Name: מיקרוסקופ Reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: למדו מיקרוסקופיית רפלקטומטריה ספקטרלית לניתוח ננו-מבני של אקסונים מיאליניים במוח עכברים קבועים ללא ציון. השיטה מאפשרת מדידת קוטר אקסונים בדיוק גבוה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם לייזר לבן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון בסיסי למדע (IBS-R015-D1), על-ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1A6A1A03015642).

כל הניתוחים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת Sungkyunkwan.
1. הכנת הדוגמא
הערה: תא לחץ כל מכשירי ניתוח לפני לטיפול בבעלי חיים. לנהל את כל הביצועים כירורגית בחדר המוקדש ניתוחים. השמלות כירורגי סטרילי וכפפות לענידה על ידי כל אנשי הצוות בחדר ניתוח בכל עת.
<ol><li>
קיבוע הרקמה
	<ol>
<li>להכין שני מזרקים 10 מ ל שכל מלא באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ו- 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS.</li>
		<li>עזים ומתנגד עכבר 7-שבוע בן 12, (C57BL/6J או שורות עכבר עם או מגדר) על ידי מתן תערובת של zoletil ו חריגות השירותים הווטרינריים (1:1, 20 מ"ג/ק"ג כל אחד) או משטר של הרדמה חלופי מתאים (למשל, תערובת של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים) עם זריקה בקרום הבטן.</li>
		<li>ברגע העכבר הגיע מטוס כירורגי של הרדמה (שימוש בשיטת קמצוץ-תגובה הבוהן), חושפים את הלב שתורידו את העור ואת הצלעות עם מספריים.</li>
		<li>לגזור אטריום ימין עם מספריים קטנות כדי לנקז את הדם perfuse את הפתרון PBS, כדורגלן ברצף דרך החדר השמאלי עם מחט (קצב זלוף = 4 mL/min, נפח = 10 מ"ל עבור כל הפתרונות). הערה: העכבר הופך נוקשה אם התהליך הושלם בהצלחה. השימוש של העין משחה או עיקור אין צורך כפי שנהוג מסוף. אולי תדלג על ההליך קיבעון. עם זאת, השלב זה מומלץ כדי למזער את העיוותים מבניים כולל נזק לרקמות מכני ונפיחות עצב איסכמי. פרטים נוספים על קיבוע הרקמה, להפנות המאמר על ידי גייג ', ג'יי ג'י. et al. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של הפרוסה המוח
	<ol>
<li>לערוף את העכבר עם מספריים כירורגיים דרך הגחון החזה, הגב והבטן.</li>
		<li>הסר את עור הקרקפת ואת קרום העצם בעזרת מספריים קטנות כראוי עד מלא חושפת את הגולגולת.</li>
		<li>לשבור את העצם הקדמית, לחתוך את הגולגולת לאורך התפר המשונן של עצם העורף באמצעות מספריים קטנות עם טיפול שלא יגרמו נזק למוח.</li>
		<li>הסר בעדינות את הגולגולת ואת קרום הדורה ברצף בעזרת מלקחיים משובחים.</li>
		<li>לחלץ באמצעות כף פלסטיק רך, דואגת שלא יגרמו נזק לרקמת המוח.</li>
