ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות הנוירודגנרטיביות, כגון אילו גורמים ומסלולים גנטיים מווסתים את הרעילות של חלבונים הקשורים למחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתהליך היעיל ביותר של הזדווגות שמרים משמש לסינון דגמי שמרים מול אוסף גדול של גנים בספרייה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הרעילות של חלבוני מחלות ניווניות, ניתן ליישם אותה גם לחקר תהליכים תאיים אחרים בשמרים, כגון סבילות למצבי עקה אחרים.

התחל הליך זה על ידי ציטוט של חמישה מיקרוליטר לבאר של DNA פלסמיד מספריית פלסמיד מסודרת לצלחות תחתונות עגולות של 96 בארות. שמור את הצלחות על ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לחסן 150 מיליליטר של דקסטרוז פפטון שמרים או מדיום YPD בבקבוק של 500 מיליליטר עם מושבה של זן השמרים הפלואידים W303 Alpha.

דגרו את התרבית ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד למשך הלילה. למחרת בבוקר, לאחר מדידת ה-OD600 של תרבית הלילה, יש לדלל את התרבית ל-OD600 של 0.1 בשני ליטר YPD. דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב -200 סל"ד למשך כחמש שעות, עד שהתרבית מגיעה ל- OD600 של 0.4 עד 0.6.

כדי לקצור את תרבית השמרים, מלאו שמונה בקבוקי צנטריפוגה סטריליים של 250 מיליליטר וצנטריפוגה ב-3000 xG למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יוצקים את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. שוטפים את השמרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ומאחדים את התאים לשני צינורות צנטריפוגה.

השעו מחדש כל כדור תא ב-25 מיליליטר של תמיסת ליתיום אצטט מולרית של 0.1. שלב את התאים התלויים, הוסף חמישה מיליליטר DNA של זרע סלמון והעביר אותם לבקבוק של 150 מיליליטר. דגירה ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-225 סל"ד למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, שפכו את תערובת התאים למאגר ריאגנטים חד פעמי סטרילי. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו 35 מיקרוליטר מתערובת התאים לכל באר של צלחות 96 הבארות התחתונות העגולות, המכילות את ה-DNA הפלסמיד של הספרייה שהוכן קודם לכן. מערבולת את צלחות 96 הבארות ב-1000 סל"ד למשך דקה אחת.

דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס מבלי לנער במשך 30 דקות. אין לערום את הצלחות, כך שהחום יוכל לעבור בצורה יעילה יותר. הסר את צלחות 96 הבארות מהחממה של 30 מעלות צלזיוס וערבב אותן ב -1000 סל"ד למשך 30 שניות.

הוסף 125 מיקרוליטר של מאגר טרנספורמציה לכל באר, ולאחר מכן מערבל את הצלחות ב -1000 סל"ד למשך דקה אחת. דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הלם את השמרים בחום על ידי הנחת הצלחות בחממה של 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

צנטריפוגה את הצלחות ב 3000 xG למשך חמש דקות. הסר את מאגר הטרנספורמציה מהבארות על ידי היפוך הצלחות מעל פח אשפה והשלכת המאגר בכוח מהצלחות. מחק במהירות את הצלחות ההפוכות על מגבת נייר נקייה כדי להסיר נוזלים על גבי הצלחות.

שטפו את התאים על ידי הוספה לכל באר, 200 מיקרוליטר של מדיום נשירה מינימלי המתאים לסמן הניתן לבחירה על פלסמיד הספרייה. משתמשים כאן במדיום אורה סינתטי מינוס מדיום. צנטריפוגה את הצלחות ב 3000 xG למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט מעל פח אשפה כפי שהודגם קודם לכן. הוסף 160 מיקרוליטר של מינימום אורה מינוס מדיום, המכיל 2% גלוקוז לכל באר ומערבל את הצלחות ב -1000 סל"ד למשך דקה אחת. דגרו את הצלחות מבלי לרעוד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

לאחר 48 שעות, כדור של שמרים שעברו טרנספורמציה אמור להיות גלוי בתחתית כל באר. בעזרת מתקן נוזלים, הוסף 100 מיקרוליטר אורה מינוס מדיום המכיל גלוקוז לכל באר של סט חדש של צלחות 96 בארות. מערבולת את הלוחות המכילים את השמרים שעברו טרנספורמציה ב -1000 סל"ד למשך 30 שניות.

בעזרת משכפל פלסטיק סטרילי בעל 96 פינים, הנח את הפינים לבארות המכילות את השמרים שעברו טרנספורמציה ולאחר מכן חסן אותם לבארות המתאימות של הצלחות החדשות המלאות במדיה. דגרו על הצלחות החדשות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, כדור שמרים אמור להיות גלוי בתחתית כל באר המכילה שמרים שהפכו בהצלחה.

