ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

כיום ספקטרומטריית מסה ממלאת תפקיד חשוב בביולוגיה מבנית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על מקרומולקולים ביולוגיים חשובים במצבם הטבעי, במיוחד חלבונים ותסביך חלבונים. ספקטרומטריית מסה מקומית ישימה באופן נרחב למגוון מכלילים ביומולקולריים כולל מערכות מולטיפרוטאין וחומצת גרעין.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ורגישה מאוד. זה יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגניים, לאפשר לנתח חלבונים מרובים במצב אוליגומרי בו זמנית. מדגים את ההליך יהיה אנדי לאו, דוקטורנט בקבוצה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, הכן את נימי הבית עבור nanoelectrospray כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן מדגם ללא ליגנד כפקד עבור כל ריצה כמו חילופי מאגר כל לתוך אצטט אמוניום. לאחר מכן, בחר את מצבי TOF של רגישות, רכישת יון חיובית וניידות.

לאחר מכן הפעל את גזי המלכודת, ה- API וה- IMS. להפרדת הודעות מיידיות השתמש בנקודות ההתחלה של החנקן והארגון המוצגות כאן והתאם לפי הצורך. הגדר טווח רכישה מתאים של m/z.

עבור חלבון לא ידוע, שלבי המיטוב הראשוניים צריכים להשתמש במגוון רחב. הכנס את נימי מצופה זהב לתוך מחזיק נימי. לאחר מכן לטעון בין שניים לשלושה microliters של פתרון חלבון מורכב של עניין לתוך נימי.

הדק בעדינות את נימי והצב אותו על שלב מקור האלקטרוספריי. החלק את השלב למקומו כדי להתחיל להשיג נתונים. החל לחץ גז ננו-זרימה נמוך עד טיפה נוצרת בקצה נימי.

להזיז את נימי ביחס קונוס לפקח על זרם היון כדי להשיג זרם יון יציב. יש למרוח מתח נימי בטווח שבין 0.9 ל-1.6 קילו-וולט. לאחר מכן הגדר את חרוט הדגימה, היסט המקור, טמפרטורת המקור וזרימת גז הקונוס כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

כדי לרכוש ספקטרום מסה פתור היטב והעברת יון מוגדלת, התאם את הפרמטרים של MS ונטר את השינוי שנוצר בספקטרום. הגדר את אנרגיית התנגשות המלכודת לנקודת התחלה ראשונית בין 10 ל -50 וולט. אם קיזוזי המתח אינם מספיקים, התאימו את אנרגיות התנגשות המלכודת.

הגדר את המלכודת באמצעות המתח שלה לנקודת התחלה ראשונית בין 20 ל 45 וולט. לשפר את השממה על ידי אופטימיזציה של מתח זה. לאחר מכן, מטב את מהירות הגל ואת גובה הגל כפי שמתואר בטקסט כדי להשיג את הפרדת הניידות הטובה ביותר.

במחקרים הקשורים הרה ונורה להשתמש במהירות גל של 40 מטר לשנייה וגובה הגל בין 550 ל 650 וולט. לניתוח קשירה DNA, מערבבים את החלבון וה- DNA ביחס תבוני המאפשר היווצרות מורכבת של DNA חלבון. הוסף כמויות הולכות וגדלות של כל אחד מהאפשרויות הבאות, 5’O-3-thio-triphosphate, מלח טטרליתיום או ADP.

באמצעות תוכנה מתאימה למדוד את ההמונים של מינים שנוצרו ולזהות את קשירה ligand, כגון ATP ו ADP מחייב מצבים אוליגומריים. לאחר מכן השתמשו במפרטורות היונים שנצפו בספקטרום ESI MS הגולמי כדי לכמת את השפע היחסי המתאים של מינים. לאחר אופטימיזציה של תנאי המכשיר להעברה יציבה, הפחת את אנרגיית ההתנגשות ואת חרוט הדגימה נמוך ככל האפשר, תוך שמירה על איכות ספקטרום טובה.

השתמש במהירות הגל הממוטבת ובגובה הגל שנקבעו בעבר כדי להשיג הודעות מיידיות MS. למדוד את זמן סחף היונים בשלוש מהויות גל שונות תוך שמירה על אותו גובה גל. כדי לקבוע את יון החלבון CCS למדוד ארבעה כיול חלבון, שניים עם המסה מעל החלבון תחת חקירה ושניים עם המסה למטה, באמצעות אותם תנאי מכשור. ראשית, להכין את דגימות החלבון ואת המאגר להחליף אותם אמוניום אצטט כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הוסף ממס במרווחים של 10%עד שתגיע לסכום הרצוי. דגירה על קרח במשך שעה אחת. לאחר מכן, רכוש ספקטרום IM-MS עבור כל מדגם.

באמצעות תוכנת SUMMIT, הקצו תת-קומפלקסים של חלבונים וייצרו רשתות אינטראקציה עם חלבונים. לחלופין, ליצור באופן ידני רשימה של מסות תיאורטיות עבור המינים הצפויים. כדי להתחיל לחקור את היציבות המורכבת של החלבון, הקליטו נתוני IM-MS תוך הגדלת מתח האצת המלכודת מ-10 וולט ל-200 וולט, שייפתחו בהדרגה לשלב החלבון והגז.

נתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה והפיק התוויות מתפתחות דו-ממדיות על-ידי ערימת הפצות CCS מנורמלות בעוצמה בכל מתח מאיץ עבור כל מצב טעינה. תוצאות MS מקוריות חושפות את המצב האוליגומרי, ההרכב והטופולוגיה של מתחם HerA ו- NurA. כמו אינטראקציות noncovalent נשמרים בשלב הגז, MS יליד של ATP גמא S ו ADP titration ניסויים, משמשים כדי לקבוע את מחייב נוקלאוטידים חכם זוג ב HerA ו NurA.

ספקטרום מסה של מצבים אוליגומריים HerA לגלות כי הגדלת ריכוז ATP גמא S מגביר את העוצמה היחסית של HerA הקסמרית. ערכי ה- CCS הניסיוניים עבור החלבונים והתסביךים שלהם נגזרים לאחר מכן מניסויי IM-MS. ערכים אלה נתפסים יש הסכמה טובה עם מדידות תיאורטיות מקריסטלוגרפיה רנטגן, אשר מאמת באמצעות ערכי CCS לבניית מודלים ברזולוציה נמוכה של הרכבת חלבון.

ניתוח CIU ו- KEcom מגלה כי הדנ”א קשור HerA-NurA הוא יציב יותר מאשר קומפלקס ללא DNA. ניתוח CIU MS והמדינות המחייבות ATP בהתאמה מראים כי ארבעת המצב המאוגד של ATP גמא S מפחיתים יציבות מורכבת בשלב הגז. עם זאת, ששת המדינות המאוגדות ATP gamma S שבהן כל האתרים מאוכלסים, נתפסות כיציבות ביותר.

מדידות מדויקות של המסה המולקולרית של קומפלקס שלם מספקות תובנה חשובה על אפיון ביומולקולרי. אנחנו יכולים לקבל מידע על מסלולי הרכבה מורכבים, אוליגומריזציה של חלבונים וקשירת ליגנד. שילוב כל המידע הזה מאפשר ליצור מודלים מפורטים של מכלים ביולוגיים תפקודיים.