Name: וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: חקור העדפות טמפרטורה של זחלי Drosophila melanogaster באמצעות מדרגת חום רציפה. שיטה זו מאפשרת לזהות טמפרטורות מועדפות בשלבי התפתחות שונים ולהבין מנגנוני חישת טמפרטורה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.M. נתמך על ידי מימון NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278), של NIAID (1DP1AI124453).

<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה, חשוב לנקוט צעדים כדי להשיג נאותה מספרים של הזחלים לביצוע הניסויים. אלה כוללים מראש האכלה של זבובים בקבוקונים המכילים הדבק שמרים במשך 2-3 d כדי לשפר את הנחת הביצה. הבקבוקונים צריך להיות מניחים במגש המכיל מים בקבוקונים בתוך שקית פלסטיק שקוף, אשר שומרת על הלחות של המזון ומקדם האכלה יעיל על ידי הזחלים בזמן המתיר חשיפה מחזורים בהירה-כהה נורמליים. עם זאת, הדבק שמרים לא צריך להיות כל כך רך הזבובים הופכים לכוד. מספר נקבות לכל מבחנה תלויה גנוטיפ. במקרה של w1118, זה בדרך כלל...

Thermotaxis הוא מועסק על ידי חיות ניידים לבחירת סביבה עם מצוינות והומלץ תנאים1,2,3. אם האקלים בצורה מוגזמת חם או קר, התנהגות זו חיונית להישרדותו. בנוסף, בעלי חיים רבים רגישים מאוד קטן הבדלי טמפרטורה בטווח נוח ונחפש את הסביבה עם טמפרטורה אידיאלית. זה חשיבות מיוחדת עבור אורגניזמים poikilothermic כמו זבובי פירות, אשר equilibrate טמפרטורת גופם עם הסביבה. מבחני לעקוב אחר thermotaxis הזחל סייעו בזיהוי, ולהבהיר את התפקידים של חיישנים מולקולריים כגון דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים (TRP) ערוצים4,5,6, rhodopsins7,8, ionotropic קולטן קולטנים (IRs)9, ואשר היצוקים החיות האלה עם רגישויות הטמפרטורה מעל טמפרטורה שונות טווחים.
בדיקת הבחירה דו כיוונית מספקת גישה אחת ללמוד העדפות תרמי ב הזחלים6,7. וזמינותו כרוך בהקמת שני אזורי טמפרטורה שונות ומאפשרת החיות לבחור צד אחד על השני. התוצאות של מבחנים דו כיוונית הבחירה יכול להיות חזקים, במיוחד אם ההבדלים בטמפרטורה בין שתי האפשרויות הן גדולות. בנוסף, מאז כל assay כרוך ליווח רק לשתי קבוצות, הנתונים ניתן לבטא מאינדקס העדפה פשוטה. הקלות והפשטות של מבחני בחירה דו-כיווני נתונות גם למסכים גנטי. אולם, מגבלה עיקרית היא כי ניסויים רבים נדרשים לקבוע את הטמפרטורה המועדף של חיות פראי-סוג או מוטציה.
Assay הדרגתיות מציעה הזדמנות להקים את הטמפרטורה המועדף assay יחידה8. יתר על כן, בניגוד הבדיקה הבחירה דו-כיווני, הוא מאפשר את ההערכה של ההתפלגות של קבוצה של בעלי חיים, כאשר התעמת עם טווח רציף של טמפרטורות. Assay מעבר צבע אחד משתמש צלחת פטרי וחיות יחיד והוא מתאים היטב אפיון ההתנהגות מפורט של חיות בודדות10. אולם, מאז פטרי עגול, הגודל של אזורי טמפרטורה משתנים, קטנים בהדרגה בהתאם למרחק מן המרכז. לכן, תוכנית התקנה זו אינה אידיאלית לניטור הבחירות טמפרטורה של אוכלוסיות בעלי חיים.
מנגנון הדרגתיות תרמי רציפה, כי הוא מתאים היטב כדי להעריך את העדפות טמפרטורה של קבוצות של הזחלים מעסיקה של ארנה מלבני, מתואר כאן. המנגנון הוא פשוט לבנות ולהרכיב. בנוסף, מעבר הצבע הוא ליניארי, הוא גמיש, כמו זה יכול לשמש כדי להעריך את thermotaxis מעל טמפרטורה גדול נע בין 10 ° C ל 42 º C. וזמינותו היא מהירה וישירה לביצוע ותשואות לשחזור נתונים. בנוסף דיווח הטמפרטורה המועדף של הזחלים, היא מגלה את ההעדפות של אוכלוסיית חיות מעל וההתדיינות ליניארי בניסוי יחיד. בשל יתרונות אלו, זה הוא בחירה מצוינת עבור זיהוי גנים הדרושים עבור thermotaxis.