כדי להציל את זני השמרים הללו כמלאי גליצרול, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 50% גליצרול לכל באר, מערבלו את הצלחות ב-1000 סל"ד למשך 30 שניות, אטמו את הצלחות בנייר אלומיניום והקפיאו במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להחיות את זני הספרייה ממאגר הגליצרול, הוציאו את צלחות 96 הבארות מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס, הסירו את נייר האלומיניום ותנו לשמרים להפשיר בטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות. לאחר שהשמרים הופשרו, השתמש במשכפל פלסטיק סטרילי של 96 פינים כדי לחסן את מלאי הגליצרול ל-160 מיקרוליטר של מדיה טרייה מינוס המכילה 2% גלוקוז בצלחות של 96 בארות ולדגור ב-30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

מיד לאחר השימוש בזני הספרייה, אטמו את הצלחות והחזירו אותן למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. באותו יום שבו מופשרים זני הספרייה, חסנו את זן שמרי השאילתה ב-50 מיליליטר של YPD וגדלו ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-250 סל"ד במהלך הלילה. למחרת בבוקר, שפכו את זן שמרי השאילתה למאגר ריאגנטים חד פעמיים סטרילי ושפכו 160 מיקרוליטר מזן השאילתה לכל באר של צלחת של 96 בארות.

בעזרת מתקן הנוזלים, הוצא 160 מיקרוליטר לבאר של מדיה YPD לצלחות של 96 בארות. מערבל בקצרה את לוחות 96 הבארות המכילים את זן השאילתה ואת לוחות המתח של הספרייה ולאחר מכן השתמש במשכפל סטרילי של 96 פינים כדי להעביר את זני הספרייה ללוחות ה-YPD שחוסנו בזן השאילתה. דגרו את לוחות ה-YPD בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

לאחר 24 שעות גלולת שמרים תיראה בתחתית כל באר. מלאו צלחות של 96 בארות במדיום מינימלי המכיל 2% רפינוז המתאים לסמנים הניתנים לבחירה על הפלסמיד בזן השאילתה, כמו גם על פלסמיד הספרייה. השתמש במשכפל סטרילי של 96 פינים כדי להעביר שמרים מתרביות ההזדווגות של YPD למדיום הסלקטיבי.

דגרו על צלחות 96 הבארות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. רק תאי שמרים שהזדווגו ויצרו תאים דיפלואידים ולכן מכילים גם את פלסמיד השאילתה וגם את פלסמיד הספרייה יוכלו לצמוח במדיום זה. לאחר 48 שעות של גידול במדיום סלקטיבי המכיל רפינוז, שימו לב כי גלולה נראית בתחתית הבארות המכילות תאים דיפלואידים.

מערבולת את צלחות 96 הבארות ב-1000 סל"ד למשך דקה אחת. השתמש במכונת איתור רובוטית כדי לזהות את השמרים על צלחות אגר בארבע צלחות אורה-היס-דרופאאוט המכילות 2% גלקטוז ו-2% אגר, ולצלחות אורה-היס-דרופאאוט המכילות 2% גלוקוז ו-2% אגר. לאחר האיתור, הניחו לצלחות האגר להתייבש ואז הניחו אותן הפוכות באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים.

כל 24 שעות, צלם את לוחות האגר כדי לתעד את צמיחת השמרים. רעילות החלבון FUS הקשור ל-ALS נבדקה לראשונה בשמרים דיפלואידים. כפי שמצוין על ידי צלחת האגר המכילה גלקטוז, הגורמת ל-FUS, רעילות FUS עקבית הן בשמרים דיפלוד והן בשמרים הפלואידים.

חמישה גנים שזוהו בעבר כמדכאי רעילות FUS משיטה מבוססת טרנספורמציה נבדקו בשיטת ההזדווגות. נתיב אחד הוא זן שמרי בקרה שהפך לשני וקטורים ריקים. נתיב שני הוא זן השמרים הדיפלואידי FUS עם וקטור ריק שבו הביטוי של FUS רעיל מאוד.

נתיבים 3 עד 7 מראים שמרים דיפלואידים המבטאים FUS כמו גם גן דיכוי. כל חמשת הגנים מצילים את הרעילות של FUS בשמרים דיפלואידים, מה שמצביע על כך ששיטת ההזדווגות הייתה יעילה. שיטה זו המבוססת על הזדווגות יושמה לאחר מכן על סינון ספריית ביטוי יתר של 940 גנים.

ומוצגת תמונה של צלחת ייצוגית אחת. כפי שמצוין על צלחת הגלקטוז, שבה באים לידי ביטוי FUS וגנים של ספרייה, FUS היה רעיל לתא השמרים הדיפלוד. גן הספרייה, המסומן על ידי הריבוע הירוק, הציל רעילות FUS.

בעוד שגן הספרייה, המסומן על ידי הריבוע האדום, הגביר את הרעילות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 120 שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק מראש שהפנוטיפ המשמש להקרנה אינו תלוי בסוג ההזדווגות ההפלואידית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות גורמים גנטיים בעת ביטוי יתר שמצילים את הרעילות של חלבונים הקשורים למחלות בשמרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הנוירודגנרטיביות, לחקור מנגנונים של ציטוטוקסיות של חלבונים הקשורים למחלה במודל השמרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקת בטא גלקטוזידאז על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו האם ההצלה היא ספציפית.