Name: מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: חקור שיטה לבידוד וטרנספקציה של מוטוניורונים ראשיים מחוט השדרה של עכברים. טכניקת ה-Magnetofection מאפשרת חקר מנגנונים נוירודגנרטיביים ופונקציית גנים בתרביות עשירות של תאי עצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות את "האגודה יציקת le développement de la neurogénétique" אחוות של ד ר Jacquier, AFM-הטלויזיונית על התמיכה באמצעות תוכנית אסטרטגית MyoNeurAlp. אנחנו רוצים גם תודה ד ר כריס הנדרסון, ד ר ויליאם camu ב, ד ר בריג'יט Pettmann, ד ר סדריק ראול ו ד ר גיאורג Haase, אשר השתתף בפיתוח ושיפור הטכניקה ולהפיץ את הידע שלהם.

בכל ההליכים הכרוכים חיות התקבלו על-ידי הוועדה האתית של המוסד.
1. פתרון הכנה
<ol><li>הכינו 10 מ"ל של 4% BSA דיאליזה L-15 בינוני.<ol>
<li>לפזר אבקת אלבומין שור ב- 4% (w/v) ב- 10 מ"ל של L-15 בינונית.</li>
		<li>הוסף את הפתרון קלטת דיאליזה 20 מ עם ניתוק kDa 20. Dialyze נגד 500 מ"ל של מדיום L-15 במשך 3 ימים תחת עצבנות ב 4 º C. מחליף המדיום L-15 כל יום.</li>
		<li>לסנן את הפתרון דרך ממברנה מיקרומטר 0.22 aliquot 15 mL צינורות. לאחסן את הצינורות ב-20 ° C. הערה: פרוטוקול זה משתמש בהפניות הבאות: שלא שונתה בינוני L-15 גולמי = L-15 בינוני, בינוני L-15 חומצי = pH L-15, והמדיום L-15 בסיסי = L-15 ביקרבונט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין 200 מ של pH L-15.<ol>
<li>להתאים את ה-pH של המדיום L-15: ראשית, למלא בקבוק שטיפה עם כמה חתיכות של קרח יבש. להחדיר גז (CO2) לתוך המדיום L-15 עד הצבע כתום (~ pH 6.4 ו-40 ~ לחצים). ה-pH ניתן להתאים גם עם מד pH הרגיל.</li>
		<li>לסנן המדיום דרך ממברנה מיקרומטר 0.22 החנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 100 מ של ביקרבונט L-15.<ol>
<li>להוסיף 2.5 מ של 7% סודיום ביקרבונט mL 97.5 L-15 בינוני ולאחסן ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו את תוספי IPCS (אינסולין Putrescin Conalbumin סלנייט).<ol>
<li>להמיס 2.5 מ ג של אינסולין בדם 0.5 מ של 0.1 M HCl. הוסף 4.5 מ ל מים מזוקק פעמיים.</li>
		<li>להמיס 8 מ ג של putrescine ב 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).</li>
		<li>להמיס 100 מ ג של conalbumin ב- 10 מ"ל ל- PBS.</li>
		<li>1 מ ג של סודיום סלניט ב- 19.3 מ ל מים, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4, ו לדלל את הפתרון 10-fold.</li>
		<li>לשלב 1 מ"ל של האינסולין, 1 מ"ל של פתרון putrescine, 1 מ"ל של conalbumin ו- 0.1 מ"ל של נתרן פתרון הסלנייט להשיג 3.1 מ של IPCS תוספת פתרון. לאחסן את הפתרון ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרון פרוגסטרון מ מ 0.02 נקודות.<ol>
<li>להמיס 1 מ ג של פרוגסטרון ב- 1.6 מ ל 80% אתנול.</li>
		<li>לדלל את פתרון 100-fold ב 100% אתנול ואחסן אותו ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 100 מ של מדיום L-15 מלאה.<ol>
<li>להוסיף 1.8 מ של תמיסת D-גלוקוז (200 מ"ג/מ"ל) 92 מ של pH L-15 להשיג ריכוז סופי של 3.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז.</li>
		<li>לשלב 1 מ"ל של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 2 מ של סרום סוס חום-לא פעיל, 3.1 מ של תערובת IPCS ו- 0.1 מ"ל של פרוגסטרון פתרון (2 x 10-5 מ').</li>
		<li>לסנן את המדיום על קרום מיקרומטר 0.22 ואחסן אותו ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין 5 מ של צפיפות פתרון הדרגתי (הריכוז הסופי של 5.5%) לכל ניסוי.<ol>
<li>להוסיף 476 µL של המדיום הדרגתיות מסחרי 60% צפיפות 4524 µL של L-15 (אם הדבר אפשרי, ללא פנול אדום כדי להגדיל את החדות חזותי-לאטמוספרה; יחס דילול של 1:10. 5).</li>
