדרג טמפרטורה מאלומיניום והכנת פלטות אגרוז להבטחת יציבות תרמית.
- מחייב טעינה סטנדרטית של זחלים ותנאי דימות ללא חשיפה לאור כדי למזער שונות התנהגותית.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הבדיקה לאורגניזמי מודל אחרים, כגון C. elegans.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לאפקט השוליים ושונות בעובי הג'ל בקרבת גבולות הפלטה.
