Name: ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: למדו שיטת הזדווגות יעילה בסקרינינג יתר-ביטוי בשמרים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות. טכניקה זו מאפשרת זיהוי גורמים גנטיים המסייעים בהבנת רעילות חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

. אנחנו אסירי תודה על הדיונים מתחשב עם חברי המעבדה Ju Zhong מעבדה, ואת התמיכה הכלכלית מטעם אוניברסיטת מצב רייט.

הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מיועדת לסינון פלסמידים ספריית הכלול 10 צלחות 96-ובכן אבל וניתן לשנותם למעלה או למטה בהתאם. הפרוטוקול צריך לחזור כדי להשלים את ההקרנה כל ספריה. בדרך כלל, הקרנה נגד 10 צלחות של ספריית גנים בכל פעם ניתן לטפל בנוחות על ידי אדם אחד.
1. הכנה 96-ובכן שמרים טרנספורמציה
הערה: שלב זה מתבצע כמו בעבר תיאר7,10.
<ol><li>Aliquot 5 µL (בערך 50 – 100 ng) של פלסמיד DNA מספריה פלסמיד ערוכים כל טוב של צלחת 96-ובכן סיבוב המדרגה. הערה: דוגמה כזו ספרייה יהיה ספריית10ביטוי גנים שמרים.</li>
	<li>לחסן 150 מ ל מדיה דקסטרוז (YPD) peptone שמרים בבקבוקון 500 מ"ל עם מושבה (2 – 3 מ מ קוטר) של המתח הפלואידי שמרים W303α. דגירה אותם בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות (200 סל ד).</li>
	<li>למחרת בבוקר, למדוד את יתר600 של התרבות לילה ו לדלל את תרבות שמרים OD600 = 0.1 ב (עד) 2 ל' של YPD. תקופת דגירה זה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות (200 סל ד) של ~ 5 h עד התרבות מגיע OD600 = 0.4-0.6.</li>
</ol>2. שמרים טרנספורמציה
<ol><li>קציר התרבות שמרים על ידי מילוי שמיניית צנטריפוגה סטרילי 250 מ ל ו צריך שתוציאו אותם בטמפרטורת החדר x 3000 g עבור 10 דקות יוצקים את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר. הערה: לבצע את כל השלבים צנטריפוגה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השמרים עם סטרילי מזוקק H2O. בשביל זה, להוסיף 100 מ של סטרילי H2O כל בקבוק צנטריפוגה, מערבולת זה ל resuspend בגדר תא. לשלב את התאים שטף 2 בקבוקים ו צנטריפוגה אותם ב x 3000 g עבור 5 דק יוצקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>רוחצים את התאים כל בקבוק ב- 100 מ של 0.1 M LiOAc/1XTE (100 מ מ LiOAc; 10 מ מ. טריס, pH 8.0; 1 מ מ EDTA) את centrifuge אותם ב x 3000 g עבור 5 דק לשפוך את תגובת שיקוע.</li>
	<li>בזמן, צריך שתוציאו להרתיח 5 מ של זרע סלמון DNA (10 מ"ג/מ"ל) ב- 100 ° C באמצעות תנור בלוק במשך 3 דקות, ואז צנני את זה על קרח.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 25 מ של 0.1 M LiOAc/1XTE ב כל בקבוק, לשלב את התאים resuspended ולהעביר אותם אל בקבוק 150 מ. הוסף 5 מ של טרום מקורר הזרע סלמון DNA, דגירה זה ב 30 ° C עם טלטול (225 סל ד) למשך 30 דקות.</li>
	<li>שופכים את התערובת תא לתוך מאגר ריאגנט חד פעמי סטרילי, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להעביר כל טוב של צלחת 96-ובכן עגול-התחתון המכיל את פלסמיד ספריית דנ א 35 µL של תערובת תא. מערבולת 96-ובכן צלחות באמצעות vortexer צלחת עבור 1 דקות ב- 1000 סל ד. דגירה הלוחות למשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. הערה: לא מחסנית הצלחות, אז החום ניתן להעביר בצורה יעילה יותר. מצאנו כי vortexing הצלחות 96-ובכן-1,000 סל ד אינו גורם נוזלי לשפוך החוצה הבארות, אך מהירות מערבולת בטוח צריך להיבדק לפני ביצוע השלב.</li>
	<li>בבקבוקון, להכין 200 מ של המאגר טרנספורמציה המכילה ריכוז סופי של 40% PEG3350, דימתיל סולפוקסיד 10% ו- 0.1 M LiOAc. הכנת המאגר טרנספורמציה מיד לפני השימוש ומערבבים אותו ביסודיות ע י ניעור.</li>
	<li>הסר 96-ובכן הצלחות מן החממה של 30 מעלות צלזיוס ומערבבים אותם ל 30 s ב 1,000 סל ד באמצעות vortexer על צלחת. להוסיף µL 125 המאגר טרנספורמציה כל טוב ולאחר מכן מערבולת הלוחות עבור 1 דקות בכל 1,000 סל ד.</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וחום ואז הלם השמרים על-ידי הצבת הלוחות חממה 42 º C למשך 15 דקות. הערה: לא מחסנית את הצלחות.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 3000 g. הסר המאגר טרנספורמציה מן הבארות על ידי היפוך הלוחות על פח אשפה ולזרוק בכוח המאגר של הלוחות. כתם במהירות את הצלחות הפוכה על מגבת נייר נקי כדי להסיר את כל נוזל על הצלחות.</li>
