שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משקפת את פעילות RNA פולימראז II על ידי מדידת mRNA מסונתז חדש אשר אינם מושפעים השפלה RNA. פרוטוקול זה תואר במקור באמצעות הכלאה microarray, אבל יכול בקלות להיות מאומץ רצף גבוה לאורך כל mRNA שזה עתה תעתיק. הדגמת הליך זה תהיה טיאגו בטיסטה, סטודנט לשעבר מהמעבדה שלנו.

לאחר חיסון תאי S.cerevisiae, לגדל אותם לילה ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת ב 150 סל"ד. למחרת, למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר. לדלל את התרבות OD600 של כ 0.1 ב 100 מיליליטר של מדיום YPD.

לגדול את התאים עד OD600 הוא סביב 0.8. לאחר מכן, למדוד את OD600 של תרבות הלילה S.pombe. לדלל את התרבות הזאת OD600 של כ 0.1 ב 500 מיליליטר של אמצעי YAS ולתת לו לגדול עד OD600 הוא כ 0.8.

ראשית, להכין פתרון טרי של שני טוחנות ארבע thiouracil. יש לשמור על הפתרון המוכן בטמפרטורת החדר והגנה מפני אור. הוסף את הפתרון ארבע thiouracil לתרבויות S.cerevisiae ו S.pombe כך הריכוז הסופי הוא חמישה מילימולר.

הדגירה תרבויות S.cerevisiae ו S.pombe ב 30 מעלות צלזיוס ו 32 מעלות צלזיוס בהתאמה עם תסיסה מתמדת במשך שש דקות. לאחר מכן, הסר aliquot קטן של כל תרבות ולספור את התאים באמצעות מונה תא אוטומטי או תא Neubauer. צנטריפוגה ב 2, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לאסוף את התאים.

השליכו את העל-טבעי ושטפו את התאים בקרח פעם אחת ב-PBS. צנטריפוגה שוב ב 2, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בתאים בחמישה מיליליטר של קרח קר פעם אחת PBS.

מערבבים את תאי S.cerevisiae ו- S.pombe ביחס של שלושה לאחד. צנטריפוגה הדגימות המעורבות ב 2, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את PBS ופלאש להקפיא את התאים בחנקן נוזלי.

לאחסן את המדגם ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן לשימוש. כאשר מוכן להמשיך, להפשיר את התאים על קרח במשך כ 20 עד 30 דקות. השתמש בערכת מיצוי RNA שמרים מותאמת כדי לחלץ את ה- RNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, העבר את מחסנית המסנן לצינור האיסוף הסופי. אלוט RNA עם 50 microliters של מים נטולי RNase שטופלו DEPC שחומם מראש ל 100 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g לדקה אחת.

לאחר מכן השתמש 50 microliters של מים מחומם מראש DEPC-מטופלים RNase כדי לחמק RNA שוב לאותו צינור. צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g לדקה אחת לוודא כי נפח המדגם כולו עבר דרך המסנן. אם לא, צנטריפוגה שוב לתקופה ארוכה יותר של זמן.

בסיום, לכמת ולבדוק את טוהר המדגם באמצעות הציוד המתאים. השתמש במים נטולי גרעין שטופלו ב- DEPC כדי להתאים את הריכוז של ה- RNA שנרכש בעבר לשני מיליגרם למיליליטר. Aliquot 200 מיקרוגרם של RNA הכולל לחמם אותו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

מיד מצננים אותו על קרח במשך שתי דקות. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase שטופלו ב-DEPC. הוסף 100 microliters של מאגר biotinylation ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של ביוטין HPDP.

אם פתרון הביוטין HPDP יוצא מהפתרון, הגדל את נפח ה- DMSO או ה- DMF עד 40% מנפח התגובה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגן על המדגם מפני אור והדגירה אותו בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה במשך שלוש שעות. לאחר מכן, מוסיפים נפח שווה בערך של כלורופורם לצינורות ומערבבים במרץ.

צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, העבר בזהירות את השלב העליון לשני צינורות מיליליטר חדשים. הוסף כמות של חמישה נתרן כלורי טוחן שווה כ 1/10 של נפח המדגם.

ואז לערבב את הדגימה. ראשית, מחממים את ה-RNA הביוטינילציה ב-65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ואז לצנן את הדגימות על קרח במשך חמש דקות.

הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטבידין ל-RNA הביוטיניילציה. דגירה בטמפרטורת החדר עם רעידות קלות במשך 90 דקות. מניחים את העמודים המסופקים עם הערכה בכן המגנטי.

לאחר מכן, הוסיפו לעמודים 900 מיקרוליטר של מאגר כביסה בטמפרטורת החדר. החל את 200 חרוז מיקרוליטר ותערובת RNA על העמודים. לאסוף את הזרימה דרך צינורות 1.5 מיליליטר ולאחר מכן להחיל אותו שוב על אותו עמודה מגנטית.

שמור על זרימה זו אם יש צורך בכך שהיא מייצגת את שבר ה- RNA ללא תריס. כדי להתחיל באימות RT-qPCR של השברים השונים, סנתז תחילה את cDNA כמפורט בטקסט. לאחר מכן הגבר את ה- cDNA על-ידי qPCR בזמן אמת באמצעות פרוטוקול סטנדרטי.

הרמות הנמדדות של תעתיקים בשברים מטוהרים מתאים מסוג בר מתורבתים עם ובלי ארבעה thiouracil אישר הליך זה במיוחד מטהר RNA שכותרתו. ניתוח של זן הדלתא spt20 מגלה כי כמות RNA מצב יציב הכולל הוא במידה רבה ללא שינוי או מצטמצם רק במתינות עבור הגנים שנבדקו. תוצאות דומות נראים עבור זנים שנמחקו עבור bre1.

עם זאת, ניתוח של RNA שזה עתה תועתק בזן הדלתא spt20 מגלה ירידה של פי שלושה עד חמישה בסינתזת mRNA לכל הגנים שנבדקו. בינתיים, אובדן bre1 מוביל לירידה דיסקרטית יותר אך עדיין נראית לעין. עם דלדול בלתי ניתן לתיקון של spt7, תת-אחדות מבנית של מתחם הסאגה, רמות mRNA שזה עתה תעתקו מצטמצמות במידה דומה לזן המחיקה.

כאשר רמות ה- RNA הכולל נמדדות על ידי ניתוח גנום רחב, רק גנים מעטים נראים יש רמות הביטוי שלהם השתנה עם מחיקת spt20 או על ידי ויסות או למטה ויסות. עם זאת, ניתוח של RNA שזה עתה מועתק מגלה כי רמות של מעל 4, 000 גנים מופחתים באופן משמעותי לפחות פי שניים עם מחיקת spt20 אשר מרמז על השפעה חיובית גלובלית של סאגה על RNA פולימראז II שעתוק שמרים ניצנים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה שעתוק Saccharomyces cerevisiae, זה יושם רק עם וריאציות קלות על ידי שימוש בפרוטוקול זה, אנו יכולים לזהות ירידה גלובלית סינתזה mRNA אשר היה פיצוי על ידי ירידה גלובלית השפלה mRNA.