		<li>שוטפים ומשרים המוח שחולצו בפתרון PFA 4% למשך 30 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>פורסים את המוח קבוע למקטעים מיקרומטר 100 – 150 באמצעות של vibratome. הערה: לקבלת פרטים נוספים על הכנת הרקמה, להפנות המאמר על-ידי. שגב ואח 11. להליכי עוקבות, הרקמה צריך להיות חתוכים למקטעים דק יותר עובי מרווח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הרכבה של הפרוסה המוח
	<ol>
<li>היכונו כל פרוסה רקמות שקופית 1 כוס ו- 2 כוסות שער מרובע (22 × 22 × 0.17 מ מ).</li>
		<li>חותכים חצי אחד של המשקפיים שער מרובע (שתי חתיכות מלבניות) על-ידי שימוש לחיתוך זכוכית.</li>
		<li>לצרף שתי כוסות כיסוי חצויים באמצעות דבק סופר על הזכוכית שקופיות. הערה: הרווח בין שתי הכוסות חצויים צריך להיות מעט גדול יותר מהגודל של הפרוסה רקמות.</li>
		<li>לקצור את הפרוסה המוח בעזרת מברשת או פיפטה ולהניח את הרקמה על הזכוכית שקופיות בין מרווח. . שמור על עצמך לא לקפל את הרקמה.</li>
		<li>לוותר על μL 100 ל- PBS על פני הרקמה.</li>
		<li>המקום השני מרובע כיסוי הזכוכית על הרקמה. הימנע ההכללה של בועות אוויר בשלב זה.</li>
		<li>חותם סביב הזכוכית המכסה באמצעות של לק (או לחלופין מתאימים דבקים) כדי למנוע אידוי של PBS, זיהום על ידי אבק במהלך הפגישה הדמיה עוקבות. הערה: הנסיין עלול להיעצר בשלב זה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. כיול
<ol><li>. הפעילי את המיקרוסקופ לפחות שעה לפני ההדמיה כדי לאפשר תרמי מייצב לייזר מקור (ראה טבלה של חומרים). לאחר מכן, הפעל את התוכנה עבור ספקטרלי סריקה (ראה טבלה של חומרים), ולחץ על הלחצן ידרשו בראש GUI (איור 3 א).
</li>
	<li>הפעל את התריס תוכנה כדי להפוך את הלבן-אור לייזר (יקלו) שפופרת האופטיקה (PMT) (איור 3 א).</li>
	<li>בחר את מצב xyΛ ברשימה הנפתחת במצב רכישהולאחר מכן, מצב הקלט של לייזר משתנה אוטומטית מ אחוז קבוע כוח קבוע. בטל את תיבת הסימון של תנועה SP אוטומטי. ולאחר מכן, הגדר את חלון ספקטרלי של הלייזר קלט 470 – 670 nm והגודל ספקטרלי שלב 4 nm בΛ-עירור לסרוק למדא הגדרות (איור 3b).</li>
	<li>הגדר את טווח ספקטרלי של PMT 450-690 על-ידי לחיצה כפולה או הזזת הסרגל התאמה עבור טווח הספקטרום (איור 3 c). הערה: טווח הספקטרום הזה צריך לכלול את רוחב הפס מלא של מקור קלט.</li>
	<li>בחר עדשה המטרה טבילה במים, כראוי עם צוהר מספרית גבוהה (NA > 0.7) ולתת ערך כלשהו לשלטון PMT ולייזר להפעלת לחצן לחיות לסרוק וקביעת תצורה של AOBS . לעבור בנתיב האופטי על ידי בדיקת שיקוף במעבר התצורה AOBS (איור 3d).</li>
	<li>הר ראי התייחסות (ראה טבלה של חומרים) על הבמה מיקרוסקופ. צריך לעמוד בפני השטח מראה מול העדשה אובייקטיבי. אם זה לא קל לשים את המראה על הבמה מיקרוסקופ, בונד מראה על צלחת שטוחה (למשל . שקופית זכוכית).</li>
	<li>לשלוט על הבמה מיקרוסקופ כדי ליישר את מטוס מוקד השטח מראה.</li>
