Name: ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H+ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למדו שיטה מהירה לניתוח N-glycans מזני Raphanus sativus באמצעות PNGase H+ ו-UPLC. השיטה מפשטת את ההכנה ללא החלפת חוצצים ומאפשרת אנליזה יעילה של גליקנים צמחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי קרן מדעי הטבע של סין (גרנט מספרים 31471703, A0201300537 ו- 31671854 כדי לומר שראשי, להעניק מספר 31470435 G.Y.), ואת תוכנית כשרונות זרים 100 (גרנט מספר JSB2014012 כדי לומר).

1. דוגמה אוסף
<ol><li>לרכוש את הזנים השונים של צנון טרי (צנון sativus ל').</li>
</ol>2. בידוד של חלבון של צנון
<ol><li>Homogenize כ- 100 גרם של צנון טרי עם בלנדר מטבח למשך 10 דקות.</li>
	<li>להעביר את slurry 50 מ ל צנטריפוגה ובשעות צנטריפוגה-× 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות להסיר את החומר לא מסיסים.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע בזהירות לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש ולהוסיף אמצעי שווה של 2 מ' חומצת חומץ טריכלור (TCA) פתרון. הערה: הוספת TCA לזרז חלבונים מסיסים (glyco).</li>
	<li>צנטריפוגה-× 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע החלבונים מגורען (glyco).</li>
	<li>לשטוף את גלולה עם 20 מ של מים יונים, צנטריפוגה ב × 14,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות להסיר oligosaccharides מסיסים, סוכרים.</li>
	<li>חזור על שלב 2.5. ארבע פעמים.</li>
	<li>מחדש להשעות את כדורי ב 1 מ"ל של מים יונים, העברת שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 טריים.</li>
</ol>3. הכנת N- Glycans
<ol><li>µL 50 תערובת של חלבון פתרון משלב 2.7. (שווה ל- 5 גר' צנון טרי) עם מו 0.2 של recombinant H PNGase+ , חומצה אצטית 10 מ מ.</li>
	<li>דגירה תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה-× 14,000 g עבור 5 דקות כדי להסיר את תוספת חלבון ואת האנזים.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 טריים.</li>
</ol>4. טיהור של N- Glycans
<ol><li>להכין את העמודה מיצוי מוצק-פאזי (SPE) להעשיר את N- glycans ולהסיר מלחי וזוהמה אחרים מן התערובת התגובה, להגדיל את מידת הבררנות של fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) תיוג סוכן של N- glycan derivatization.<ol>
<li>להוסיף 3 מ ל מים יונים לשטוף את העמודה.</li>
		<li>להוסיף 3 מ"ל של 80% acetonitrile פתרון המכיל חומצה trifluoroacetic (TFA, 0.1% v/v) לפעיל SPE-העמודה.</li>
		<li>להוסיף 3 מ"ל של מים יונים equilibrate SPE-העמודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את הדגימה מהשלב 3.3 אל העמודה וזורקים את הזרימה דרך.</li>
	<li>להוסיף 1.5 מיליליטר מים יונים כדי לשטוף את העמודה ולמחוק את הזרימה דרך.</li>
	<li>Elute N- glycans המשוחררים מן העמודה באמצעות 1.5 מ ל תמיסה מימית 20% acetonitrile, המכיל 0.1% TFA (v/v) לתוך שפופרת צנטרפוגה 2 מ"ל.</li>
	<li>הסר הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר. להתנדף עד המדגם יהיה יבש לחלוטין.</li>
</ol>5. קרינה פלואורסצנטית Derivatization של N- Glycans
<ol><li>להכין 1 מ"ל של פתרון 2-AB, בהיקף של 35 מ מ 2-AB ו- 0.1 M נתרן cyanoborohydride דימתיל סולפוקסיד/אצטית תמיסת חומצה (7:3, וי/v).</li>
	<li>להוסיף 5 µL 2-AB לפתרון הדגימות מיובשים (שלב 4.5.) נגזר 6 צנוניות שונים. מערבולת כל דגימה עד לחלוטין התפרקה.</li>
	<li>דגירה התערובת עבור 2 h ב- 65 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ומצננים את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ולהוסיף 5 µL של מים יונים 40 µL של acetonitrile. Centrifuge הצינורות ב g x 14,000 למשך 3 דקות.</li>