		<li>לאחסן את הפתרון ב 4 ° C 2 שבועות או להקפיא אותו ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו 10 מ"ל של תרבות התקשורת.<ol>
<li>להוסיף 200 µL בינוני תוספת 9.6 מ של נוירון תא תרבות בינוני.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של נסיוב סוס חום-לא פעיל (אשר נוטה להבחין בין סימנים מקדימים תא גליה ופועל נגד ההפצה) 25 µL של גלוטמין ו 10 µL של מרקפטואתנול.</li>
		<li>לסנן את המדיה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
		<li>הוסף את הגורמים neurotrophic הבאים: ciliary neurotrophic פקטור (CNTF)-ריכוז סופי של 10 ng/mL, ואת המוח נגזר neurotrophic פקטור (BDNF) גורם נגזר neurotrophic תא גליה (GDNF) בריכוזים הסופי של 1 ng/mL.</li>
		<li>חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין 50 מ של דיסקציה מדיה.<ol>
<li>להוסיף 2.25 מ של גלוקוז (200 מ"ג/מ"ל) 47.05 מ של HBSS. להוסיף 700 µL של 1 מ' HEPES עם pH 7.4. חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרון PFA 4%.<ol>
<li>לפזר 20 גרם של מחברים ב- 500 מ ל- PBS.</li>
		<li>ברדס כימי, מחממים את הפתרון עד 60 ° צלזיוס ולהוסיף כמה טיפות 1 M NaOH עד הפתרון נעשה ברור.</li>
		<li>לסנן את הפתרון דרך נייר פילטר ולהתאים את ה-pH ל- 7.2. אחסן אותו ב-20 ° C. הערה: לחלופין, פתרונות PFA מסחריים אחרים שניתן להשתמש ו מדולל 4% ב- PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנקות את הכלים ניתוח כולל מלקחיים, מספריים, ומנות סיליקון עם 70% אתנול לפני השימוש, ועם סבון ונקה מים לאחר השימוש.</li>
</ol>2. פולי-ornithine/Laminin (Po/L) דיש ציפוי
הערה: אמצעי אחסון מותאמים את המעיל צלחת 24-. טוב.
<ol><li>אם יש צורך, הכניסו הבאר coverslip עקר 12 מ מ.</li>
	<li>מעיל הבארות עם µL 500 בפתרון 10 µg/mL פולי-L-Ornithine, מומס במים.</li>
	<li>תן הבארות להסתפק 1 h בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את הפתרון פולי-L-Ornithine, מילה נהדרת למשך 30 דקות.</li>
	<li>מעיל הבארות בין לילה ב 37 ° C עם 500 µL של 3 µg/mL laminin של ביקרבונט L-15. הערה: בארות שניתן לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים בחממה. עבור incubations ארוכה, הוספת PBS סטרילי בין הבארות יכולה לסייע כדי למנוע אידוי בינוני.</li>
</ol>3. ניתוח
<ol><li>אקריב עכבר בהריון כאשר העוברים בשלב העוברי E12.5. לנקות את הבטן עם 70% אתנול.</li>
	<li>הסרת הרחם על ידי חיתוך של שני oviducts, הנרתיק ושם אותו בתוך צלחת פטרי עם PBS קר (ללא Ca2 + Mg2 +).</li>
	<li>לאסוף את כל העוברים ולהעביר אותם טריים, PBS קר (ללא Ca2 + Mg2 +) של צלחת פטרי.</li>
	<li>לשים אחד העובר מאכל מצופה עם סיליקון ומלא לנתיחה מדיה (עם HBSS, גלוקוז 4.5 g/L ו- 7 מ מ HEPES pH 7.4). הערה: העובר לנתיחה מתבצע תחת מיקרוסקופ באמצעות נקי בסדר. מלקחיים ומספריים. לחלופין, צלחת פטרי רגיל ללא סיליקון יכול לשמש עבור ניתוח.</li>
	<li>להסיר את הראש, הזנב, מעיים, באמצעות מלקחיים כמו מספריים.</li>
	<li>לשמור על העובר עם הבטן נגד שהסיליקון עם מלקחיים.</li>
	<li>עם זוג מלקחיים השני, להוסיף אחד הטיפים לתוך התעלה המרכזית של חוט השדרה rostral.</li>
	<li>סגור את המלקחיים להרוס את רקמת הגבי כמה מילימטרים.</li>
	<li>חזור על פעולה זו כלפי הצד סימטרית עד לחוט השדרה כולו פתוח (איור 1B).</li>
	<li>ניתוק החלק rostral של חוט השדרה (עורק מוחי) מן הגוף.</li>
	<li>להפוך את העובר כדי לשמור על חוט השדרה פתוח נגד שהסיליקון.</li>