	<li>להתאים את עוצמת הלייזר בהתחשב הטווח הדינמי של הגלאי ורווח PMT ולאחר מכן שנה את מצב הקלט של לייזר מ אחוז קבוע לשלטון מתמדת. הערה: כאשר הוא אופייני, PMT לקבל 500 (V) ומשמשים כוח לייזר היחסי של 0.1%-570 ננומטר.</li>
	<li>לאשר במצב צבע מדומה כדי לבדוק שאין לא רוויה לאורך כל טווח אורך הגל. אם נצפית רוויה, הנמך את עוצמת הלייזר (איור 3 א).</li>
	<li>הפעל את הרכישה למדא לסרוק .</li>
	<li>להסיר את השיקוף מן הבמה וחזור הרכישה אותו ללא דגימה לצורך קבלת ההפניה כהה (קרי, היסט כהה).</li>
	<li>לשמור את הנתונים בתבנית Multistacked TIF .</li>
</ol>3. ייבוא תמונות SpeRe
<ol><li>במקום הרקמה רכוב על הבמה מיקרוסקופ. ליישור בערך הרקמה למישור המוקד של העדשה המטרה, השתמש במצב רחב-שדות קרינה פלואורסצנטית דרך עין-קטע.</li>
	<li>גרה סרוק על, לשלוט השלב מיקרוסקופ כדי ליישר את מטוס מוקד לאזור של עניין בתוך הרקמה. כדי למנוע את רעשי הרקע תגית כיסוי, בחר את אזור המטרה לפחות 15 עומק μm מממשק זכוכית-רקמות.</li>
	<li>רוכשים של אוסף התמונות ספקטרלי לאזור היעד באמצעות ההליך אותו כמתואר בצעדים 2.1 – 2.10.</li>
	<li>לשמור את הנתונים הרקמה, ההיסט כהה בפורמט Multistacked TIF . הערה: הנסיין עלול להיעצר בשלב זה.</li>
</ol>4. התמונה עיבוד וניתוח
<ol><li>לפתוח את הנתונים ספקטרלי (טיף multistacked) עבור המראה התייחסות ו על רקמת המוח ב- ImageJ.</li>
	<li>בחר את ROIs (אזורים מעניינים) עבור אוספי תמונות נפתח — אזור מרכזי עבור המראה הפניה, על הקטע של סיב האקסון רקמת המוח.</li>
	<li>לרכוש ספקטרום raw עבור ROIs שנבחרו על ידי פועל התמונה ← ערימות ← מגרש ציר z פרופיל בתפריט ImageJ.</li>
	<li>פתח את נתוני היסט כהה, אחד נלקח במראה של ההפניה, אחרים שנלקחו עבור רקמת המוח.</li>
	<li>לרכוש הספקטרום עבור ההיסטים כהה על ידי פועל התמונה ← ערימות ← מגרש ציר z פרופיל בתפריט ImageJ.</li>
	<li>שמור כל ספקטרום שנרכשו על-ידי שימוש באפשרויות העתק והדבק . הערה: עבור הדמיה SpeRe, שימוש בתחום הדימות המרכזי כדי למזער שיבושים אופטי מהציר מומלץ. הסיבים האקסון עשוי להיות הטרוגניות מבחינה מבנית לכל אורכם. לפיכך, בחירת רועי בקטע האקסון קטן, בדרך כלל < 5 מיקרומטר, כדי למזער את החפץ בנפח חלקי מומלץ.</li>
</ol>5. הבסיס תיקון וניתוח האות SpeRe
<ol><li>להחסיר ספקטרום ההיסט של הספקטרום של המראה התייחסות ל רקמות המוח.</li>
	<li>לנרמל בכל קשת על-ידי חלוקת העוצמה המרבית של הספקטרום.</li>
	<li>לחלק את קשת המנורמל האקסון על ידי הקשת המנורמל של השיקוף הפניה ולחסר DC היסט מהספקטרום מנורמל.</li>
	<li>למדוד את תדירות מספר גל על ידי התאמת הקשת רכשה את sinusoidal עקומת (ראה טבלה של חומרים) ולאחר מכן להמיר את מספר גל רכשה תקופתיות על-ידי לוקח הדדיים.</li>
	<li>להמיר את תקופתיות מספר גל קוטר האקסון בעזרת המשוואה איור 4ג'.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