	<li>יש לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 200 הצלחות של הנשירה מינימלי בינונית המתאים דה מרקר לבחירה על פלסמיד הספרייה. הערה: השתמשנו ההחלטיים סינתטי-בינוני.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 3000 g ולהסיר את תגובת שיקוע על סל פסולת כמו שלב 2.10.</li>
	<li>הוסף µL 160 של מינימלי עורה-בינוני המכיל 2% גלוקוז. מערבולת הלוחות עבור 1 דקות ב- 1,000 סל ד דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות מבלי לרעוד. לאחר 48 שעות, שימו לב כי גלולה של שמרים טרנספורמציה גלוי בחלק התחתון של כל טוב.</li>
	<li>בעזרת מתקן נוזלי, להוסיף 100 µL של עורה-מדיה המכילה גלוקוז לבאר כל סדרה חדשה של 96-ובכן צלחות.</li>
	<li>מערבולת הלוחות המכילים שמרים טרנספורמציה (מתוך שלב 2.13) ב- 1,000 סל ד ל 30 ס' באמצעות משכפל 96 פינים פלסטיק סטרילית, למקם את הסיכות הבארות המכילים שמרים טרנספורמציה, ואז לחסן אותם לתוך הבארות המקביל של הלוחות החדשים מלא מדיה. דגירה הלוחות חדש ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. הערה: אם עובד עם 10 צלחות, המדיום יכול גם ובשמפו באופן ידני באמצעות פיפטות רב ערוצית.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, גלולה של שמרים צריך להיות גלוי כל הבאר המכילים שמרים בהצלחה טרנספורמציה. לשמירת זנים אלו שמרים גליצרול מניות, להוסיף 50 µL של גליצרול 50% מכל קידוח, מערבולת הלוחות ל 30 s ב 1,000 סל ד, לאטום את הצלחות עם דבק סלוטייפ לסתימה ולהקפיא אותן ב- 80 ° C הערה: השלבים לעיל רק צריך להתבצע פעם אחת. הקרנות עתידיים של מודלים שמרים שונים נגד המאגר ריאגנט חד פעמיים באותה ספריה ניתן להתחיל המניות גליצרול, פנה/י מיד מן השלבים שלהלן.</li>
</ol>3. הזדווגות בין תאים המכילים גנים ספריית ושמרים שאילתה
<ol><li>כדי להחיות את זני ספריית המלאי גליצרול, לקחת את הצלחות 96-ובכן מהמקפיא-80 ° C, הסר איטום הקלטת, ולתת השמרים להפשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 30 דקות.</li>
	<li>ברגע השמרים יש הקרת, השתמש משכפל 96 פינים פלסטיק סטרילית כדי לחסן את מניות גליצרול µL 160 של טרי עורה-מדיה המכיל 2% גלוקוז ב 96-ובכן צלחות דגירה אותם ב 30 ° C עבור ה 24. מיד לאחר זנים ספריית משמשים , חותם את הצלחות עם דבק סלוטייפ לסתימה, ולהחזיר אותם במקפיא-80 ° C.</li>
	<li>באותו יום ספריה זנים (W303α) הם הקרת, לחסן את המתח שמרים שאילתה (כאן, FUS ב W303a) 50 מ של YPD לגדל אותו בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.</li>
	<li>למחרת בבוקר, שופכים את המתח שמרים שאילתה מאגר ריאגנט חד פעמי סטרילי, ולאחר aliquot µL 160 של המתח שאילתה כדי כל טוב של צלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי.</li>
	<li>באמצעות מנפק נוזלי, לוותר על 160 µL של YPD מדיה לתוך כל טוב של עשר לוחות 96-ובכן. השתמש הצלחות האלה מאוחר יותר להזדווגות המתח שמרים שאילתה עם שמרים הספרייה.</li>
	<li>בקצרה מערבולת הצלחת 96-ובכן המכיל את המתח שאילתה ולאחר מכן להשתמש משכפל 96 פינים סטרילי כדי להעביר את השאילתה זן אל צלחות YPD.</li>
	<li>בקצרה מערבולת הספרייה זן צלחות ולהשתמש, עבור כל אחד מהלוחות זן בספריה, משכפל 96-pin חדש סטרילי כדי להעביר זנים ספריית הפלטות YPD שיש, כמובן עם המתח שאילתה. הערה: תאים גליצרול לאבד את הכדאיות שלהם לאחר מספר מחזורים ההפשרה-להקפיא. מבוקש זנים ספריית אחסון לטווח ארוך (מקפיא-80 ° C) בהקדם האפשרי לשמור על הספריה באיכות טובה, ומוכנים לשימוש עתידי. מתוחזק כראוי, המניה גליצרול ניתן להיות קפוא, הקרת לפחות 10 פעמים. אנו גם ממליצים לשמור עותק לעבודה של עותקי גיבוי של המניה גליצרול. כאשר המניה עבודה לא עובד, מיד לעשות חדש עובד עותק מעותק הגיבוי.</li>