	<li>לצבוט את החלק rostral של חוט השדרה ומשוך את העובר על ידי ראש כדי לחלץ את חוט השדרה. הערה: קרומי המוח ואת הגרעינים העזוב שורש (DRGs) צריכים להישאר מחוברים העובר. אחרת, משוך בזהירות משם כל קרומי המוח הנותרים, DRGs עדיין מחובר לחוט השדרה. בשלב זה, DRGs יכול גם להיות שנאספו עבור תא עצב רגיש תרבות (ראה דיון).</li>
	<li>לשטח את חוט השדרה על שהסיליקון ולהסיר את החצי הגבי של החוט על ידי גזירה לאורך האמצע בכל צד באמצעות אזמל. לחתוך את החלק האמצעי ל-10 חלקים באמצעות אזמל ולאחר להעביר את החתיכות צינור חדש.</li>
</ol>4. חוט השדרה תא השעיה
<ol><li>חזור על הליך זה דיסקציה עבור 6-8 שידרה.</li>
	<li>תן חוט השדרה חתיכות לאסוף בחלק התחתון של הצינור ולהחליף את HBSS עם 1 מ"ל של חזיר-F10 בינוני.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של טריפסין (2.5% w/v; הריכוז הסופי 0.025%). דגירה הצינור 10 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>כדי להפסיק את עיכול אנזימטי, להעביר שברי צינור 15 מ"ל המכיל µL 800 של בינוני L-15 מלאה, 100 µL של 4% (w/v) BSA µL 100 של DNase (1 מ"ג/מ"ל L-15 בינוני).</li>
	<li>Triturate פעמיים על-ידי כ רפה בעברית 1 מ"ל באמצעות פיפטה של P1000. תן השברים להסתפק 2 דק. לאסוף תגובת שיקוע בשפופרת טריים 15 מ"ל.</li>
	<li>כדי השברים, הוסף 900 µL בינוני L-15 מלאה µL 100 של 4% (w/v) BSA, 100 µL של DNase (1 מ"ג/מ"ל L-15 בינוני).</li>
	<li>Triturate 6 פעמים לפי כ רפה בעברית 1 מ"ל באמצעות פיפטה של P1000. תן השברים להסתפק 2 דק. הוסף תגובת שיקוע על הצינור 15 מ"ל שהושג בשלב 4.5.</li>
	<li>כדי השברים, הוסף 900 µL בינוני L-15 מלאה µL 100 של 4% (w/v) BSA, 100 µL של DNase (1 מ"ג/מ"ל L-15 בינוני).</li>
	<li>Triturate 10 פעמים על ידי כ רפה בעברית 1 מ"ל באמצעות פיפטה של P1000. תן השברים להסתפק 2 דק. הוסף תגובת שיקוע על הצינור 15 מ"ל שהושג בשלב 4.5. להמשיך תגובת שיקוע.</li>
	<li>בעדינות באמצעות pipet P1000, מקם כרית 4% (w/v) 2 מ ל BSA בתחתית של התחתית supernatant. צנטריפוגה ב g x 470 במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא 2 מ של מדיום L-15 מלאה.</li>
</ol>5. MN העשרה על ידי דחיסות צבע
<ol><li>פצל התליה תא 15 מ"ל שני צינורות (1 מ"ל כל אחד). לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של מדיום L-15 מלאה. אם החל מ- 6 עוברי, להשתמש המקבילה של עוברי 3 למחזור ב- 3 מ"ל של מדיום.</li>
	<li>להוסיף 2 מ"ל של צפיפות פתרון מעבר צבע על-ידי הוספת לאט הפתרון לתחתית של כל שפופרת להשיג ממשק חד.</li>
	<li>צנטריפוגה ב g x 830 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלב זה, תאים קטנים צריך להיות בחלק התחתון של הרכבת התחתית, ואילו תאים גדולים כגון MNs צריך להיות ממשק פתרון הדרגתי/בינוניים של צפיפות.</li>
	<li>לאסוף את התאים-הממשק על ידי כ רפה בעברית 1 או 2 מ"ל ומעבירים אותם אל צינור טריים 15 מ"ל. לכוון את עוצמת הקול כדי 10 מ"ל L-15 pH בינונית.</li>
	<li>להוסיף 2 מ של כרית BSA 4% החלק התחתון של צינור, צנטריפוגה ב 470 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של מדיום L-15 מלאה.</li>
	<li>חזור על שלב 5.5.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב- mL 2 בינוני תרבות שלמה. לספור את מספר הטלפון ואת הכדאיות במיקרוסקופ ניגוד שלב עם hemocytometer. הערה: עבור 6 שידרה, המספר הנייד צפוי להיות בסביבות 1 x 105 MNs.</li>
</ol>6. MN תרבות
<ol><li>לדלל MNs לצפיפות המתאים, בדרך כלל 5,000 עד 10,000 תאים µL 500 של תרבות בינוני לכל טוב לתוך צלחת 24-. טוב. הערה: זריעה צפיפות היא סביב התאים 30,000 ו 1,500 עבור לוחות 6 - ו 96-ובכן, בהתאמה.</li>
	<li>הסר את הפתרון laminin עם P1000.</li>
	<li>להעביר מיד MNs מדולל במדיום תרבות הלוחות ציפוי כדי למנוע ייבוש.</li>