המחברים להכריז על אינטרסים כלכליים מתחרים: ג'יי קוואן וצ'וי מ הם הממציאים של טכנולוגיית פטנט המתוארות במאמר זה.

SpeRe הוא חדש ללא תווית הדמיה מודאליות בהתבסס על אינטרפרומטריה ספקטרלי, המציעה בפעם הראשונה, את המידע הננומטרי בשידור חי ו דנדריטים. בפרוטוקול הנוכחי רכישה, הרזולוציה המרחבית עבור קוטר האקסון הוא מסדר 10 ננומטר. יתר על כן, SpeRe מנצל הזמנות-הגודל של ערכים מינון אור נמוך יותר בהשוואה microscopies סופר רזולוציה אחרים; לכן חופשי phototoxicity photobleaching. SpeRe יספק שדרה חדש ללמוד הננומטרי הדינמיקה של האקסונים סיבי העצב.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מבוסס על סריקת ספקטרלי מתווכת על-ידי אקוסטו-אופ...

במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק גיאן מהירה ותקינות עצב על-ידי enwrapping הסיבים האקסון עם מעילי פרווה עלי הלוואי קרומיים מרובה שכבות. מבנהו מרובה שכבות מורכב לסירוגין הננומטרי דק-סרטים של ממברנות פלזמה (~ 5 nm), ציטוזול (~ 3 ננומטר), ורווחים חוץ-תאית (~ 7 ננומטר)1,2. מיקרוסקופ אופטי, כולל את מיקרוסקופ ברזולוציה-העל האחרונה, אינם מתאימים להתבוננות הדינמיקות המיאלין הננומטרי בשל הרזולוציה שלהן לא מספיק בשל עקיפה אופטי3,4,5. למרות מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לספק פרטים עדינים של ננו-מבנה המיאלין, זה לא תואם עם המערכות הביולוגיות חיים עקב ההכנות מדגם פולשני ביותר מעורבים קיבוע כימי ו ultrasectioning6,7 . עד לאחרונה היו לא טכניקה ישים להתבונן הננומטרי דינמיקת ו דנדריטים באתרו בתוך.
. Schain et al. דיווח בעבר ו דנדריטים התערוכה השתקפות אור צבעוני8. על ידי אימוץ הניתוח spectroscopic על האור המוחזר, אנחנו תכנן מודאליות הדמיה חדשה עבור ננו הדמיה של ו דנדריטים, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe)9. SpeRe מבוסס על ההפרעות סרט דק המתרחשים במבנה רב שכבתית של למעטפת מיאלין (איור 1). על ידי הדמיה אופטיים על אקסונים שונים, נחשפו כי הקשת השתקפות היא פונקציה מחזורית של מספר גל תקופתיות שלה (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) הוא ביחס הפוך ל קוטר האקסון (d). מערכת היחסים הזו פשוטה (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) מציע נתיישב כימות של קוטר האקסון של הנתונים SpeRe. ניצול זה, חשפנו את האקסון ונפוצים בולטות תחת פציעת מוח טראומטית קלה בדוח הקודם שלנו.
מערכת SpeRe מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית מורכב מקור לייזר מיוחדים, מסננים (איור 2). מקור קלט הוא לבן-אור לייזר, מתן הפס הרחב פלט ספקטרלי הגלויים לאזורים אינפרא-אדום. עבור הסריקה ספקטרלי, המערכת הינו מצויד עם שני התקנים אקוסטו אופטי: אקוסטו אופטי tunable מסנן (AOTF) להעברת אורך גל שנבחרו מן המקור פס קלט של הפיצול קרן אקוסטו אופטי (AOBS) עבור המנחה שנבחר משתקפת גל את הגלאי. התוכנה עבור היפרספקטרליות מיקרוסקופיה קונפוקלית (ראה טבלה של חומרים) מספק אפשרות להתאמה אישית סריקה ספקטרלי לרכוש ברצף התמונות השתקפות קלט באורכי גל שונים. בנוסף, אברציה כרומטית יכול להתערב באורח קשה במדידה ספקטרלי; לכן, השימוש העדשה המטרה עדשה אפוכרומטית מומלץ.
ראוי לציין, אור לבן לייזרים לייצר פלט ספקטרלי לא אחידה, רכיבים אופטיים גם להשפיע על הפרופיל ספקטרלי. לכן, ספקטרום רכשה לכייל לניתוח כמותי עוקבות. מראה כסוף מוגן משמש בדרך כלל כנקודת התייחסות, אשר מספק של השתקפות כמעט קבוע (&gt; 97%) השתלטה על האזור מלא גלוי. ספקטרום שנרכשו לאחר מכן מחולקים לפי ספקטרום הפניה מן המראה.
גודל הצעד ספקטרלי עבור הסריקה ספקטרלי קובעת את מהירות הרכישה; לכן, זה צריך להיות מותאם. כמו האקסון גדולים יותר יש תקופה ספקטרלי גבוה יותר, זה דורש עדין ספקטרלי הדגימה. לדוגמה, האקסון בקוטר של 10 מיקרומטר, אחד האקסונים הפיזיולוגיות הגדול, יש תקופה ספקטרלי של ~ 8 nm. על-ידי החלת קריטריונים הדגימה של נייקוויסט, אנחנו מועסקים את מרווח הדגימה ספקטרלי של 4 nm כדי לכסות כל האקסונים הפיזיולוגיות ברקמות העכבר לחוץ. גישה זו נמשכת בדרך כלל במשך מספר שניות לקבלת סריקה מלאה ספקטרלי, ולכן הוא לא מתאים ליישומי ויוו , איפה הפיזיולוגיות תנועה (למשל נשימה ואת קצב לב) משבש את רכישת ספקטרלי יציב. בעבר פתרנו בעיה זו על-ידי instrumenting מיקרוסקופ זקופה המותאמת אישית, שנועדה להשיג את ספקטרום מלא עבור כל נקודה באמצעות ספקטרומטר של המערך (≈ מהירות של רכישת 30 ms לפיקסל).
בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט על ההדמיה SpeRe על פרוסה המוח קבוע, אשר ניתן לבצע במיקרוסקופ היפרספקטרליות המסחרי (ראה טבלה של חומרים). כך, הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי ניסויים ללא התמחות במכשור אופטי. אנחנו גם לכסות את בעיות אפשריות לפתרון בעיות עבור רכישת וניתוח של נתונים SpeRe.