	<li>דגירה הלוחות YPD ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה ה הערה כי גלולה של שמרים יהיה גלוי בחלק התחתון של כל טוב לאחר 24 שעות.</li>
	<li>מילוי 96-ובכן צלחות עם מדיום הנשירה מינימלי המכיל 2% raffinose, התואם את סמני לבחירה על פלסמיד בנימה זו שאילתה כמו גם על ספריית פלסמיד (למשל, כאן עורה - שלו-).</li>
	<li>השתמש משכפל 96 פינים סטרילי כדי להעביר שמרים YPD הזדווגות תרבויות בתקשורת סלקטיבי. דגירה הלוחות 96-ובכן ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות; רק תאים שיש הזדווגו שמרים דיפלואידי בנוי תאים, לכן, להכיל פלסמיד השאילתה את שני ו פלסמיד הספריה יוכלו לגדול מדיה זו. לאחר יומיים, להתבונן גלולה מוצגת בתחתית הבארות.</li>
</ol>4. הבחינה Assay
<ol><li>
לאחר 48 שעות של צמיחה בתקשורת סלקטיבי המכילים raffinose, במקום השמרים על פלטות אגר.
	<ol>
<li>להכין 2 סטים של צלחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% אגר באמצעות לוחות פוליסטירן ברור, אחד המכיל 2% גלקטוז והמכיל גלוקוזה 2% אחרים.</li>
		<li>מערבולת 96-ובכן לוחות עבור 1 דקות ב- 1,000 סל ד, ואז במקום השמרים את הצלחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% גלקטוז ו 2% אגר (גנים FUS וספריית הם המושרה) וכדי הלוחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% גלוקוז ו- 2% אגר (FUS וספריית גנים מודחק) באמצעות מכונת spotting רובוטית, לפיו התרבות בכל הוא מקום טוב על גבי הלוחות אגר ב ארבע פעמים (קרי, התרבות 1 הוא מקום טוב למקומות 4 בצלחת אגר).</li>
		<li>לאחר הבחינה, תן את הצלחות אגר יבש, ולאחר מכן למקם אותם במהופך בתוך חממה 30 מעלות צלזיוס. לצלם את הצלחות אגר כל 24 שעות לרשום צמיחה מהירה יותר או יותר שמרים שבו הוא חולץ רעילות לאמץ השאילתה או לרשום צמיחה איטית יותר/פחות שבו רעילות לאמץ השאילתה היא מתעצמת. תקופת דגירה לוחיות הרישוי של 4 ימים. הערה: התרבות בכל טוב ניתן הבחין על פלטות אגר 1 ל-1, כפי שמוצג של שיטה המבוססת על השינוי הקודם10. עם זאת, את 1-4 אכון כאן (אשר ניתן להגדיר בנוחות לשימוש במכונה spotting רובוטית) מגביר באופן משמעותי את היציבות של וזמינותו על-ידי הפחתת מספר תוצאות חיוביות שגויות. כניסות חיוביות נחשבים רק כאשר כל המושבות 4 מאותו מראים הפנוטיפ דומה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
<li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14657499">Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein.</a> Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li>
<li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+links+between+Abeta+toxicity%2C+endocytic+trafficking%2C+and+Alzheimer%27s+disease+risk+factors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li>
<li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+model+of+FUS%2FTLS-dependent+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1001052(2011).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).</li>
<li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li>
<li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies%3A+the+first+15+years+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li>
<li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לבצע מסך ביטוי פלסמיד באמצעות הזדווגות כדי להציג את ספריית פלסמיד לתוך המודל שמרים שמרים. באמצעות גישה זו, מספר מודלים שמרים רעילות חלבון מחלות ניווניות יכולים להיות מוקרן באמצעות אוסף אותם שמרים טרנספורמציה עם ספרייה פלסמיד. תהליך מפרך של שינוי רק צריך להתבצע פעם אחת, לאחר שמרים יעילים ביותר אשר ההזדווגות משמשת להציג הספרייה פלסמיד לתוך המתח שאילתה. פרוטוקול זה מסתמכים על השימוש של הציוד רובוטית כדי לוותר על מדיה ותרבויות שמרים ספוט על פלטות אגר. בעוד הפרוטוקול יכול להתבצע ללא השימוש של ציוד ...