	<li>תקופת דגירה התרבות של 2 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>7. Magnetofection של MNs
הערה: בשלבים הבאים, הכמויות שבהן משתמשים נועדו תרביות תאים של אחד טוב של צלחת 24-. טוב. נא עיין הפרוטוקול של היצרן עבור תבנית אחרת.
<ol><li>לשם הכנת ה-DNA, resuspend 1 µg של ה-DNA ב- 50 µL עצביים תרבות בינוני ו מערבולת עבור 5 s.</li>
	<li>הכנה צינור חרוז, resuspend 1.5 µL של חרוזים ב µL 50 בינוני תרבות עצביים.</li>
	<li>להוסיף את הפתרון חרוז 50 µL הפתרון DNA 50 µL, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר (סה כ נפח = 100 µL).</li>
	<li>במהלך זה דגירה, לסגת µL 100 של תרבות בינוני מן הבאר זה להיות transfected. הערה: לשים את הצלחת מגנטי בחממה כדי לחמם את זה ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להעביר µL 100 של המיקס DNA/חרוז לבאר ולאחר דגירה לצלחת 20 – 30 דקות בצלחת מגנטי ב 37 º C.</li>
	<li>. אני לא. לפחות 24 שעות לפני גילוי של הביטוי cDNA</li>
</ol>8. קיבוע, מכתים
<ol><li>לשטוף את התרבות פי 2 עם PBS.</li>
	<li>דגירה התרבות של 20 דקות בטמפרטורת החדר ב-4% מחברים/PBS.</li>
	<li>לשטוף את התרבות פי 2 עם PBS.</li>
	<li>דגירה התרבות ב- 500 µL מאגר חסימה (PBS BSA 4%, 2% נורמלית בסרום, 0.3% טריטון X-100, גליצין 0.1 M) לשעה בטמפרטורת החדר. הערה: סרום נורמלי צריך להיגזר מאותו המין כמו הנוגדן המשני (למשל, סרום עז רגיל).</li>
	<li>דגירה התרבות בין לילה ב 4 ° C עם נוגדן ראשוני מעורבבת עם µL 250 מאגר חסימה. הערה: לדוגמה, TUJ1 משמש ב- 1/1000, SMI32 משמש ב- 1/1000, ומשמש Lc3b 1/200.</li>
	<li>לשטוף את התרבות 3 פעמים עם PBS.</li>
	<li>דגירה התרבות עם נוגדנים משניים fluorophore מצומדת מעורבבת עם µL 250 מאגר חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את התרבות 3 פעמים עם PBS.</li>
	<li>הר בשקופיות זכוכית באמצעות הרכבה בינונית.</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li>
<li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li>
<li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li>
<li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28700839">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li>
<li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+ALS%3A+from+genes+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li>
<li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287465251_Purified_embryonic_motoneurons">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li>
<li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF%3A+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alsin%2FRac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li>
<li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas%2C+Daxx%2C+and+FasL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li>
<li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wildtype+motoneurons%2C+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li>
<li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li>
<li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li>
<li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%CE%B3+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li>
<li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li>
<li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li>
<li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+spinal+motor+neuron+diversity%3A+a+long+quest+for+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