<table><tbody><tr><td>חותך זכוכית</td> <td>-</td><td></td> <td>ניתן לרכוש בחנות נוחות מקומית או בחנויות מקוונות.</td></tr><tr><td>לק</td> <td>-</td><td></td> <td>ניתן לרכוש בחנות נוחות מקומית או בחנויות מקוונות.</td></tr><tr><td>אובייקט אפוכרומט 40 פעמים;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>סוג טבילה במים</td></tr><tr><td>פלואורומיאלין ירוק</td><td>תרמו פישר</td><td>F34651</td><td>לחלופין, ניתן להשתמש בפלואורומיאלין אדום (F34652).</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Leica SP8 TCS</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>עיין ב"תצורת המיקרוסקופ" בסעיף המבוא לפרטים.</td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>מצופה כסף מוגן.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td> <td>טכנולוגיות חיים</td><td>14190-136-Paraformaldehyde</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v ב-PBS</td></tr><tr><td>כיסוי להחליק</td><td>תרמו פישר</td><td>3306</td><td>עובי: #1 (0.13 עד 0.17 מ"מ)</td></tr> <tr><td>זכוכית שקופית</td><td>מוטו כימיקלים טהורים</td><td>5116-20F</td><td>עובי: ~ 1 מ"מ</td></tr><tr><td>דבק סופר</td><td>הנקל</td><td>לוקטיט 406</td><td>השתמש בציוד ניפוק כדי להימנע ממגע עם העור או העיניים.</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000</td><td></td></tr> <tr><td>DUAL-Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td></td> <td>VT1200S-לייזר</td></tr> <tr><td>אור לבן</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 הופסק והוחלף ב-EXU-6.</td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופ reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק בידוד חשמלי על-ידי enwrapping הסיבים האקסון ספירלה מרובה שכבות. בהשראת הארכיטקטורה subcellular-מאורגן, לאחרונה פיתחנו מודאליות הדמיה חדשה, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe), המאפשרת הדמיה ננו ללא תווית חסרת תקדים של חיה ו דנדריטים בתוך באתרו. העיקרון הבסיסי הוא לקבל מידע nanostructural על-ידי ניתוח הספקטרום השתקפות של המבנה subcellular מרובה שכבות. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לביצוע של הדמיה SpeRe בסיסיים של רקמות עצבים משתמש מסחרי במערכת מיקרוסקופיים קונאפוקלית, מצוידים לייזר אור לבן, מסנן tunable. אנחנו מכסים את תהליכי הכנת הדוגמא, רכישת נתונים ספקטרלי, עיבוד להשגת מידע nanostructural תמונה.