<table><tbody><tr><td><מכשיר בדיקת שיפוע חזק></חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, אמבט במחזור מקורר/מחומם 6 ליטר</td><td>תומס סיינטיפיק</td><td>9106</td><td>דגם זה הופסק. דגמים חלופיים מעודכנים כוללים: 1186R00 ו-1197U04 עבור 120 וולט, 60 הרץ, או 1184L08 ו-1197U04 עבור 240 וולט, 50 הרץ.</td></tr><tr><td>לוחית בדיקת אלומיניום (לשיפוע חד כיווני)</td><td></td><td></td> <td>גודל חיצוני: 14 x 10.1 x 0.9 ס"מ, גודל פנימי: 12.9 x 8.7 x 0.8 ס"מ, אנודייז שחור.</td></tr><tr><td>לוח אלומיניום (לשיפוע דו-כיווני)</td><td></td><td></td> <td>25 x 22 x 0.2 ס"מ, אנודייז שחור.</td></tr><tr><td>בלוק</td><td></td><td></td> אלומיניום <td>גודל חיצוני: 25.5 x 5 x 1.4 ס"מ, פרמטרים של תעלות פנימיות מוצגים באיור 1D.</td></tr><tr><td>מחבר לבלוקים וצינורות אלומיניום</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon צינורות סיליקון סניטריים</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4 אינץ' ID x 3/8 אינץ' OD x 1/16 אינץ' קיר</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>פריטים ו ריאגנטים לבדיקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עלי</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>17361</td><td>עלי לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>מדחום</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>צמד תרמי</td><td>Fluke</td><td>K סוג</td><td></td></tr><tr><td>מכסה מיקרופלייט אוניברסלי</td><td>קורנינג</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>סרט תיוג (לשיפוע דו-כיווני)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>סרט תיוג Fisherbrand 2 אינץ' x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>הכן תמיסה של 1%</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S0389-5KG</td><td>הכן תמיסה של 18% ממש לפני תחילת הבדיקה</td></tr><tr><td>מברשת צבע</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל</td><td>דנוויל</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל בקבוק עגול רחב פה</td><td>פיירקס</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים (נקבוביות 300 מ"מ</td>)<td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>פריט אופציונלי לשטיפת זחלים</td></tr><tr><td>קופסת קרטון (מגש בקבוקון)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Drosophila food</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מים מזוקקים</td><td></td><td></td><td>22,400 מ"ל</td></tr><tr><td>קמח תירס, צהוב (רשת עדינה במיוחד, להקה) 20 ק"ג</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1,609 גרם</td></tr><tr><td>שמרי בירה 100 ק"ג</td><td>MP ביומדיקל</td><td>ICN90331280</td><td>379 גרם</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; קמח סויה (10 ק"ג/יחידה)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 גרם</td></tr><tr><td>Drosophila אגר, סוג II (5 ק"ג)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 גרם</td></tr><tr><td></td> סירופ <td></td><td>תירס קל קארו</td><td>1,700 מ"ל</td></tr><tr><td>מתיל 4-הידרוקסיבנזואט (מושהה באתנול 200 הוכחה)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H5501-5KG</td><td>72 גרם/240 מ"ל</td></tr><tr><td>טוהר חומצה פרופיונית. p.a.,>99.5% (GC)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>81910-1 ליטר</td><td>108 מ"ל</td></tr><tr><td>חומצה זרחתית&nbsp; מגיב ACS, &ge; 85 משקל % ב-H2</td><td>O סיגמא אולדריץ'</td><td>438081-500 מ"ל</td><td>8.5 מ"ל</td></tr></tbody></table>