אחד של נקודות קריטיות של פרוטוקול זה הוא העוברים העכבר הם שפרופסור-חלון זמן מדויק במהלך הפיתוח (E12.5) כדי למטב את כמות MNs שהושג בסופו של דבר. בנוסף, עבור תשואה אופטימלית, הקרע צריכה להתבצע בבוקר או בשעות אחר הצהריים המוקדמות. לפני E12.5 (למשל, ב- E11.5), ניתוח קשה, במיוחד לגבי חיסול של קרומי המוח. לאחר E12.5, מספר MNs שהושג טיפות באופן משמעותי. כדי לשלוט עובר לשלב ההתפתחות, למבוגרים נקבות וזכרים קודם ממוקמים יחד בסוף היום. למחרת בבוקר, המבוגרים מופרדות, וכל הנקבות נבדקים לנוכחות של פקק הנרתיק. אם פקק, העוברים,...

מחלות נוירומוסקולריות מקיפים מגוון רחב של פתולוגיות ברורים קליניות, גנטית המאופיינת על ידי משינוי של שריר ו/או מערכת העצבים. הודות להתפתחות הטכנולוגית של טכנולוגיות רצף, מאות גנים אחראים אלה מחלות נדירות זוהו במהלך העשור האחרון (הרשימה זמינה במרכז המחלה Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). מגוון מוטציות מזוהה מציין כי מוטציות שונות בגן גן יחיד יכול לגרום מתבטא בצורות שונות ומחלות1,2,3 , כי מוטציות בגנים שונים ניתן לייצר דומה פנוטיפים 4 , 5. בהקשר זה, ישנם מאמצים לפתח דגמי הסלולר שיכולים להיות כלים רבי-עוצמה לניתוח ההשלכות מוטציה ומנגנונים פתולוגי.
MNs בעמוד השדרה יש somas גדולה הממוקמת הקרניים הבטני של חוט השדרה, אקסונים ארוכים טופס היעד סיבי שריר השלד, ולאפשר תנועות מרצון באמצעות השחרור אצטילכולין ובצמתים עצב-שריר. מאז MNs מושפעות על ידי מחלות נוירומוסקולריות כגון נוירודגנרטיביות, שארקו-מארי-טות (CMT), ניוון שרירי עמוד השדרה, דוקטור הנדרסון ועמיתיו פיתחו הראשון פרוטוקול6 שמותר קומפלקסים במבחנה MNs בעמוד השדרה, על גילוי neurotrophic גורם GDNF7 (תא גליה נגזר neurotrophic פקטור). ליטושים טכני מאז אפשרו לטיהור מדויקת יותר של עמוד השדרה MNs ובסוגי שלהם באמצעות FACS8, אך העשרה על ידי צפיפות הצבע נשאר בשימוש נרחב ועוצמתי במעבדות כרגע עובד עם MNs בעמוד השדרה הראשית 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. לאחר מכן, זה גם אפשרי להשיג ציון גבוה יותר של טיהור MN דרך immunopanning על ידי ניצול של סמן משטח p75(NTR)15,16,17.
חוט השדרה מכיל תתי סוגים שונים של צוואר הרחם,, מותניים MNs, וכן החציוני לרוחב המנוע וטורים שונים בין המיקום שלהם ב הצופר הקדמי על ציר dorso-הגחוני /, בין היעדים הם innervate8, 18. תרבויות MN הראשי יכול לשחזר את כל תת אלה MN בפרופורציות פיזיולוגיים. המגבלה העיקרית של שיטה זו הוא המספר הנמוך של MNs שהושג בסופו של ההליך; למעשה, ניתן לצפות להשיג סביב 105 MNs של שישה עוברי, אשר מתאימה מיקרוסקופ, אבל הגבלת לניסויים ביוכימיה. ביצוע ניסויים עם יותר סטנדרטית יחוברו, שופע MNs (> 106 תאים) עובריים תאי גזע-derived MNs צריך להיחשב18.
תרביות תאים של transgenes פראי-סוג/מוטציה או תמונות ציפורים גנים אנדוגני לתוך MNs העיקרי הוא כלי מהיר ויעיל עבור פענוח מסלולים physiopathological, במיוחד כאשר העכבר מודלים אינן זמינות. Magnetofection היא טכניקה אחת עבור נוירונים העיקרי transfecting, הדומה lipofection בלי neurotoxicity קשורים. יתר על כן, ניתן לבצע תרביות תאים בנוירונים בוגרים לאחר מספר ימים במבחנה, בניגוד טכניקות בהתבסס על אלקטרופורציה9. אולם חיסרון אחד של שיטה זו הוא כי החרוזים לאגד חומצות גרעין בתרבות, גרימת רעש דאפי תיוג. זיהום ויראלי הוא כנראה הטכניקה היעילה ביותר עבור transfecting MNs; עם זאת, magnetofection אינו מצריך מסוימים נהלי הבטיחות לצורך ייצור ויראלי ולדלקת הסלולר.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת חיתוך סיליקון</td><td>מכשור מערכות חיים</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td>Sylgard</td></tr><tr><td>כיסוי עגול</td><td>NeuVitro, זכוכית Knittel</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 מ"מ</td></tr><tr><td>שקופית קלטות לייזר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20,000 MWCO ; יחידת סינון 30 מ"ל</td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>GP מסנני מזרק סטריליים</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4 בארות צלחת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>167063</td><td>Nunclon Delta מלקחיים צלחת</td></tr><tr><td>מטופלים</td><td>FST מאת Dumont</td><td>11252-20</td> <td># 5 מספריים מלקחיים</td></tr><tr><td></td><td>FST מאת Dumont</td><td>14060-10</td><td>אזמל מספריים עדינים</td></tr><tr><td></td><td>FST מאת Dumont</td><td>10035-20</td> אזמל <td>להב מעוקל</td></tr><tr><td></td><td>FST מאת Dumont</td><td>10316-14</td><td>אזמל מיקרו-סכין</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>גריינר</td><td>663102</td><td>&oslash; x h = 100 x 15 מ"מ</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור פוליפרופילן</td><td>פלקון</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>מעגל ווטמן</td><td></td><td>1001125, שקופית תא זכוכית בקוטר 125 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4 תאים</td></tr><tr><td>פלסמיד pCAGEN</td><td>Addgene</td><td>#11160</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Solutions and mediums</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 בינוני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 בינוני, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>פוטרסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>קונאלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>פולי-DL-אורניתין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 2.5%, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PBS ללא Ca Mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>14190144 ללא Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית תאים נוירונים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Neurobasal Plus בינוני</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES מאגר 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>צפיפות שיפוע בינוני</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>תוסף בינוני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582801</td><td>B-27 Plus</td></tr><tr><td>סרום סוס מושבת בחום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Immuno פלואורסצנטי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X0515</td><td>ללא Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>כולין אצטיל טרנספראז (CHAT)</td><td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>נוירופילמנט H ללא זרחן (SMI32)</td><td>Biolegends</td><td>SMI-32P</td><td>IF ב-1/1000</td></tr><tr><td>Islet-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Islet-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>Hb9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה בינונית</td><td>וקטור Lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Beta3 טובולין (שיבוט Tuj1)</td><td>Biolegends</td><td>801201</td><td>IF ב-1/1000</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2775</td><td>IF ב-1/200</td></tr></tbody></table>