לפי הפרוטוקול, פרוסה המוח קבוע הוכן עם צביעת אקסוגני, fluorophore של פילוח מיאלין (ראה טבלה של חומרים). הדמיה SpeRe בוצעה על הפרוסה המוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי היפרספקטרליות מסחרי בשיתוף עם פלורסצנטיות קונאפוקלית הדמיה (איור 4a). עבור SpeRe, עוצמת קלט אופטי היה מוגדר µW/מיקרומטר 52 עם זמן להתעכב פיקסל של ~ 1 µs. מינון אור זה נגמר סדר-הגודל של ערכים נמוכים יותר קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופיה קונפוקלית<sup class="xre...

כאן, אנו מציגים עבור הדמיה ו דנדריטים בפרוסה המוח קבוע באמצעות ננו ללא תווית הדמיה הטכניקה מבוססת על reflectometry ספקטרלי פרוטוקול צעד אחר צעד.

מיקרוסקופ Reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

השיטה הזו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיאלין, כמו למשל פלסטיות מיאלין ודמיאלינציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור את הננו-מבנה של אקסון מיאליני ברקמת מוח שלמה ללא כל תיוג מורכב או הכנת דגימה. כאן, נדגים את היישום בפרוסת מוח, אך ניתן להרחיב את הטכניקה הזו לחיות חיות.לאחר קיבוע וחיתוך רקמת מוח של עכבר לפי פרוטוקול הטקסט, הכינו שקופית זכוכית אחת ושתי כוסות כיסוי לכל פרוסת רקמה. השתמש בחותך זכוכית כדי לחתוך את אחת מכוסות הכיסוי המרובע לשניים. לאחר מכן, צור מרווח באמצעות דבק-על כדי לחבר את שני החלקים על מגלשת הזכוכית.בעזרת מברשת או פיפטה, קצרו פרוסת מוח והניחו את הרקמה על מגלשת זכוכית בין המרווח, תוך הקפדה לא לקפל את הרקמה. הוצא 100 מיקרוליטר PBS על משטח הרקמה. לאחר מכן, הניחו את זכוכית הכיסוי המרובעת השנייה על החלק העליון של הטישו תוך הימנעות מהכנסת בועות אוויר.השתמש בלק כדי לאטום סביב זכוכית הכיסוי כדי למנוע אידוי של PBS וזיהום על ידי אבק במהלך הפעלת ההדמיה שלאחר מכן. לפחות שעה לפני ההדמיה, הפעל את המיקרוסקופ כדי לאפשר ייצוב תרמי של מקור הלייזר. לאחר מכן הפעל את התוכנה לסריקה ספקטרלית ולחץ על כפתור הרכישה בחלק העליון של ממשק המשתמש הגרפי.הפעל את תריס התוכנה עבור לייזר האור הלבן וצינור מכפיל האור. במצב רכישה, בחר במצב XY lambda ברשימה הנפתחת. לאחר מכן, מצב קלט הלייזר משתנה אוטומטית מאחוז קבוע להספק קבוע.תחת עירור למבדה, הגדרות סריקת למבדה, בטל את הסימון בתיבת התנועה האוטומטית של SP והגדר את החלון הספקטרלי עבור לייזר הקלט ל-470 עד 670 ננומטר ואת גודל הצעד הספקטרלי לארבעה ננומטר. הגדר את הטווח הספקטרלי של PMT ל- 450 עד 690 ננומטר על ידי לחיצה כפולה או הזזת סרגל הכוונון עבור הטווח הספקטרלי. בחר עדשה אובייקטיבית טבולה במים המתאימה עם צמצם מספרי גבוה.תן כל ערך ל-PMT ולעוצמת הלייזר כדי להפעיל את תצורת AOBS וכפתור הסריקה החיה. תחת תצורת AOBS, עבור לנתיב האופטי על ידי בדיקת השתקפות. לאחר מכן, הרכיב מראה ייחוס על המיקרוסקופ tagכשהמשטח פונה לעדשת האובייקטיב.אם לא קל לשים את המראה על במת המיקרוסקופ, הדביקו מראה על הצלחת השטוחה. כוונן את המיקרוסקופ stagכדי ליישר את מישור המוקד לפני השטח של המראה. לאחר מכן, כוונן את רווח ה-PMT ואת עוצמת הלייזר, בהתחשב בטווח הדינמי של הגלאי.תחת פסאודו-צבע, בדוק שאין רוויה בכל טווח אורכי הגל. אם נצפתה רוויה, הורד את עוצמת הלייזר. לאחר מכן הפעל את רכישת סריקת הלמבדה.