ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית
15 באוקטובר 2018
ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.
כיום ספקטרומטריית מסה ממלאת תפקיד חשוב בביולוגיה מבנית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על מקרומולקולים ביולוגיים חשובים במצבם הטבעי, במיוחד חלבונים ותסביך חלבונים. ספקטרומטריית מסה מקומית ישימה באופן נרחב למגוון מכלילים ביומולקולריים כולל מערכות מולטיפרוטאין וחומצת גרעין.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ורגישה מאוד. זה יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגניים, לאפשר לנתח חלבונים מרובים במצב אוליגומרי בו זמנית. מדגים את ההליך יהיה אנדי לאו, דוקטורנט בקבוצה שלי.
כדי להתחיל בהליך זה, הכן את נימי הבית עבור nanoelectrospray כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן מדגם ללא ליגנד כפקד עבור כל ריצה כמו חילופי מאגר כל לתוך אצטט אמוניום. לאחר מכן, בחר את מצבי TOF של רגישות, רכישת יון חיובית וניידות.
לאחר מכן הפעל את גזי המלכודת, ה- API וה- IMS. להפרדת הודעות מיידיות השתמש בנקודות ההתחלה של החנקן והארגון המוצגות כאן והתאם לפי הצורך. הגדר טווח רכישה מתאים של m/z.
עבור חלבון לא ידוע, שלבי המיטוב הראשוניים צריכים להשתמש במגוון רחב. הכנס את נימי מצופה זהב לתוך מחזיק נימי. לאחר מכן לטעון בין שניים לשלושה microliters של פתרון חלבון מורכב של עניין לתוך נימי.
הדק בעדינות את נימי והצב אותו על שלב מקור האלקטרוספריי. החלק את השלב למקומו כדי להתחיל להשיג נתונים. החל לחץ גז ננו-זרימה נמוך עד טיפה נוצרת בקצה נימי.
להזיז את נימי ביחס קונוס לפקח על זרם היון כדי להשיג זרם יון יציב. יש למרוח מתח נימי בטווח שבין 0.9 ל-1.6 קילו-וולט. לאחר מכן הגדר את חרוט הדגימה, היסט המקור, טמפרטורת המקור וזרימת גז הקונוס כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
כדי לרכוש ספקטרום מסה פתור היטב והעברת יון מוגדלת, התאם את הפרמטרים של MS ונטר את השינוי שנוצר בספקטרום. הגדר את אנרגיית התנגשות המלכודת לנקודת התחלה ראשונית בין 10 ל -50 וולט. אם קיזוזי המתח אינם מספיקים, התאימו את אנרגיות התנגשות המלכודת.
הגדר את המלכודת באמצעות המתח שלה לנקודת התחלה ראשונית בין 20 ל 45 וולט. לשפר את השממה על ידי אופטימיזציה של מתח זה. לאחר מכן, מטב את מהירות הגל ואת גובה הגל כפי שמתואר בטקסט כדי להשיג את הפרדת הניידות הטובה ביותר.
במחקרים הקשורים הרה ונורה להשתמש במהירות גל של 40 מטר לשנייה וגובה הגל בין 550 ל 650 וולט. לניתוח קשירה DNA, מערבבים את החלבון וה- DNA ביחס תבוני המאפשר היווצרות מורכבת של DNA חלבון. הוסף כמויות הולכות וגדלות של כל אחד מהאפשרויות הבאות, 5'O-3-thio-triphosphate, מלח טטרליתיום או ADP.
באמצעות תוכנה מתאימה למדוד את ההמונים של מינים שנוצרו ולזהות את קשירה ligand, כגון ATP ו ADP מחייב מצבים אוליגומריים. לאחר מכן השתמשו במפרטורות היונים שנצפו בספקטרום ESI MS הגולמי כדי לכמת את השפע היחסי המתאים של מינים. לאחר אופטימיזציה של תנאי המכשיר להעברה יציבה, הפחת את אנרגיית ההתנגשות ואת חרוט הדגימה נמוך ככל האפשר, תוך שמירה על איכות ספקטרום טובה.
השתמש במהירות הגל הממוטבת ובגובה הגל שנקבעו בעבר כדי להשיג הודעות מיידיות MS. למדוד את זמן סחף היונים בשלוש מהויות גל שונות תוך שמירה על אותו גובה גל. כדי לקבוע את יון החלבון CCS למדוד ארבעה כיול חלבון, שניים עם המסה מעל החלבון תחת חקירה ושניים עם המסה למטה, באמצעות אותם תנאי מכשור. ראשית, להכין את דגימות החלבון ואת המאגר להחליף אותם אמוניום אצטט כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הוסף ממס במרווחים של 10%עד שתגיע לסכום הרצוי. דגירה על קרח במשך שעה אחת. לאחר מכן, רכוש ספקטרום IM-MS עבור כל מדגם.
