העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכל תחום מחקר שבו אות זרחון מעניין כגון תחום הסרטן כדי להעריך שינויים ברשתות איתות לאחר עמידות טיפולית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לזהות אלפי פוספופפטידים בצורה פשוטה וזולה יחסית להערכה גלובלית של הפוספו-פרוטאום. כדי לקצור רקמת גידול, שקלו את הגידול ובתרבית, הוסיפו שני מיליליטר של מאגר ליזה קר כקרח לכל 100 מיליגרם רקמה.

לאחר מכן השתמש בהומוגנייזר כף יד או ספסל כדי להומוגניזציה של הליזאט. כדי להפחית ולאלכוהול את הדגימה, מחממים את הצינור בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן מצננים את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. בעודך על קרח, סוניקציה של הליזאט שלוש פעמים, ואז מחממים את הדגימה ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הנח את צינור הסוניקציה ברוטור דלי מתנדנד וצנטריפוגה את הליזאט בטמפרטורה של 3, 500 גרם ו-15 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז אסוף את הסופרנטנט והשליך את הגלולה. כדי לעכל את הליזאט, השתמש ב-100 טריס מילי-מולרי כדי לדלל את הדגימה פי 12 כדי להפחית את כמות הגואנידיניום. עבור חמישה מיליגרם חלבון, הוסף 10 מיקרוגרם של ליזיל אנדופפטידאז או lys-C ודגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש עד שש שעות.

הכן מיליגרם אחד למיליליטר של טריפסין שטופל ב-TPCK ב-HCL מילי-מולרי אחד עם 20 מילי-מולרי סידן כלורי וטריפסין שנוספו ביחס של 1 ל-100 טריפסין לחלבון. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן הוסיפו מנה נוספת של טריפסין לצינור ודגרו על הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

הוסף את הדגימה למסנן ניתוק של 15 מיליליטר 10 קילודלטון. צנטריפוגה את הדגימה בדלי מתנדנד או ברוטור זווית קבועה ב-3, 500 גרם ו-15 מעלות צלזיוס עד שנפח השמירה הוא פחות מ-250 מיקרוליטר. לאחר מכן אסוף את הזרימה והשליך את ה-retentate.

כדי להחמיץ את הדגימה, הוסף כ-20 מיקרוליטר של 5% חומצה טריפלואורואצטית או TFA למיליליטר ליזאט. מערבבים היטב את הצינור ומשתמשים ברצועת pH כדי למדוד את ה-pH. במידת הצורך, הוסף תוספת של 5% TFA כדי להתאים את ה-pH ל-2.5.

לאחר מכן, חבר לקצה הקצר יותר של עמוד C18 לסעפת ואקום. לאחר הגדרת הוואקום בין 17 ל -34 קילופסקל, השתמש בשלושה מיליליטר של 100% אצטוניטריל ופיפטה מזכוכית כדי להרטיב את העמוד. אזן את העמודה באמצעות פיפטה מזכוכית והחלת שתי נקודות של שלושה מיליליטר של 0.1% TFA.

לאחר מכן טען את הדגימה המחומצת על העמודה. השתמש בשלושה נפחים של שלושה מיליליטר של 0.1 TFA כדי לשטוף את העמוד. לאחר מכן יש למרוח שני מיליליטר של 40% ACN 0.1% TFA כדי לחסל את הדגימה ולאסוף שני שברים של שני מיליליטר לתוך צינורות תרבית זכוכית.

בעזרת פרפילם, כסו את צינורות הנוזל והשתמשו במחט בגודל 20 כדי לנקב שלושה עד חמישה חורים לתוך המכסה לפני ליופיליזציה של הדגימות למשך הלילה. השעו מחדש את האבקה הליופילית עם 0.5 מיליליטר של משקעים חיסוניים קרים כקרח או מאגר קשירת IP בכל שבר. העבירו את נפח ההשעיה של 0.5 מיליליטר מהשבר השני לצינור עם השבר הראשון ושמרו את קצה הפיפטה.