הסר את המראה מהבמה וחזור על אותה רכישה ללא דגימה על מנת לקבל את ההתייחסות הכהה. לאחר מכן שמור את הנתונים בפורמט TIF מרובה ערימות. כדי לבצע רכישת תמונת SpeRe, הנח את הרקמה המותקנת על במת המיקרוסקופ.כדי ליישר בערך את הרקמה למישור המוקד של עדשת האובייקט, באמצעות עינית השתמש במצב פלואורסצנטי בשדה רחב. כאשר הסריקה החיה מופעלת, שלוט בשלב המיקרוסקופ כדי ליישר את מישור המוקד לאזור העניין ברקמה. כדי למנוע רעשי רקע מהחלקת הכיסוי, בחר אזור יעד בעומק של לפחות 15 מיקרומטר מממשק רקמת הזכוכית.רכוש את ערימת התמונות הספקטרליות עבור אזור היעד באמצעות אותו הליך שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר מכן שמור את הנתונים עבור הרקמה והקיזוז הכהה בפורמט TIF מרובה ערימות. כדי לעבד את התמונות ב-ImageJ, פתח את הנתונים הספקטרליים עבור מראת הייחוס ורקמת המוח.בחר את ההחזר על ההשקעה עבור ערימות התמונות שנפתחו, את האזור המרכזי עבור מראת הייחוס ואת המקטע של סיב אקסון עבור רקמת המוח. לאחר מכן הפעל תמונה, ערימות, מתווה פרופיל ציר Z כדי לרכוש את הספקטרום הגולמי עבור החזר ה-ROI שנבחר. סיבי האקסון עשויים להיות הטרוגניים מבחינה מבנית לאורכם, לפיכך, מומלץ לבחור את ההחזר על ההשקעה על מקטע אקסון קטן בדרך כלל פחות מחמישה מיקרומטר כדי למזער חפצי נפח חלקיים.פתח את נתוני ההיסט הכהים, אחד נלקח עבור מראת הייחוס והשני עבור רקמת המוח, ושרטט את פרופיל ציר ה-Z כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן השתמש באפשרויות ההעתקה וההדבקה כדי לשמור את כל האפשרויות שנרכשו. כדי לבצע תיקון בסיסי וניתוח אותות SpeRe, הפחיתו את ספקטרום ההיסט מהספקטרום של מראת הייחוס ורקמות המוח.נרמל כל ספקטרום על ידי חלוקת העוצמה המקסימלית של הספקטרום. הזן את מספר הגל על ידי לקיחת אורך הגל ההדדי המשמש בניסוי, נרמל את הספקטרום של האקסון על ידי חלוקת זה של מראת הייחוס, והפחית היסט DC מהספקטרום המנורמל. ואז להשיג את תדר מספר הגל על ידי התאמת הספקטרום הנרכש לסינוסואיד.המר את תדר מספר הגל הנרכש למחזוריות על ידי לקיחת ההדדיות והמר את מחזוריות מספר הגל לקוטר האקסון באמצעות המשוואה המוצגת כאן. בניסוי זה, פרוסות מוח קבועות נצבעו פלואורסצנטית כנגד מיאלין והדמיית SpeRe בוצעה במינון אור נמוך בסדר גודל ממיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית קונבנציונלית. אות ה-SpeRe היה ממוקם לאורך מרכז האקסונים המיאליניים כצפוי על ידי הגיאומטריה של ההשתקפות האופטית.מהספקטרום הרפלקנטי של מקטע אקסון, התקבלה מחזוריות מספר הגל, שהומרה לאחר מכן לקוטר האקסון. גרף זה ממחיש פרופיל רוחבי של עוצמת הקרינה מהאזור הסגור כאן, והקוטר שנמדד על ידי SpeRe נמצא תואם היטב את המדידה המבוססת על הקרינה. הדמיית SpeRe מבוססת על השתקפות אופטית.לפיכך, כיסוי על בסיס סיליקה יכול להכניס רעשי רקע משמעותיים. במערך האופטיקה, רעשי הרקע היו ניכרים כאשר עומק ההדמיה מהחלקה היה פחות מחמישה מיקרומטרים, אך נמנע כאשר עומק ההדמיה גדול מ-15 מיקרומטר. שלב הכיול אינו נדרש לכל ניסוי אך מומלץ לפחות פעם בשבוע.לאחר השלמת הכיול, ניתן לסיים את הליך ההדמיה בדרך כלל תוך 20 שניות עבור כל שדה ראייה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקחת בחשבון את ההשהיה הדינמית של הגלאי לסריקת ספקטרום מלא. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג את הננו-מבנה מאקסונים מיאליניים באמצעות תמונות השתקפות.