שמרים ניצני האפייה כבר בשימוש נרחב כדי להבין תהליכים תאיים הקשורים ישירות מחלות אנושיות מחקר מדעי בסיסי1 . יתר על כן, הוא שימש כאורגניזם מודל עבור לומד האדם הקשורים למחלה חלבונים, כגון אלה קשורה מחלות ניווניות הנפוצים ביותר, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, מחלת ניוון שרירים טרשת נפוצה לרוחב (ALS)2. יתרון של המודל שמרים היא הקלות שבה ניתן לבצע מסך הגנום כולו כדי לזהות הסלולר מסלולים הקשורים הרעילות של חלבונים הקשורים למחלות, ובכך נותן תובנה מנגנון הרעילות שלהם. מסך אחד כזה נקרא מסך ספריה של ביטוי, שבו כל אחד הגנים שמרים 5,500 בספריה ערוכים הופכת מודל שמרים לזהות אילו גנים יכולים לשנות רעילות כאשר overexpressed. שיטה זו הקרנה יושם בהצלחה במודלים שמרים מרובות ניווניות הקשורות למחלות חלבונים, כולל huntingtin של מחלת הנטינגטון3, α-synuclein עבור מחלת פרקינסון4,5 , Aβ עבור מחלת אלצהיימר6, ואת FUS TDP-43 ALS-7,-8,-9. בזמן זה נעשה בדרך כלל באופן תפוקה גבוהה10, השלב הכי מהגידולים של המסך בנפרד משתנה 5,500 גנים שמרים מספריה ערוכים. שלב זה חייב להתבצע בכל פעם שחוזר על עצמו ההקרנה, בכל פעם דוגמנית שהוקם שמרים צריך להילמד. חשוב למצוא דרך יעילה יותר כדי לבצע משימה זו.
תאי שמרים יכולה להתקיים stably בצורות הפלואידי והן דיפלואידי. ישנם שני מול ההזדווגות סוגים של תאים הפלואידי, הזדווגות סוג α. תאים הפלואידי של כל הזדווגות הקלד התוצרת, מפרישות פרומון ההזדווגות משלהם ספציפי, אשר מגיבים רק מול ההזדווגות סוג התאים. דבר זה מאפשר הזדווגות בין α תאים כדי לייצר תאים דיפלואידי יציב, / α. תהליך זה הוא ספונטני ויעיל מאוד11. אנחנו יכולים לנצל את מחזור החיים הייחודי של cerevisiae ס כדי להציג את ספריית פלסמיד. ליתר דיוק, כל הגן בספריה פלסמיד ערוכים תעבור טרנספורמציה לתוך תאים הפלואידי של סוג ההזדווגות אחד, דהיינו, α התא. אלה תאים המכילים את הגנים ספריית ואז יאוחסנו במלאי גליצרול בתבנית 96-ובכן ערוכים. עבור כל דגם שמרים צריך להיות מוקרן, תאי שמרים המכיל את הגנים ספריה יכולה להיות הקרת מן המלאי גליצרול ולאחר ההקרנה יכול להיעשות באמצעות הזדווגות עם המודל שמרים עניין בסוג השני ההזדווגות, כלומר, סוג ההזדווגות. הרעיון של שימוש ההזדווגות כדי להפגיש את שני גנים לתוך שמרים אינו חדש. זה יושם בהצלחה בשמרים תפוקה גבוהה ההקרנה שני-היברידית, שבו פיתיון לבנות (קרי, Gal4-הדי-איגוד תחום fusions) בסוג אחד ההזדווגות הוא הביא יחד באמצעות הזדווגות עם מבנה טרף מספריה ערוכים 12. אולם, אסטרטגיה זו מעולם לא הוחל ב ביטוי בספריה הקרנות, אשר תמיד השתמשו בשיטות מסורתיות טרנספורמציה.