באמצעות תוכנת SUMMIT, הקצו תת-קומפלקסים של חלבונים וייצרו רשתות אינטראקציה עם חלבונים. לחלופין, ליצור באופן ידני רשימה של מסות תיאורטיות עבור המינים הצפויים. כדי להתחיל לחקור את היציבות המורכבת של החלבון, הקליטו נתוני IM-MS תוך הגדלת מתח האצת המלכודת מ-10 וולט ל-200 וולט, שייפתחו בהדרגה לשלב החלבון והגז.
נתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה והפיק התוויות מתפתחות דו-ממדיות על-ידי ערימת הפצות CCS מנורמלות בעוצמה בכל מתח מאיץ עבור כל מצב טעינה. תוצאות MS מקוריות חושפות את המצב האוליגומרי, ההרכב והטופולוגיה של מתחם HerA ו- NurA. כמו אינטראקציות noncovalent נשמרים בשלב הגז, MS יליד של ATP גמא S ו ADP titration ניסויים, משמשים כדי לקבוע את מחייב נוקלאוטידים חכם זוג ב HerA ו NurA.
ספקטרום מסה של מצבים אוליגומריים HerA לגלות כי הגדלת ריכוז ATP גמא S מגביר את העוצמה היחסית של HerA הקסמרית. ערכי ה- CCS הניסיוניים עבור החלבונים והתסביךים שלהם נגזרים לאחר מכן מניסויי IM-MS. ערכים אלה נתפסים יש הסכמה טובה עם מדידות תיאורטיות מקריסטלוגרפיה רנטגן, אשר מאמת באמצעות ערכי CCS לבניית מודלים ברזולוציה נמוכה של הרכבת חלבון.
ניתוח CIU ו- KEcom מגלה כי הדנ"א קשור HerA-NurA הוא יציב יותר מאשר קומפלקס ללא DNA. ניתוח CIU MS והמדינות המחייבות ATP בהתאמה מראים כי ארבעת המצב המאוגד של ATP גמא S מפחיתים יציבות מורכבת בשלב הגז. עם זאת, ששת המדינות המאוגדות ATP gamma S שבהן כל האתרים מאוכלסים, נתפסות כיציבות ביותר.
מדידות מדויקות של המסה המולקולרית של קומפלקס שלם מספקות תובנה חשובה על אפיון ביומולקולרי. אנחנו יכולים לקבל מידע על מסלולי הרכבה מורכבים, אוליגומריזציה של חלבונים וקשירת ליגנד. שילוב כל המידע הזה מאפשר ליצור מודלים מפורטים של מכלים ביולוגיים תפקודיים.
סקירה כללית
מאמר זה דן ביישום של ספקטרומטריה של מסות (MS) בביולוגיה מבנית, ובמיוחד לניתוח של קומפלקסים של חלבונים ואינטראקציות של ליגנדים. השילוב של טכניקות המבוססות על MS מאפשר חקירה של מכלולים מקרומולקולריים במצבם הטבעי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- ספקטרומטריית מסות
- ניתוח קומפלקסים של חלבונים
רקע
- ספקטרומטריית מסות היא קריטית לחקר מקרו-מולקולות ביולוגיות.
- ספקטרומטריית מסות במצב טבעי (Native mass spectrometry) מאפשרת ניתוח של חלבונים במצבם הטבעי.
- טכניקה זו היא מהירה ובעלת רגישות גבוהה.
- היא מאפשרת לנתח חלבונים מרובים במצבים אוליגומריים בו-זמנית.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש בספקטרומטריית מסות בניתוח של קישור ליגנדים והיווצרות קומפלקסים של חלבונים.
- לאפטמיזציה של פרמטרי MS להשגת רכישת נתונים טובה יותר.
- לספק תובנות לגבי אפיון ביומולקולרי ויציבות של קומפלקסים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות חלבון והחלפת בופר.
- אופטימיזציה של פרמטרי MS עבור תמסורת יונים ורזולוציה.
- שימוש בספקטרומטריית ניידות יונים (IMS) לניתוח קומפלקסים של חלבונים.
- ניתוח נתונים באמצעות תוכנה ליצירת רשתות אינטראקציה של חלבונים.
תוצאות עיקריות
- MS נייטיב חושפת מצבים אוליגומריים ואינטראקציות קישור של חלבונים.
- תוצאות ניסיוניות תואמות למדידות תיאורטיות מקריסטלוגרפיה של קרני X.
- ניתן להעריך את יציבותם של קומפלקסים של חלבונים באמצעות התאמות של אנרגיית התנגשות.
- ניתוח קישור ליגנד מספק תובנות לגבי אינטראקציות בין חלבון ל-DNA.
מסקנות
- ספקטרומטריית מסות היא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקה של חלבונים.
- היא מאפשרת יצירה של מודלים מפורטים של מכלולים ביולוגיים.