spectral-reflectometric-microscopy-on-myelinated-axons-in-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

מקור: Kwon, J.,  et al., מיקרוסקופיה רפלקטומטרית ספקטרלית על אקסונים מיאליניים באתרם.  J. Vis. Exp. (2018)} סרטון זה מדגים את השימוש ברפלקטומטריה ספקטרלית עם מיקרוסקופ קונפוקלי היפרספקטרלי כדי לנתח דפוסי התאבכות ולקבוע קוטר אקסונים מיאליניים בפרוסות רקמת מוח קבועות.

שימוש ברפלקטומטריה ספקטרלית לקביעת קוטר אקסון מיאליני בפרוסת מוח קבועה של עכבר

מקור: McCullagh, E. A., et al. יישום קוהרנטי של ספקטרוסקופיית רמאן אנטי-סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים הדמיה פלואורסצנטית וספקטרוסקופיה קוהרנטית של רמאן אנטי-סטוקס (CARS) כדי להמחיש ארכיטקטורה עצבית ברקמת מוח של מכרסמים. צביעת Nissl מסמנת גופי תאים על ידי קשירה ל-RNA ריבוזומלי, בעוד שהדמיית CARS מכוונת למיאלין עשיר בשומנים באמצעות אותות המושרים בלייזר. שכבת תמונות הקרינה וה-CARS מספקת תצוגה מפורטת של גופי תאים ואקסונים מיאליניים.

ספקטרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן להדמיית נוירונים מיאליניים ברקמת מוח של עכבר

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופ זמן-lapse של עירור שני פוטונים כדי לדמיין בו זמנית את הדינמיקה של פגיעות אקסון ומיאלין בזמן אמת. פרוטוקול מוצע זה מאפשר מחקרים של גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד שיכולים להשפיע על גורל האקסון המיאליני המרכזי לאחר פציעה ולתרום לנכות קלינית קבועה.

Ex Vivo חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

הדמיה של מיאלינציה היא מטרה חשובה עבור חוקרים רבים החוקרים את מערכת העצבים. CARS היא טכניקה התואמת את האימונופלואורסצנציה שיכולה לדמות באופן טבעי שומנים בתוך רקמות כגון המוח המאיר מבנים מיוחדים כגון מיאלין.

יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) משמשת כמודל של בעלי חיים לטרשת נפוצה. מאמר זה מתאר גישה לניקוד דלקת בחוט השדרה, דמיאלינציה ופגיעה אקסונלית ב- EAE. בנוסף, מוצגת שיטה לכימות רמות האור של נוירופילמנט מסיס בסרום העכברים, המאפשרת הערכה של פגיעה אקסונלית בעכברים חיים.

ניקוד דלקת במערכת העצבים המרכזית, דמיאלינציה ופגיעה באקסון באנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

למדו מיקרוסקופיית רפלקטומטריה ספקטרלית לניתוח ננו-מבני של אקסונים מיאליניים במוח עכברים קבועים ללא ציון. השיטה מאפשרת מדידת קוטר אקסונים בדיוק גבוה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם לייזר לבן.

מיקרוסקופ Reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר

גלה סרטונים נוספים