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

בעלי חיים רבים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מסוגלים מפלה דקה ההבדלים בטמפרטורה הסביבה, המאפשרת להם לחפש את נוף תרמי המועדפת שלהם. כדי להגדיר את העדפות טמפרטורה של הזחלים מעל טווח מוגדר ליניארי, פיתחנו וזמינותו של שימוש הדרגתי בטמפרטורה. כדי ליצור מעבר הדרגתי חד כיווני, שני רחובות אלומיניום מחובר אמבטיות מים עצמאית, שכל אחד מהם שולט הטמפרטורה של בלוקים בודדים. שני רחובות להגדיר את הגבולות העליון והתחתון של מעבר הצבע. מעבר הצבע החום היא הוקמה על ידי הצבת צלחת אלומיניום מצופה agarose מעל שני רחובות שבשליטת מים כך הצלחת משתרע על המרחק ביניהם. הקצוות של צלחת אלומיניום המוגדר על אבני מים מגדיר את טמפרטורת מינימום ומקסימום, ויוצרים האזורים שביניהם שני רחובות הדרגתי טמפרטורה לינארי. הדרגתיות וזמינותו שניתן להחיל על רימות בגילאים שונים, ניתן להשתמש כדי לזהות מוטנטים כי התערוכה הפנוטיפים, כגון אלה בעלי מוטציות המשפיעות על גנים קידוד TRP ערוצים ו opsins, אשר נדרשים עבור טמפרטורה אפליה.