המעבדה שלנו הקימה בעבר מודל שמרים של חלבונים הקשורים ALS FUS7. דרך ביטוי בספריה ההקרנה בשיטת טרנספורמציה גילינו חמש שמרים הגנים (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, ו VHR1) להציל את רעילות FUS כאשר overexpressed. ממצאים אלה שאושרו באופן עצמאי עם מחקר דומה על-ידי קבוצה אחרת8. hUPF1, homolog האנושית של ECM32, הוצגה מאוחר יותר לדכא את רעילות ראשי תאים עצביים13 , במודל חיה של ALS14 גם כן. באמצעות גנים חמש אלה כהוכחה עקרון, נדגים כי כל הגנים 5 בדומה להציל FUS רעילות כאשר הם יוכנסו המודל שמרים FUS על ידי הזדווגות. כיוון שמרים תאים המכילים את הגנים הספרייה יכולים להיות מאוחסנים לצמיתות במלאי גליצרול לתחייה בכל פעם שיש צורך, שיטה זו מבוססת על הזדווגות יסיר את הצעד גוזלת זמן של שינוי בכל פעם שהספרייה צריך להיות מוקרן נגד. מאז ההזדווגות היא יעילה במיוחד עם שינוי פלסמיד לא מעורב, אסטרטגיה זו פוחתת משמעותי גם את העלות המשויכת לטיהור ושינוי של ספרייה פלסמיד גדול. אנחנו יחולו בהצלחה בשיטה זו לספריית הקרנה נגד שמרים מודל של FUS.
התהליך להקרנה ההזדווגות מבוסס בקצרה מתואר באיור1. בתחילה, הספרייה פלסמיד ערוכים הופכת זן שמרים הפלואידי של הזדווגות מסוג α באמצעות פרוטוקול השינוי בתפוקה גבוהה שמרים שבו כל טוב של צלחת 96-ובכן מכיל שמרים טרנספורמציה עם פלסמיד ספריה ספציפית. זה אוסף של שמרים טרנספורמציה נשמרת מניה גליצרול כי ניתן הקרת לתחייה לשימוש מאוחר יותר. הדגם שמרים של עניין, רעילות FUS במקרה הזה, להפיקם בזן הפלואידי שמרים עם סוג ההזדווגות הנגדי (ההזדווגות סוג). באופן תפוקה גבוהה באמצעות המשכפלים 96 פינים סטרילי, הלחץ FUS ואת זני שמרים המכיל ספריית פלסמיד הועבר צלחות 96-ובכן המכיל מדיה עשירים, רשאי חבר. לאחר ההזדווגות, נפח קטן מכל טוב של התרבות ההזדווגות מועבר המכיל התקשורת הנשירה סינתטי אשר שמרים בלבד דיפלואידי המכיל שני FUS את הצלחות 96-ובכן, ספריית גנים יכולים לגדול. מכונת spotting רובוטית משמש לאחר מכן להעביר שמרים תרבות מכל קידוח על פלטות אגר שבו הביטוי FUS ואת הגנים ספריית מושרה.  בנוסף, תרבות שמרים הוא הבחין לשלוט פלטות אגר איפה FUS ואת הגנים הספרייה אינם מבוטאים. בעקבות גידול על פלטות אגר, הגנים או להחריף FUS רעילות יזוהו.