השתמש בעוד 0.5 מיליליטר של מאגר IP כדי לשטוף כל צינור ליופיליזציה לפני העברת התוכן לצינור הקריאופיליזציה, ולאחר מכן חזור על השטיפה באמצעות שני מיליליטר של מאגר IP. לאחר שימוש ב-P200 עם קצה חתוך כדי להעביר את מלאי ה-0.5 מיליגרם למיליליטר של תמיסת חרוזי נוגדנים לצינור המיקרופוגה, הוסף 450 מיקרוליטר של מאגר קשירת IP קר כקרח כדי לשטוף 50 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי נוגדנים 4G10 ו-25 מיקרוליטר של 27 תמיסת חרוזי נוגדנים B10.4 בצינור מיקרופוגה. צנטריפוגה את הצינור בחום של 100 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.

לאחר שאיבת הסופרנטנט, הוסף נפח שווה לתרחיץ המקורי של מאגר קשירת IP כדי להשעות מחדש את החרוזים. הוסף חרוזי pY שטופים מראש לתמיסת הדגימה המושעה בצינורות הקירור של מכסה הבורג, ולאחר מכן דגר אותם בארבע מעלות צלזיוס על מסובב מקצה לקצה למשך הלילה. לאחר סיבוב החרוזים, שמור את הסופרנטנט שישמש להעשרת פפטידי pST.

לאחר מכן, השתמש ב-300 מיקרוליטר של מאגר קשירת IP כדי להשעות מחדש את החרוזים ולהעביר אותם לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. סובב את הדגימות ב-100 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. ואז עם 500 מיקרוליטר של מאגר כריכת IP, שטפו את החרוזים שלוש פעמים.

שוטפים את החרוזים ארבע פעמים עם 450 מיקרוליטר של 25 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט pH 7.5. טבלו קצה טעינת ג'ל מעט מתחת לפני השטח של החרוז ושאבו לחלוטין את הסופרנטנט. הוסף פי ארבעה מנפח החרוזים של 0.1% TFA לחרוזים.

לאחר מכן מערבבים אותם היטב ומדגרים את הצינור בתרמו-מיקסר בטמפרטורה של 1, 000 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. העבירו את ההשעיה למסנן סיבוב של 0.2 מיקרומטר וצנטריפוגה את המסנן ב-850 גרם למשך דקה אחת. לאחר העברת הפליטה לצינור מיקרוצנטריפוגה קושר חלבון נמוך, רכז בוואקום את הנוזל ליובש ב-40 מעלות צלזיוס עם זמן חום של 300 דקות למשך הלילה.

להכנת חרוזי תחמוצת הטיטניום הכלולים בקצוות, הוסיפו 200 מיקרוליטר של 100% ACN. לאחר מכן הפוך אותו והחליק את הקצה הצר כדי להזיז את הנוזל לכיוון המכסה. בעזרת סכין גילוח, חותכים את הקצה ומניחים אותו מעל צינור הקישור דל החלבון.

לאחר מכן הסר את המכסה והכנס מיקרופיפטה כדי לצלול החוצה את ה-ACN שנותר לפני שתחזור על הכביסה. הכינו מראש את הטיטניום הדו חמצני עם 500 מיקרוליטר של 100% ACN פעמיים. לאחר מכן התנו את הטיטניום הדו-חמצני ב-500 מיקרוליטר של 0.2 מולרי נתרן פוספט מאגר pH 7 פעמיים.

לבסוף, השתמש ב-300 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל כדי לשטוף את החרוזים שלוש פעמים. הוסף 400 מיקרוליטר של 50% ACN 0.1% TFA לצינור הקישור דל החלבון. לאחר מכן מוסיפים 84 מיקרוליטר חומצה לקטית.