	<li>להעביר 48 µL מ תגובת שיקוע לתוך בקבוקון HPLC 300 µL שחזור גבוהה. אחסן את הדגימות - glycan Nderivatized ב-20 ° C עד לחודש אחד.</li>
</ol>6. HILIC-UPLC בניית פרופיל של N- glycans
<ol><li>לנתח את הדגימות באמצעות מערכת UPLC רגיל מחובר של detectorset זריחה מקוון באורכי עירור/פליטה של 330 nm/420 nm, בהתאמה.</li>
	<li>השתמש כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופובי (HILIC)-UPLC עמודה glycan בטמפרטורה עמודה של 60 מעלות צלזיוס לניתוח.</li>
	<li>להכין ממס A על ידי דילול 50 מ של מניות פתרון (1 מ' אמוניום formate פתרון, pH 4.5) עם 950 מ"ל של כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LCMS)-כיתה מים. הכן את הפתרון המניות כדלקמן:<ol>
<li>43 מ ל חומצה פורמית להוסיף 700 מ"ל של איכות המזון-כיתה ח2O.</li>
		<li>להתאים את ה-pH ל 4.5 תוספת dropwise של פתרון אמוניה מימית (25% w/w).</li>
		<li>להעביר הממס צילינדר מדידה ולמלא עד 1000 מ"ל עם איכות המזון-כיתה ח2O. החנות ב 4-6 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשתמש acetonitrile איכות המזון-כיתה ב' הממס</li>
	<li>הפרד N- glycans באמצעות • תנאי מעבר הצבע הבאים:<ol>
<li>להתחיל על-ידי הוספת 95% ממס B לתוך א הממס להגדיר קצב הזרימה 0.5 mL/min מ-0 דקות 44.5.</li>
		<li>מ 0 דקות ל- 6 דקות, לצמצם בהדרגה את הפרופורציה של הממס B עם % to78 מעבר צבע ליניארי.</li>
		<li>מ- 6 דקות מינימום 44.5, לצמצם בהדרגה את הפרופורציה של הממס B עם מעבר צבע ליניארי 55.9%.</li>
		<li>מ מין 44.5 46.5 מינימום, במהירות להקטין את חלקם של הממס B במילוי הדרגתי לינארית מ- 55.9% ל- 0% להחזיק ב- 0% למשך 2 דקות ו ליזום כביסה של העמודה. להפחית את קצב הזרימה כדי 0.25 mL/min של 44.5 ל- 55 דקות.</li>
		<li>לשטוף את העמודה עוד יותר על ידי הגדלת B ממס עד 95% מן 48.5 דקות מינימום 50.5 והחזק ב 95% 4.5 דקות.</li>
		<li>Equilibrate מחדש את העמודה לתנאי ההתחלה 95% ממס B ב- 0.5 mL/min מ- 50.5 מינימום 57.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מזריקים µL 45 המדגם לתוך המערכת UPLC.</li>
	<li>Elute את N- glycans מאת UPLC עם השמירה פעמים בין 15 ל-40 דקות.</li>
	<li>לאסוף את כל התצפיות UPLC שיא שבר באמצעות צינורות צנטריפוגה 2 מ"ל ויבש הדגימות אידוי צנטריפוגלי.</li>
	<li>להזריק כ 1 pmol של 2-AB שכותרתו לתוספי סטנדרטי (2−20 גלוקוז יחידות) כדי לכייל את הצמח -N- glycan פרופיל, וכדי להקצות פעמים • תנאי שלהם ליחידות גלוקוז סטנדרטית.</li>
</ol>7. MALDI-TOF MS ניתוח
<ol><li>להמיס דגימות מן µL 6.8 ב 5 שלב של איכות המזון-כיתה מים. לערבב 1 µL של הפתרון הדגימה, µL 1 6-עזה-2-thiothymine (ATT) פתרון (0.3% w/v ב- 70% v/v acetonitrile מימית), פיפטה התערובת על המוביל מדגם MALDI-TOF.</li>
	<li>לנתח את הדגימות שימוש בכלי ספקטרומטר מסה MALDI-TOF במצב יון חיובי על ידי לחיצה על לחצן התחל .</li>
	<li>נתח ספקטרום המונית באמצעות התוכנה הנלווית של ניתוח MALDI-תוף-MS.</li>
	<li>לפרש הספקטרום באמצעות של קוד פתוח glycan פרשנות תוכנה19. הגדר את פרמטרי החיפוש עבור 2-AB תיוג, [M + Na]+, ולהגדיר את פרמטר דיוק 2.0 Da.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול שהוצגו כאן מאפשר השוואת הפרופילים - glycan Nשל הזנים השונים של צנון. יתרון משמעותי של שיטה זו לעומת פרוטוקולים הקיימת היא כי אין שינויים מאגר בין המהדורה אנזימטי של N- glycans התגובה derivatization עם 2-AB נדרשים. השלב הקריטי ביותר של ההליך הטיהור של N- glycans באמצעות העמודה SPE, כמו כשל להסיר מלחים או זיהומים אחרים תערובת התגובה עלולה להשפיע לרעה על זריחה derivatization יעילות. השיטה כפי שהוצג כאן מתירה רק את ההערכה של abundances היחסית של שונות N -glycans; כימות מוחלטת ידרו...