<table><tbody><tr><td>סלמון זרע DNA (SS-DNA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD מרק</td><td>מוצרי מחקר בינלאומי (RPI)</td> <td>Y20090</td><td></td></tr> אגר <tr><td>פישר</td><td>מגורען</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-מוצרי מחקר גלוקוז</td><td>בינלאומי (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-מוצרי מחקר גלקטוז</td><td>בינלאומי (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-רפינוז פנטהידראט</td><td>מוצרי מחקר בינלאומי (RPI)</td> <td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום סולפט</td><td>פישר מדע</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>אורה סינתטי - נשירה בינונית</td><td>קלונטק</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>תוסף נשירה של חומצות אמינו שמרים -היסטידין/-אורסיל</td><td>קלונטק</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו ואמוניום סולפט</td><td>מוצרי מחקר בינלאומי (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט,</td> נטול מים <td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 3350 (PEG-3350)</td> <td>ספקטרום כימי&nbsp;</td><td>משכפל PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 פינים&nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 צלחת בדיקת באר, תחתית עגולה עם מכסה</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>לא מטופל, סטרילי</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; מחקר פלוס פיפטה רב-ערוצית</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>נפח 30-300ul</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Isotemp אמבטיות יבשות דיגיטליות / מחממי בלוק</td><td>פישר מדע</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף&nbsp; MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R צנטריפוגה</td><td>פישר מדע</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode דיספנסר</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטור HDA&nbsp; &nbsp;</td><td>כלי</td><td></td><td></td> זמר</tr></tbody></table>