להקים 18 ° C - 28 מעלות צלזיוס חד כיווני ההדרגתי, נוכל להגדיר הטמפרטורות של שתי אמבטיות מים 16.8 ° C ו- 31 מעלות צלזיוס. אנו משיגים את הטמפרטורות ב 13 נקודות על ידי מדידת הטמפרטורה ב 26 תנוחות בתוך החלק העליון והחלק התחתון של כל האזורים 6, קווי הגבול בין אזורי, ולא בקצוות הקיצוניים של המשטח ג'ל agarose (איור 2C, 2E). התפלגות טמפרטורה לאורך מעבר הצבע היה כמעט ליניארי (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (2E איו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלת מפתח בתחום הסומטו-סנסציה, המנגנון שבאמצעותו בעל חיים, כגון דרוזופילה מלנוגסטר, בוחר את הטמפרטורה הסביבתית המועדפת עליו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לקבוע את הטמפרטורה המועדפת על קבוצת הזחלים בבדיקה אחת כאשר היא מתמודדת עם טווח טמפרטורות רציף. בנוסף למתן תובנה לגבי העדפות הטמפרטורה של זחלי דרוזופילה, ניתן להתאים את צלחת ההטבעה גם לשימוש עם אורגניזמים מודלים אחרים כגון התולעת, C elegans.ראשית, הכינו משחת שמרים להכנת בקבוקונים לצלב. מערבבים גרגירי שמרים במים מזוקקים וטוחנים אותם לעיסה עם עלי. לאחר מכן, הוסיפו מעט רסק שמרים קרוב לדפנות הפנימיות של בקבוקוני דרוזופילה סטנדרטיים ממש מעל פני האוכל.כדי לייצר את הזחלים, אספו 12 עד 35 נקבות ועד מחצית ממספר הזכרים, אך לא יותר מ-10 זכרים. שלב את הקבוצות הללו בבקבוקון המכיל משחת שמרים. טען את הבקבוקונים המוכנים למגש של 100 בקבוקונים.כלול 20 בקבוקונים פתוחים עמוסים במים במגש כדי לספק לחות. לאחר מכן, אטמו את המגש בשקית ניילון שקופה ודגרו אותו בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות של האכלה והזדווגות, העבירו את הזבובים לבקבוקוני מזון חדשים כדי לאסוף ביצים.הקש עליהם. אין להשתמש בפחמן דו חמצני. לאחר מכן, אפשרו לזבובים להטיל ביצים במשך שלוש שעות בחום של 25 מעלות צלזיוס.מאוחר יותר, הוציאו את הבוגרים והניחו את הבקבוקונים המכילים את הביצים בחזרה למגש עם בקבוקוני מים וסגרו את השקית. לאחר מכן, פתחו את הביצים ב-25 מעלות צלזיוס לשלב הזחל הרצוי. כדי להכין שיפוע חד-כיווני, תחילה צור סביבת סביבה אנושית לבדיקה.הניחו שני גושי אלומיניום המחוברים לאמבטיות מים נפרדות על מגבות נייר רטובות, במרחק של 10 סנטימטרים זה מזה. יש לחמם את אמבטיות המים מראש. לאחר מכן, הכינו 100 מיליליטר של 1% אגרוז והוסיפו 25 מיליליטר לכל לוחית בדיקה על משטח ישר.לאחר שהאגרוז התמצק, שפשפו בעדינות את המשטח עם ספוג מלמין כדי להפוך את המשטח לגס מעט. לאחר מכן, כדי לקדם העברת טמפרטורה יעילה, מלא את כל הרווחים בין גושי האלומיניום בלוחות הבדיקה במים המועברים מבקבוק ריסוס. כעת, הנח את לוחות הבדיקה על גושי האלומיניום וודא שהתיחומים הם שני סנטימטרים משני הקצוות כדי להתאים בדיוק לקצוות גושי האלומיניום.לאחר מכן, רססו סרט מים על פני הצלחות כדי שהג'לים לא יתייבשו. לאחר מכן, מכסים את המערכת בקופסת קרטון כדי להפחית את האידוי ולעזור לייצב את הטמפרטורה של משטח הג'ל. המתן חמש עד 10 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה להתאזןלאחר מכן, בדוק את טמפרטורת פני השטח על הצלחת ב-12 מקומות לפחות כדי לוודא שיש טמפרטורה אחידה לאורך כל הדרך, תן או קח שתי מעלות צלזיוס. לאחר מכן החזר את מכסה הקופסה למקומו עד לביצוע הבדיקה. כדי לבודד זחלים נקיים, הוסף תחילה כ-40 מיליליטר של תמיסת סוכרוז 18% למבחנה של 50 מיליליטר.לאחר מכן העבירו זחלים מערימות המזון לתמיסה, בעזרת סקופה. לאחר מכן, מערבבים היטב את הזחלים בתמיסה, בעזרת הסקופולה. כעת, המתינו 30 עד 60 שניות עד שהזחלים יצופו לשכבה העליונה של הצינור.לאחר מכן שפכו את התמיסה עם הזחלים לתוך צינור נוסף של 50 מיליליטר ומלאו אותה בסוכרוז טרי של 18%. שוב, חכו שהזחלים יצופו למעלה. נוכחות מזון יכולה להשפיע על התוצאות.