N- glycans בצמחים יש משכו תשומת לב מוגברת בשנים האחרונות, כמו מחקרים קודמים הדגישה N- glycans כמקור פוטנציאלי אימונולוגי cross-reactions זה עלול לעורר תגובות אלרגיות1,2 . זה כבר הוכיחה בעבר כי N- glycans על הצמח glycoproteins יכול להשפיע על פעילות קטליטית3,4, thermostability,5,מתקפל6 או לוקליזציה subcellular ו הפרשת7. על מנת לתאם את המבנים glycan עם הפונקציות המתאימות שלהם, N- glycans חייב קודם להשתחרר מן glycoproteins כימית או enzymatically. שיטת כימי קלאסית עבור שחרור N- והן O- glycans היא β-חיסול, שבו מדגם אלקליין הטיפול מלווה הפחתה borohydride להניב alditol8. עם זאת, הליך זה מונע תיוג עם fluorophore וגורמת דעיכה משמעותית של יחידות חד-סוכר מהקצה תוך צמצום של המבנה glycan. Deglycosylation הכימי מבוסס על טיפול אמוניה מימית/פחמתי הוא גם נפוץ בשיטה חלופית9. אף אחת מהשיטות האלה שחרור כימי השתנה חלבונים שלמים, מה שמאפשר ניתוח spectrometric המוני של glycan ללא תווית בריכות ללא ההפרעה של פפטיד שברי בטווח מסה זהה. אולם, חסרון אחד השיטות האלה הוא קצב מוגבר השפלה α1, 3-fucosylated N- glycans, מבנה פחמימות משותף נמצאו צמחים10. לחלופין, שיטות פרסום אנזימטי באמצעות פפטיד:N- glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) חלים גם נרחב. F PNGase רקומביננטי (מתוך Flavobacterium meningosepticum) הבחירה הנפוצה ביותר, מאפשרת השחרור של כל סוגי N- glycans, למעט המבנים הנושאת של הליבה α1,11,3 fucose12. לכן, A PNGase (מבודד מזרעים שקדים) משמש בדרך כלל לניתוח של הצמח N- glycans13. עם זאת, deglycosylates אנזים זה רק proteolytically, נגזר glycopeptides, ואין אפשרות deglycosylate מקורי glycoproteins14. לפיכך, בדיקה רב שלבי מדגם נדרש לפני ניתוח נוסף, אשר גורם לאובדן נרחב של glycans, במיוחד אלה של שפע נמוכה15. המטרה הכוללת של השיטה היא להציג זרימת עבודה ממוטב עבור שחרור - glycan Nוזריחה תיוג באופן פשוט וחזק. הרציונל הבסיסי הוא כי PNGase H+, אשר נתגלה לאחרונה ב- Terriglobus ורודה , יכול להתבטא recombinantly ב e. coli, יכול hydrolyze N- glycans ישירות מתוך לגרדום חלבון בחומצי התנאים16. יתרון מפתח של שימוש PNGase H+ על שיטות אלטרנטיביות היא כי תגובות תיוג פלורסנט יכולה להתבצע בצינור התגובה אותו מבלי לשנות את התגובה מאגרי17,18. הכנה פשוטה תנאים ושחזור גבוה של oligosaccharides נמוך-שפע להפוך שיטה זו כלי רב ערך הניתוח של N- glycans. פרוטוקול זה מתאים לניתוח של N- glycans ממינים שונים של הצמח.