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

ניצני שמרים כבר בשימוש נרחב כמודל בלימוד חלבונים הקשורים עם מחלות אנושיות. בדיקה גנטית הגנום כולו הוא כלי רב עוצמה נפוץ במחקרים שמרים. הביטוי של מספר חלבונים הקשורים למחלות ניווניות של שמרים גורם cytotoxicity ויצירת צבירה, recapitulating ממצאים לראות בחולים עם הפרעות אלה. כאן, אנו מתארים שיטה לסינון מודל שמרים של הקשורים נוירודגנרטיביות החלבון FUS מודיפיקטורי שלה רעילות. במקום להשתמש טרנספורמציה, הפלטפורמה ההקרנה הזאת מסתמכת על הזדווגות של שמרים להציג ספריה ערוכים של פלסמידים לתוך המודל שמרים. שיטת החיזור יש שני יתרונות ברורים: ראשית, זה יעיל ביותר; שנית, הספרייה ערוכים מראש טרנספורמציה של פלסמידים ניתן לאחסן לטווח ארוך כמו מניה גליצרול, ויישם במהירות למסכי אחרים ללא השלב מהגידולים של טרנספורמציה לתוך המודל שמרים בכל פעם. נדגים כיצד שיטה זו בהצלחה ניתן להשתמש עבור גנים המשנים הרעילות של FUS מסך.

החלבון ALS-הקשורים FUS, RNA/DNA מחייב חלבון, נחקרה בעבר שמרים הפלואידי7,8. השיטה מבוססת על שינוי גנטי. הסינון באמצעות גילו מספר גנים שמרים לדיכוי FUS רעילות. Homolog האנושית של אחד הגנים שמרים הודגם מאוחר יותר כדי להיות אפקטיבית שיתוק רעילות תאים עצביים הראשי ומודל עכברוש של ALS13. כאן, אנו משתמשים באותו דגם שמרים להראות כי ביטוי בספריה ההקרנה יכול להתבצע על ידי הזדווגות באופן יעיל על ידי שינוי.
<p clas...

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות הנוירודגנרטיביות, כגון אילו גורמים ומסלולים גנטיים מווסתים את הרעילות של חלבונים הקשורים למחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתהליך היעיל ביותר של הזדווגות שמרים משמש לסינון דגמי שמרים מול אוסף גדול של גנים בספרייה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הרעילות של חלבוני מחלות ניווניות, ניתן ליישם אותה גם לחקר תהליכים תאיים אחרים בשמרים, כגון סבילות למצבי עקה אחרים.התחל הליך זה על ידי ציטוט של חמישה מיקרוליטר לבאר של DNA פלסמיד מספריית פלסמיד מסודרת לצלחות תחתונות עגולות של 96 בארות. שמור את הצלחות על ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לחסן 150 מיליליטר של דקסטרוז פפטון שמרים או מדיום YPD בבקבוק של 500 מיליליטר עם מושבה של זן השמרים הפלואידים W303 Alpha.דגרו את התרבית ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד למשך הלילה. למחרת בבוקר, לאחר מדידת ה-OD600 של תרבית הלילה, יש לדלל את התרבית ל-OD600 של 0.1 בשני ליטר YPD. דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב -200 סל"ד למשך כחמש שעות, עד שהתרבית מגיעה ל- OD600 של 0.4 עד 0.6.כדי לקצור את תרבית השמרים, מלאו שמונה בקבוקי צנטריפוגה סטריליים של 250 מיליליטר וצנטריפוגה ב-3000 xG למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יוצקים את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. שוטפים את השמרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ומ

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד...

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

כאן, נציג של שמרים משופר אחד-היברידית הקרנת פרוטוקול כדי לזהות את גורמי שעתוק (TFs) ניתן לאגד לאזור ה-DNA האנושי של עניין. שיטה זו משתמשת צינור ההקרנה תפוקה גבוהה אשר ניתן לחקור את הכריכה של &gt; 1,000 TFs בניסוי יחיד.

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לביצוע קמפיינים לבחירת פני השטח של שמרים להעשרת וריאנטים חלבוניים הנקשרים לאנטיגן מעניין.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

למדו שיטת הזדווגות יעילה בסקרינינג יתר-ביטוי בשמרים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות. טכניקה זו מאפשרת זיהוי גורמים גנטיים המסייעים בהבנת רעילות חלבונים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

גלה סרטונים נוספים