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי transfecting motoneurons ראשי העכבר

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

הייתה שם הקשורים ניוון מוחיים של עמוד השדרה motoneurons (MNs) במגוון גדול של הפרעות נוירולוגיות כולל נוירודגנרטיביות שארקו-מארי-טות ', ניוון שרירי עמוד השדרה, אשר ישויכו כולן ניוון שרירים. תרבויות העיקרי MNs בעמוד השדרה היו בשימוש נרחב כדי להדגים את מעורבותם של גנים ספציפיים במחלות כגון ולאפיין את ההשלכות שלהם מוטציות הסלולר. תרבות זו מודלים MN העיקרי פרוטוקול נגזר העבודה החלוצי של הנדרסון ועמיתיו לפני יותר מעשרים שנה. ראשית, אנחנו פירוט שיטת לנתח את הקרניים הקדמי של חוט השדרה של העובר העכבר ובידוד MNs מגבולות תאים באמצעות מעבר הדרגתי צפיפות. לאחר מכן, אנו מציגים דרך חדשה ביעילות transfecting MNs עם פלסמידים ביטוי באמצעות magnetofection. בסופו של דבר, אנחנו להמחיש כיצד לתקן, immunostain העיקרי ש-mns. באמצעות neurofilament מוטציות הגורמות שארקו-מארי-שן מחלות מסוג 2, פרוטוקול זה מדגים בגישה איכותית המבטאים חלבונים עניין ולימוד שלהם מעורבות MN, תחזוקה, וצמיחה של הישרדות.

לאחר 24 שעות בתרבות, motoneurons (MNs) כבר להראות צמיחה משמעותית עצב (לפחות 6 פעמים יותר מאשר הגודל soma). בימים שלאחר מכן, אקסונים צריך להמשיך לצמוח ולהציג מסעף (איור 2). יהיו מורפולוגיות שונות עקב סוג של specificities. לדוגמה, העמודה החציוני MNs זה innervate השרירים צירית יש אקסונים נמוך, מסועף יותר מאשר MNs לרוחב עמודה מנוע זה innervate איבר שרירי18.
לאחרונה היו בשימוש כדי...

מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

שיטה זו יכולה לעזור לטפל בשאלות מפתח בנוירוביולוגיה, כגון קוטביות נוירונים מוטוריים, הדרכת אקסון, סחר באקסון ומנגנונים נוירודגנרטיביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא להשיג תרבות נוירון מוטורי מועשר מאוד בזמן שאנחנו לוקחים לבטא את החלבון שלנו על ידי חיבה דקה. כדי להתחיל בהליך זה, מניחים עובר אחד בצלחת של מדיה ניתוח מקודד עם סיליקון.מתחת למיקרוסקופ, להחזיק את העובר עם הבטן נגד הסיליקון עם מדפים. עם זוג המדפים השני, הכנס את אחד הטיפים לתעלה המרכזית של חוט השדרה rostrad. לאחר מכן, סגור את המדפים כדי לקרוע מעט את רקמת הגב.חזור על פעולה זו לכיוון הצד של קונל עד שכל חוט השדרה ייפתח. לאחר מכן, מקם את העובר כך חוט השדרה הפתוח הוא נגד הסיליקון. לאחר מכן, לנתק את החלק rostrad של חוט השדרה מהגוף.צבוט את החלק rostrad של חוט השדרה, ולמשוך את העובר על ידי הראש כדי לחלץ את חוט השדרה. בזהירות למשוך את כל קרום המוח הנותר DRGs עדיין מחובר לחוט השדרה. משטחים את חוט השדרה על הסיליקון ולהשתמש באזמל, מסירים את החצי הגבי של החוט על ידי חיתוך לאורך אמצע כל צד.חותכים את החלק האמצעי לעשר חתיכות, ומעבירים אותם לצינור חדש. כדי להכין את ההשעיה התאית של חוט השדרה, לאסוף את חתיכות חוט השדרה בתחתית הצינור. החלף HBSS עם מיליליטר אחד של Ham F-10 בינוני ולהוסיף עשרה microliters של טריפסין.דגירה הצינור במשך עשר דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את העיכול האנזימטי, העבר את השברים לצינור חדש בגודל 15 מיליליטר, המכיל 800 מיקרוליטרים של מדיום L-15 שלם, 100 מיקרוליטרים של 4%BSA ו-100 מיקרוליטרים של DNAs ו- titrate, פעמיים. תן לרסיסים להתיישב במשך שתי דקות לפני איסוף העל-טבעי בצינור טרי של 15 מיליליטר.הוסיפו בעדינות שני מיליליטר של 4%BSA בתחתית הצינור העל-טבעי. סנטרו להתיך אותו ב 470 x כבידה במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את supernatant מחדש להשעות את משטח התא עם 2 מיליליטר של מלא L-15 בינוני.להעשרת מוטונורון, לפצל את ההשעיה התא לשני צינורות 15 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של L-15 PH בינוני לכל צינור. אם מתחיל עם שישה עוברים, להשתמש המקבילה של שלושה עוברים לכל צינור, ושלושה מיליליטר של בינוני.לאט להוסיף 2 מיליליטר של פתרון gradience צפיפות, לתחתית של כל צינור כדי לקבל ממשק חד. לאחר מכן, סנטרו להתיך אותו ב 830 x כבידה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלב זה, תאים קטנים צריכים להיות בתחתית הצינור, ואילו תאים גדולים - כגון motoneuron-צריך להיות בפתרון שיפוע צפיפות / ממשק בינוני.אספרה 1 עד 2 מיליליטר של התאים בממשק ולהעביר אותם לצינור טרי 15 מיליליטר. כוונן את עוצמת הקול לעשרה מיליליטר עם מדיום L-15 PH. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של כרית 4%BSA לתחתית של שני צינורות.ופתיל סנטרו ב 470 x כבידה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 5 דקות, להסיר את supernatant מחדש להשעות את המשטח ו 3 מיליליטר של מלא L-15 בינוני. חזור על centrifugate ב 470 x כוח הכבידה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להסיר את supernatant מחדש להשעות את משטח התא ושני מיליליטר של מדיום תרבות מלאה. כדי לתרבת נוירונים מוטוריים, לדלל אותם ל 5, 000-10, 000 תאים ב 500 microliters של תרבות בינוני לגם בצלחת 24 גם. לאחר מכן, להסיר את פתרון laminae עם ב P-1, 000 טיפ צינור.מיד להעביר את הנוירונים המוטוריים מדוללים בינוני תרבות. לצלחות הקידוד כדי למנוע ייבוש. כדי להכין DNA, להשעות מחדש 1 מיקרוגרם של DNA ב 50 microliters של מדיום תרבות עצבית.ומערבולת למשך 5 שניות. כדי להכין את צינור B, להשעות מחדש 1.5 microliters של חרוזים ב 50 microliters של מדיום תרבות עצבית. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תותר חרוזים ל-50 מיקרוליטרים של תות פתרון דנ"א ודגירה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.במהלך הדגירה הזו, משיכת 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבות מהברית שתנותב. לאחר מכן, להעביר 100 microliters של תערובת חרוזים DNA לכל באר. ודהר את צלחת 24 באר, 20-30 דקות על הלוח המגנטי ב 37 מעלות צלזיוס.מוצג כאן, הוא מורפולוגיה נוירון מודם מתגלה על ידי עמידה של שרשרת נוירופילמנט אנדוגני שאינו זרחן כבד לאחר ארבעה ימים של תרבות. בתמונות אלה, הצג את מורפולוגיה נוירון מודם לאחר ארבעה ימים במבחנה ו transfected עבור גן טרנס EGFP על ידי magnetofection ביום השני. נוירונים מוטו היו מוכתמים נגד עם הסמן SMI-32 או סמן פאן-נוירו TUJ-1 ואת החצים מצביעים על סומה של הנוירונים.אלה הם תמונות confocal שלהם של נוירונים מוטוריים מגנטו fected, המביעים סוג פראי או מוטציה EGFP NEFH מבנים מוכתמים עבור סמן autophagic שלהם LC-3B. חצים מראים את מוטציה EGFP NEFH אגרגטים חלבון כי הם גם LC-3B חיובי בעקבות הליך זה, montoholda curcha ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופיה וידאו לדמיין סחר אקסון ולהוסיף קצת הדרכה. לאחר ההתפתחות הראשונית שלה כדי לענות על שאלות בסיסיות בביולוגיה עצבית, טכניקה זו גם להוכיח להיות כלי רב עוצמה לחקור מנגנונים פיזיולוגיים המסבכים את הספקטרום של הפרעות motoneuron, כגון מחלת תסמונת הלם רעיל, טרשת נפוצה כללית סמואל טרופי, או ניוון שרירים בעמוד השדרה.

modeling-charcot-marie-tooth-disease-vitro-transfecting-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בתאי שריר בתרבית הם מודל לקוי לשחזר שרירים...