<table><tbody><tr><td><כימיקלים חזקים>חזקים:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית&nbsp;</td><td>SCR, שנחאי</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחוני</td><td>Huada, גואנגג'ואו</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>מגיב כללי</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>אנרגיה</td><td>כימית W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-אמינובנזמיד</td><td>Heowns, טיאנג'ין</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציאנובורוהידריד</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Huada, גואנגג'ואו</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>סולם דקסטרן עם תווית 2AB, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-thiothymine&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כלים/חומרים: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלנדר מטבח</td><td>דוב, גואנגג'ואו</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>מאייד צנטריפוגלי</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE עמוד</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE עמוד</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC ניתוח:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בעל התאוששות גבוהה בקבוקון HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>גלאי פלואורסצנטי עבור HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תנור עמודה</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC עמוד</td><td>מים</td><td>Acquity UPLC BEH גליקן עמודה</td><td>2.1 & פעמים; 150 מ"מ, 1.7 &mu; m גודל חלקיקים</td></tr><tr><td>בדרגת LCMS</td><td>מים Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל בדרגת LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמוניה</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של n- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות pngase h+

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

בשנים האחרונות moieties פחמימות של צמחים קיבלו תשומת לב רבה, כפי שהם מקור פוטנציאלי של תגובות חיסוניות cross-reactive, מעורר אלרגיה. בנוסף, פחמימות מבנים גם לשחק תפקיד קריטי בחילוף החומרים הצמח. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה להכנה של ניתוח N- glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus) שימוש ספציפיים - glycanase Nלשחרור של פחמימות הצמחי מבנים. כדי להשיג זאת, פוחת משקעים חומצת חומץ טריכלור גולמי של צנון homogenates היו מטופלים עם PNGase H+, הנקרא באמצעות 2-aminobenzamide כמו תגית פלורסנט. הדגימות - glycan Nשכותרתו לאחר מכן נותחו על ידי ביצועים אולטרה לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה מבני נתונים היסטוריים והגליונות כרומטוגרפיה נוזלית (UPLC) הערכה כדי לכמת abundancies היחסית של המבנים נגזר צנון - glycan N. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לניתוח של N- glycans ממינים צמח שונים אחרים, עשוי להיות שימושי עבור חקירה נוספת של הפונקציה ואפקטים של N- glycans על בריאות האדם.