העבירו את הפוספופפטידים המרחפים לתוך צינור הקישור דל החלבון ודגרו אותם בטמפרטורת החדר באמצעות מסובב קצה על קצה למשך שעה. לאחר גלולת החרוזים, השתמש ב -300 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל כדי לשטוף אותם פעמיים ולסובב אותם כלפי מטה. עם 300 מיקרוליטר של מאגר שטיפה, שטפו את החרוזים פעמיים.

לאחר מכן העבירו אותם למסנן סיבוב של 0.2 מיקרומטר. לאחר הסחיטה, העבירו את יחידת המסנן לצינור קשירה נקי דל חלבון בנפח 1.5 מיליליטר ועם 200 מיקרוליטר של 0.9% אמוניום במים, הסירו את התכולה פעמיים. לאחר בדיקת ה-pH, יש לרכז את החומר ליובש למשך הלילה כדי לאדות את האמוניה.

כדי להפיל את הפפטידים לניתוח טרשת נפוצה, יש להרכיב מחדש את הפוספופפטידים עם 15 מיקרוליטר של 0.1% TFA. נקה את הדגימה באמצעות קצה C18 בעל יכולת קשירה של חמישה מיקרוגרם ופעל לפי פרוטוקול היצרן. לבסוף, לאחר ייבוש מוחלט של נפח הפליטה על ידי ריכוז ואקום, השעו מחדש את הפוספופפטידים המיובשים ב-12.5 מיקרוליטר של תמיסת ספקטרומטריית מסה.

ג'ל מוכתם זה של ליזאט מעוכל מראש מאשר את נוכחותם של חלבונים ואילו צביעה של הליזט שלאחר העיכול מאשרת את העיכול המלא. לעיכול מלא, לא אמורות להופיע רצועות מעל 15 קילודלטון למעט רצועות 30 קילודלטון ו-23.3 קילו-דלטון עבור lys-C וטריפסין בהתאמה. התוספת של lys-C גם מפחיתה את מספר המחשופים שהוחמצו.

המשקעים החיסוניים של pY מפרידים ביעילות בין pY לפפטידים pST היו בממוצע 85% מהפוספופפטידים שזוהו מתכשיר ה-pY הם pY ומעל 99% מהפוספופפטידים שזוהו מתכשיר ה-pST הם pST. טיטניום דו חמצני משמש להעשרת פוספופפטידים בשני התכשירים. האחוז הצפוי של פפטידים בתכשיר מוכן לטרשת נפוצה שעוברים זרחן הוא בין 30 ל-50% ולרוב הפוספופפטידים שזוהו יש קבוצת זרחן אחת או כפולה.

לאחר ביצוע ספקטרומטריית מסה, קבצי ה-MS raw נטענים לתוכנת ניתוח MS. כפי שמודגם כאן, קביעת חיתוך הסתברות לוקליזציה של יותר מ-0.75 מסננת כ-5% מהפפטידים pY ו-15% ו-34% מהפפטידים pS ו-pT בהתאמה. לאחר יישום מסננים אלה, המספר הצפוי של זיהויי פוספופפטידים בסוף ניתוח MS הוא כ-300 פפטידים pY עבור חמישה מיליגרם של החלבון ההתחלתי וכ-7,500 פפטידים pS ו-640 פפטידים pT עבור 2.5 מיליגרם מכמות הפפטיד ההתחלתית מתכשירי ההעשרה המתאימים.

לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שישה ימים אם שלבי ה- pY וה- pST מבוצעים במקביל. עם זאת, עבור יותר משמונה דגימות, בצע את השלבים ברצף כדי להפחית את השגיאה הטכנית במשך ארבעה ימים נוספים. בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור להתמקד בפרטים.

כל שלב הוא חשוב ויכול להשפיע על איכות ההכנות הסופיות כולל בקרות האיכות הנדרשות הוא קריטי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ ולעכל חלבונים, ולאחר מכן העשרת פוספופפטיד לניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה כדי לחקור שינויים גלובליים בפוספופרוטאום.