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

אסטרוציטים מסוג פרא פנוטיפי ותאי גזע עצביים שנאספו מעכברים שהונדסו עם אללים אונקוגניים מותנים ומותנים ועברו טרנספורמציה ויראלית יכולים לשמש למודל פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה ובגוף החי על ידי הזרקה אורתוטופית של תאים שעברו טרנספורמציה למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

המדד של תסמונת גיאן הוא כלי שימושי כדי להעריך את העכבר דגמי הקשורים ניוון מוחיים אך לעתים קרובות הוא להחיל רק כדי לגרות בעצב הירך ב- hindlimbs. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת השריר מורכבים פוטנציאל הפעולה (CMAP) ויוו בשרירי forelimb העכבר innervated על ידי מקלעת הזרוע.

אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאל הפעולה השריר מורכב מ Forelimbs העכבר דגמים של ניוון מוטורי נוירון

פרוטוקול זה מאפשר המרה מהירה ויעילה של תאי גזע pluriפוטנטי לתוך נוירונים מוטוריים עם זהות בעמוד השדרה או הגולגולת, על ידי ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק מתוך וקטורים inducible,.

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

עבודה זו מציגה פרוטוקול להניב התרבויות תאים הומוגנית של מנוע התנועה הראשוני, trochlear, ומנועי השדרה נוירונים. תרבויות אלה ניתן להשתמש לניתוחים השוואתיים של מורפולוגית, תאית, מולקולרית, ו אלקטרופיזיולוגיה המאפיינים של נוירונים מנוע העינית השדרה.

בידוד ותרבות של והעושות, טרוליר, ושדרה מוטוריים נוירונים מ בטרום לידתי : עכברים הטרנסגניים

כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי ליצור במבחנה NMJs מתאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (iPSCs). שיטה זו יכולה לגרום NMJs עם מורפולוגיה בוגרת ולתפקד בחודש אחד בבאר אחת. NMJs וכתוצאה מכך יכול לשמש פוטנציאל מודל מחלות הקשורות, ללמוד מנגנונים פתולוגיים או לסנן תרכובות סמים לטיפול.

בצומת המבחנה Neuromuscular המושרה מתאי גזע פלורופוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

אנו מתארים שיטה ליצירת יחידות מוטוריות אנושיות במכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית על ידי שיתוף פולחן נוירונים מוטוריים המושרה תאי גזע פלוריפוטנטים עם מיוטיובים ראשוניים אנושיים וכתוצאה מכך היווצרות של צמתים עצביים שריריים פעילים מבחינה תפקודית.

ייצור יחידות מוטוריות אנושיות עם צמתים נוירו-שריריים פונקציונליים במכשירים מיקרופלואידיים

אנו מתארים מערכת הדמיה ניתנת לשחזור, אוטומטית ובלתי משוחדת לאפיון תפקוד צומת נוירומוסקולרי באמצעות רקמת שרירי שלד מהונדסת אנושית ומוטונורונים אופטוגנטיים. מערכת זו מאפשרת כימות תפקודי של קישוריות עצבית-שרירית לאורך זמן ומזהה ירידה בתפקוד העצבי-שרירי הנגרמת על ידי נוירוטוקסינים וסרום המטופלים myasthenia gravis.

הנדסה ואפיון של מודל אופטוגנטי של הצומת העצבי-שרירי האנושי

שימוש במודל גידול אוטוכתוני חיסוני המונע על ידי מוטציות נפוצות של חולים לבדיקות פרה-קליניות הוא קריטי לבדיקות אימונותרפיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודלים של עכברי גידול במוח באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצגים מוטציות נפוצות של חולים, ובכך מספקים מודל עכבר מדויק, ניתן לשחזור ועקבי.

מידול גידולי מוח in vivo באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצג חתימות מוטציה של מטופל

חקור שיטה לבידוד וטרנספקציה של מוטוניורונים ראשיים מחוט השדרה של עכברים. טכניקת ה-Magnetofection מאפשרת חקר מנגנונים נוירודגנרטיביים ופונקציית גנים בתרביות עשירות של תאי עצב.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

גלה סרטונים נוספים