איור 1 מציג מבט סכמטי של פרוטוקול המתואר, כולל את הבידוד של חלבונים (glyco-) צנון, הכנת N- glycans, ניתוח UPLC, ניתוח MALDI-תוף-MS של רכיבים אלה. איור 2 מציג chromatograms נציג UPLC של N- glycans derivatized של הזנים צנון שנותחה. איור 3 מראה את התוצאות שהושג המבנים 2AB-derivatized N- glycan באמצעות MALDI-תוף-ספקטרומטריית. איור 4 מציגה את ההרכב ...

אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה הכנה וניתוח של N- glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus).

ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום מדעי הגליקונים של הצמח כגון כיצד ניתן לנתח ולאפיין במהירות N-גליקנים ממקור צמחי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת שינויי חיץ בין השחרור האנזימטי של N-גליקנים לבין תגובות הנגזרת עם 2-אמינובנזמיד. מי שידגים את ההליך יהיו העלמה יא-מין דו, וגברת שן-לי ג'ן; שני סטודנטים לתארים מתקדמים ממרכז המחקר לביו-הנדסה גליקומיקס וגליקן באוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינג.כדי להתחיל לבודד את החלבונים, השתמש בבלנדר מטבח כדי להומוגניזציה של כ -100 גרם צנון טרי למשך עשר דקות. העבירו את השפלה המתקבלת לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 14,000 בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להסיר את החומר הבלתי מסיס.לאחר מכן, העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר. הוסף כמות שווה של תמיסת חומצה טריכלורואצטית דו-טוחנת. צנטריפוגה בעוצמה של פי 14,000 מכוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.ואז הסר את הסופרנטנט. שוטפים את הגלולה עם 20 מיליליטר מים נטולי יונים. שוב צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 14,000 בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות להסרת אוליגוסכרידים ופוליסכרידים מסיסים.לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה עם מיליליטר אחד של מים נטולי יונים. והעבירו את תמיסת החלבון לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר. כדי להתחיל בהכנת ה- N-גליקנ

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

הדרך המהירה מתואר להשיג תובנות מבנה סוכרים מטריקס תאיים. השיטה מנצלת את הייחודיות של glycosylhydrolases ואת הרגישות של ספקטרומטריית מסה המאפשר כמויות זעירות של חומרים כדי להיות מנותח. טכניקה זו ניתנת להתאמה כדי לשמש ישירות על הרקמה עצמה.

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג'ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה פותח לטיהור משולב של פרוטאומיקה וגליקומיקה וכימות LC-MS/MS בפלזמה. ניתוח Deamidation של מוטיבים של גליקוזילציה המקושרים ל-N היה ספציפי לאתרים דה-גליקוזיליים. כימות מדויק של N-גליקנים הושג על ידי צימוד הפרדת N-גליקן בסיוע מסנן לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

מאמר זה מציג צורה משופרת של טכניקת גליקומיקה חדשה מלמטה למעלה שנועדה לנתח את פרופיל ההרכב המאוגד של גליקנים בנוזלים ביולוגיים לא מפוצלים באמצעות פירוק כימי של גליקנים לחד-סוכרים ספציפיים לקישור המרכיב אותם לזיהוי על ידי GC-MS. יישומים פוטנציאליים כוללים גילוי מוקדם של סרטן והפרעות אחרות הנוגעות לגליקן.

ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics

פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

אימונוגלובולין G (IgG) N-גליקן מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור. המוצג כאן הוא מבוא לשיטה ניסיונית זו, כך שניתן להשתמש בה באופן נרחב בהגדרות מחקר.

אימונוגלובולין G N-גליקן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחרור O-גליקנים ממוצין, והתפלה, פרמתילציה וניתוח לאחר מכן באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

פרופיל של מוצין O-גליקנים פרמתילציה באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה

למדו שיטה מהירה לניתוח N-glycans מזני Raphanus sativus באמצעות PNGase H+ ו-UPLC. השיטה מפשטת את ההכנה ללא החלפת חוצצים ומאפשרת אנליזה יעילה של גליקנים צמחיים.

ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H⁺

גלה סרטונים נוספים