לכן, על מנת להשיג תוצאות הניתנות לשחזור, חשוב לנקות היטב את הזחלים כדי למזער את הזיהום במזון. עשו זאת בעדינות, כדי למנוע נזק לזחלים. לאחר מכן, הנח מסננת תאים של 300 מיקרון על גבי צינור של 50 מיליליטר, ולאחר מכן הסר את כל הגופות הבוגרות המתות והפסולת הצפה מפני השטח של תמיסת הסוכרוז.כעת, שפכו את הזחלים דרך המסננת כדי לאסוף אותם על מסך הרשת. לאחר מכן, העבירו כ-50 מיליליטר מים דרך המסננת פעמיים כדי לנקות עוד יותר את הזחלים. לאחר מכן, על צלחת ריקה של 35 מילימטר, שטפו את רוב הזחלים מהמסננת בעזרת מים.השתמש במכחול כדי להעביר את הזחלים הנותרים על הרשת. לאחר מכן, שואבים את רוב המים מהצלחת באמצעות מיקרו פיפטה. לאחר מכן הניחו את המכסה על הכלי הפוך כך שהזחלים לא יוכלו לברוח.כעת, אפשר לזחלים להתאושש במשך 10 עד 20 דקות לפני תחילת הבדיקה. ראשית, הסר את קופסת הקרטון מעל הג'ל ובדוק במהירות את טמפרטורת פני הג'ל. אם המשטח יבש, יש לרסס כמות קטנה של מים על פני השטח.אם הג'ל טוב, טען 100 עד 200 זחלים במרכז כל צלחת, בעזרת מברשת צבע קטנה. לאחר מכן, הניחו מכסה על כל לוחית בדיקה כדי ללכוד את הזחלים וכסו את הסט בקופסת קרטון כדי למנוע חשיפה לאור. הבדיקה נמצאת כעת בעיצומה.לאחר 10 עד 30 דקות, הסר את קופסת הקרטון ואת מכסה המיקרופלייט. לאחר מכן, צלם את הלוחות מלמעלה כדי לתעד את מיקום הזחלים. הנח את הקופסה מעל המצלמה כדי למנוע השתקפות על פני הג'ל.כדי לנקות את הצלחת, שאפו את כל הזחלים בכל מקום שבו הם התפזרו. כעת, חשב את התפלגות אחוזי הזחלים בכל אזור, באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. צרו קווים כל שני סנטימטרים, על סמך התיחומים על לוחית הבדיקה וספרו את מספר הזחלים בכל אזור.בעת הספירה, התעלם מהזחלים המופצים ברכסים של 0.5 סנטימטר מכל קצה מכיוון שעובי הג'ל ותנאי הטמפרטורה אינם אחידים ליד הקצה. ב-18 מעלות צלזיוס עד 28 מעלות צלזיוס, שיפוע חד-כיווני נעשה באמצעות אמבטיות מים שהוגדרו ל-16.8 מעלות צלזיוס ו-31 מעלות צלזיוס. התפלגות הטמפרטורה לאורך השיפוע נמצאה כמעט ליניארית.זחלי ביקורת נבדקו בגילאים שונים. זחלי הכוכב הראשון, השני והשלישי הראו העדפות שיא לאזור 24 מעלות צלזיוס. במהלך אמצע הכוכב השלישי, רוב הזחלים הצטברו באזור 18 מעלות צלזיוס.זחלי כוכב סוף שליש שאינם נודדים היו מקובצים היטב באזור 18 מעלות צלזיוס. הנטייה להצטבר באזור 18 מעלות צלזיוס בזן הבקרה, שהיה לבן 1118, לא נבעה מאפקט קצה, מכיוון שזחלי הכוכב השלישי המאוחר עדיין הצטברו באזור 18 מעלות צלזיוס, תוך שימוש בשיפוע דו-כיווני. כאשר ניתחנו מוטציות של זחלי כוכב השלישי המאוחר הנדרשות להבחנה בין טמפרטורה, התוצאות השתנו.זחלים עם מוטציה אפסית ב-trpA1 מפוזרים באופן שווה על פני כל השיפוע של 18 מעלות צלזיוס עד 28 מעלות צלזיוס. זחלים שחסרו רק את האיזופורמים A ו-B או את האיזופורמים C ו-D של trpA1 הראו גם הם ליקויים חמורים. זחלים עם מוטציה באחד משני הגנים המקודדים פוספוליפאז c בטא, norpA, שובשו גם הם.עם זאת, זחלים עם מוטציה בגן המקודד את הפוספוליפאז c בטא האחר, plc21c, התנהגו כרגיל. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה ברורה כיצד להשיג תוצאות הניתנות לשחזור באמצעות שיפוע תרמי רציף, שיאפשר לך להשוות את העדפות הטמפרטורה של זחלי דרוזופילה מסוג בר וזחלי דרוזופילה מוטנטיים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות לבדיקה אחת.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשים לב למצב בקבוקוני הזבוב ולא להשתמש בזחלים אם הם מיובשים. טכניקה זו מפשטת את גילוי הגנים החדשים הנדרשים על ידי זחלי דרוזופילה לבחירת הטמפרטורה המועדפת עליהם בטווח הנוח.