- הבנת היציבות של קומפלקסים ואינטראקציות של ליגנדים היא קריטית למחקר ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ספקטרומטריית מסות מבנית אינטגרטיבית מאפשרת לצוותים בביופארמה להפחית סיכונים בתהליך של תיקוף מטרות (target validation) באמצעות אספקת תובנות כמותיות במצב טבעי (native-state) על הרכבת קומפלקסים של חלבונים, אוליגומריזציה וקישור ליגנדים. גישה זו תומכת בהחלטות בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן ביטחון מבני לגבי היפותזות מכניסטיות וצמצום העמימות בתיקוף מסלולים. השיטה משפרת את הערך החזוי לזיהוי מובילים (lead identification) ולהתקדמות פרה-קלינית באמצעות אספקת נתונים מבניים הניתנים לשחזור ובדיקה בין פלטפורמות שונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה ישירה של מצבי אוליגומריזציה של חלבונים וסטוכיומטריה של תתי-יחידות בתנאים טבעיים.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי אפיון שינויים קונפורמציוניים מושאיים ליגנדים וממשקי קישור בקומפלקסים של תיקון protein-DNA.
- ערך תפעולי: מספק סריקה מהירה ורגישה של דגימות הטרוגניות להערכת מעורבות המטרה והיווצרות קומפלקסים בתנאים קרובים לפיזיולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר חלקיקי חתך התנגשויות (CCS) כמותיים המופקים מניידות יונים, המשמשים כנקודות ייחוס מבניות לסטנדרטיזציה של בדיקות ולשחזוריות.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מותקפות עבור זרימות עבודה המשך, על ידי אישור שלם של קומפלקסים ותפוסת ליגנדים לפני סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים להחלפת בופר ולהכנת קפילרות, הישמימים למספר מטרות חלבוניות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות מבניות רלוונטיות למחלה לגבי קומפלקסים של חלבונים נקשרי-DNA, ובכך תומך בהלימה של ביומרקרים תרגומיים עבור מטרות המעורבות במסלולי שעתוק ותיקון.
- ערך מדעי: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור תפוסת ליגנדים (למשל, ATP/ADP) ליציבות הקומפלקס באמצעות ניתוחי פריסה בהשראת התנגשות (collision-induced unfolding) והתפלגות אנרגיה קינטית.
- ערך תפעולי: מסייע בקבלת החלטאות על קידום מותאם סיכונים באמצעות אספקת מדדי יציבות כמותיים המנחים את קריטריוני ה-go/no-go בתיקוף פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת נתונים מבניים המנחים את בדיקת ההשערות, הערכת התרכובות והרציפות התרגומית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי פתרון מצבים אוליגומריים וטופולוגיה של קומפלקסים חלבוניים המעורבים במנגנוני תיקון DNA.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הפרדה הדירה של ניידות יונים וזיהוי ספקטרומטרי של מסות של מצבי apo ומצבים קשורי-ליגנד באופן הדיר.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של מסה, שטח חתך התנגשויות ושפע יחסי, המאפשרים השוואה בין תנאי קישור של ליגנדים לבין יציבות הקומפלקס.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הגילוי לרצף פרה-קליני על ידי תיקוף של מודלים מבניים מול נתוני CCS ניסיוניים, ובכך תומכת בבחירת מטרות המותאמות לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת יכולת לשימוש חוזר לאפיון קומפלקסים חלבוניים מגוונים, כולל מערכות קשורות-DNA ומערכות ממברנה, על פני מספר פרויקטי גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות תצפית ישירה על שינויים מבניים המושרים על ידי ליגנד.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרמטרי מכשיר מותאמים וזרימות עבודה סטנדרטיות להכנת דגימות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי אספקת ראיות מבניות למעורבות המטרה וליציבות הקומפלקס, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם-סיכון בהתבסס על פרופילים מבניים ודינמיים מתוקתקים מנתוני native MS.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בספקטרומטריית מסה נייטיבית (native mass spectrometry), ניידות יונים ופירוש נתונים מבניים.
- תלוי בגישה לפלטפורמות MS ברזולוציה גבוהה עם יכולות IM-MS ובקרות מכויילות של אנרגיית התנגשות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת הדגימות, כולל החלפת בופר לאמmonium acetate נדיף.
- כולל שיקולי התאמה לגדלי חלבונים משתנים, קומפלקסים וסוגי ליגנדים במערכות ביולוגיות שונות.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות ליציבות קומפלקסים בשלב הגזי ולצורך בתיקוף אורתוגונלי באמצעות קריסטלוגרפיה או cryo-EM לצורך מידול ברזולוציה גבוהה.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Native MS Acquisition and Analysis for Investigating Protein Complexes and Protein-Ligand Complexes
3:51
Acquiring and Analyzing IM-MS
4:34
In-Solution Disruption of Protein Complexes for Native MS and IM-MS Led Structure Determination and Investigating Protein Complex Stability using Collision Induced Unfolding
5:45
Results: Integrative Structural Mass Spectrometry of Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes
7:05
Conclusion