a-temperature-gradient-assay-to-determine-thermal-preferences

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception...

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

סרטון זה מתאר את מבחן העדפות הטעם, שיטה התנהגותית המשמשת למדידת משיכה או הימנעות כלפי תמיסות צבעוניות שטעמן שונה על ידי הערכת צבע הבטן של הזבוב לאחר בליעת החומר המועדף. הפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך המשמש למדידת העדפת זבובים לתמיסות בריכוזי סוכרוז משתנים.

בדיקת העדפות טעם: שיטה למדידת התנהגות האכלה בדרוזופילה

לזחלי דרוזופילה יש נוירונים חושיים ייעודיים – nociceptors – שתגובתם לגירויים תרמיים שעלולים להיות מזיקים מעוררת התנהגויות מרתיעות – או מה שמכונה "nocifensive" – אצל החיה. סרטון זה מתאר שיטה להערכת נוסיספטציה תרמית על ידי רישום התנהגות הזחל בתגובה ליישום מקומי של בדיקת חום על הקוטיקולה. שיטה זו נקראת, אם כן, בדיקת חום מקומית.

בדיקת חום מקומית: שיטה להערכת נוסיספטציה של טמפרטורות גבוהות בזחלי דרוזופילה

זבובי פירות דרוזופילה יכולים להבחין בשינויים קטנים בטמפרטורה ולכן לבחור סביבות עם תנאים תרמיים נוחים. סרטון זה מתאר בדיקה התנהגותית הבודקת את העדפת הטמפרטורה של זחלי דרוזופילה על שיפוע תרמי ליניארי.

בדיקת שיפוע טמפרטורה: שיטה לבדיקת העדפת טמפרטורה בזחלי דרוזופילה

לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, קצב העדפת טמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה. TPR מוסדר באופן עצמאי מתפוקה צירקדית אחרת, פעילות לוקומוטורית. כאן אנו מתארים את העיצוב והניתוח של TPR בדרוסופילה.

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

דוח זה מתאר שיטה למדידת פעילות הזחלים של דרוזופילה באמצעות מוניטור פעילות הדרוזופילה TriKinetics. המכשיר משתמש בקרני אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים. ניתן לנתח נתונים כדי לייצג פרמטרי תנועה כולל קצבים ומיקומי בעלי החיים בתוך תאי הבדיקה.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן אוטומטי את ביצועי גינקולוגיות דרוזופילה -שינוי הטמפרטורות באמצעות לתכנות מבוקרי טמפרטורה ארנה שמייצר שינויי טמפרטורה מהירים ומדויקים בזמן ובמרחב.

שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

מגבלות תרמיות יכולות לחזות את סביבות אורגניזמים לסבול, שהוא מידע בעל ערך לנוכח שינוי האקלים המהיר. מתואר כאן פרוטוקולים בתפוקה גבוהה כדי להעריך מינימה תרמית קריטית וזמן נוקאאוט חום בחרקים. שני הפרוטוקולים ממקסמים את התפוקה וממזערים את עלות ההתייענות.

תפוקה גבוהה של מגבלות תרמיות קריטיות בחרקים

לחרקים יש טווח טמפרטורות סביבתי אופטימלי שהם מבקשים להישאר בתוכו, וגורמים חיצוניים ופנימיים רבים יכולים לשנות העדפה זו. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ופשוטה לחקר בחירת הטמפרטורה, המאפשרת לחרקים להפגין בחופשיות את התנהגותם הטבעית.

קביעת העדפת טמפרטורה של יתושים ואקטותרמיות אחרות

דו"ח זה מתאר שיטה למדידת זמן Drosophila melanogaster בוגר להפלה באמצעות מוניטור פעילות דרוזופילה (DAM2) בתגובה ללחץ חום בהולכת אוויר בתוך תא אינקובטור. DAM2 מודד פעילות על ידי רישום תנועות זבוב בודדות כאשר הן חוצות קרן אינפרא אדום. ניתוח הנתונים מקל על ידי קובץ הפעלה חדשני שנוצר על ידי המחברים.

בדיקות עמידות לחום באמצעות מערכת ניטור פעילות דרוזופילה : מדריך ליישום הפעלה לניתוח נתונים

חקור העדפות טמפרטורה של זחלי Drosophila melanogaster באמצעות מדרגת חום רציפה. שיטה זו מאפשרת לזהות טמפרטורות מועדפות בשלבי התפתחות שונים ולהבין מנגנוני חישת טמפרטורה.

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים