Name: CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: למד שיטה יעילה לשיבוט פלסמידים לביטוי RNA מדריך בודד עבור ניסויים ב-CRISPR. הטכניקה מאפשרת שיבוט בצעד אחד ויצירת זוגות RNA מדריך לעריכת גנים ומהנדסת אפיגנום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sathiji Nageshwaran נתמך על-ידי פרידרייך מחקר ברית אטקסיית (07340305 - 01) נבחרת אטקסיה קרן מלגות ומענקים (7355538-01). אלחנדרו צ'אבז מומן על ידי המכון הלאומי לסרטן גרנט 5T32CA009216-34 ופרס בורוז Wellcome קרן הקריירה עבור מדענים רפואיים. . ג'ורג ' מ הכנסייה נתמך על ידי ארה ב במכון הלאומי של בריאות (NIH) לאומי מחקר הגנום האנושי גרנט RM1 HG008525, המכון Wyss ביולוגית בהשראת הנדסה. ג'יימס ג'יי קולינס מאשר תמיכה של המענק סוכנות צמצום ההגנה איום HDTRA1-14-1-0006 הקבוצה גבולות פול אלן ג'י. אלחנדרו צ'אבז פיתח שיטת השיבוט כפול-מדריך. Sathiji Nageshwaran, אלחנדרו צ'אבז, נאן שר Yeo כתב היד עם קלט מן כל המחברים.

<ol><li>Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-crRNA+ribonucleoprotein+complex+mediates+specific+DNA+cleavage+for+adaptive+immunity+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).</li>
<li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Programmable+Dual-RNA-Guided+DNA+Endonuclease+in+Adaptive+Bacterial+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+genomics+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Gilbert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Modular+RNA-Guided+Regulation+of+Transcription+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Directed+Genome+Editing+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).</li>
<li>Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas-Mediated+Targeted+Genome+Editing+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).</li>
<li>Vidigal, J., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083(2015).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Research. 42 (19), e147(2014).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Scientific Reports. 4 (1), (2014).</li>
<li>Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sgRNA+Scorer+2.0%3A+A+Species-Independent+Model+To+Predict+CRISPR%2FCas9+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).</li>
<li>Doench, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).</li>
<li>The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs">http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs</a> (2015).</li>
<li>Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate Cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngler%2C+C+%22DNA+Cloning+and+Assembly+Methods%22">DNA Cloning and Assembly Methods</a>. Valla, S., Lale, R. , Humana Press. New York, NY. 119-131 (2013).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+Is+a+Single+RNA-Guided+Endonuclease+of+a+Class+2+CRISPR-Cas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li>
</ol>

. ג'ורג ' מ הכנסייה יש הון עצמי Editas, קאריבו החיים, אשר שואפים למסחרי הגנום CRISPR-Cas9 עריכה טכנולוגיה (לקבלת רשימה מלאה של גילוי, עיין http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).

נעשו מספר שינויים, עלות-לחיסכון בזמן לבניית וקטור ביטוי gRNA. פרוטוקול ההגבלה, מצדו צעד בודד המותווה כמו גם שיטה של gRNA לזווג ביטוי וקטור הבנייה. הביטוי gRNA לזווג מושגת באמצעות הגברה PCR באמצעות oligonucleotides המכיל רצף המטרה gRNA קדמי (n20) והן המשלים הפוכה של מטרה אחרת (n20). זה ואז מציג מקדם מכירות RNA Pol III המשני (7SK) כמו גם זנב sgRNA לתוך כמקובל לבטא gRNA יחיד ביטוי פלסמידים.
עיצוב oligonucleotide זהיר יבטיח PCR מוצלחת של הבנייה gRNA לזווג, כמו גם מצדו של-סופך. בעקבות צעד אחר צעד הגבלת ותגובה מצדו, התוספת של עוד יותר BsmBI יבטיח שכל כיווני ביטוי שלא שונתה בעקבות התגובות נחתכים. פעולה זו תקטין באופן משמעותי את הרקע על השינוי. באמצעות נב יציב המוסמכת e. coli וגידול ב 30 ° C יהיה להגדיל את התשואה של שינוי מוצלח.
היתרונות שטכניקה זו יש על פני שיטות נפוצות כוללים של פישוט של התהליך של oligonucleotide, חישול, מגבלה צעד אחר צעד של הווקטור ביטוי gRNA ולא את מצדו של oligonucleotides, ואת היכולת לנצל קונבנציונלי וקטורים ביטוי gRNA יחיד עבור הביטוי של מדריכים לזווג. בעוד הפרוטוקול המתוארים כאן מתמקדת על קבוצת וקטורים יונקים, האסטרטגיה הכללית פלסטיק והוא החלים על כל אורגניזם, בתנאי הווקטור המתאים gRNA זמין. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר חוסך זמן ועלויות.
עם זאת, יצוין כי ההליך מחולקת לרמות של רכישת oligonucleotides בודדים אינה סקיילבילית טוב לדור של ספריות המכיל אלפי gRNAs. למטרות אלה, מומלץ מקורות חלופיים של סינתזה oligonucleotide כגון oligo שבב סינתזה.
. זה מועיל לכלול פקד לא הוספה בעת שכפול gRNAs. התגובה הזו ניתן בקלות להגדיר במקביל עם התגובות של עניין והוא יכול לשמש כדי לקבוע אם עיכול לא שלם של וקטור המוצא תרמה המושבות ציין בסוף ההליך. יתר על כן, אם אחד מהפרוטוקולים שיבוט לעיל נכשל עקב וקטור שהיישום מתעכל עמוד השדרה או יעילות מצדו המסכן, אנו מציעים מנסה החלופה שכפול השיטה שאנחנו המחולקות.
בעת שימוש שער הזהב שיבוט בו-זמנית לעכל את הווקטור, מאתרים ומפסיקים ב oligonucleotides קטן בתוך תגובה אחת, חשוב לבדוק כי gRNA כי הם להיות משובטים לתוך וקטור אין אתר BsmBI בתוכו, כפי שזה יוביל t הוא gRNA שהוא נחתך, היעדרות של מושבות אחרי הטרנספורמציה.
GRNA שיבוט אסטרטגיה שאנחנו המחולקות מאפשר דור מהירה וחסכונית של gRNAs ~ 10 דולר ארה ב כל מדריך, עם עיקר העלויות מגיעה הסינתזה oligonucleotide ואימות רצף. בעוד השיטה מחולקת לרמות מיועד לאפשר למשתמשים ליצור gRNAs לשימוש עם SpCas9, הפרוטוקול בקלות ניתן להתאים לשימוש עם Cas9 orthologues או אחרים מונחה RNA endonucleases כגון Cpf1 או C2C2, עם שינויים קלים עמוד השדרה וקטור ו oligonucleotide הסככה רצף16,17.
פרוטוקול שפורטו לעיל יספקו gRNA תבדוק-רצף הביטוי פלסמידים ד' 3 (החל עם oligonucleotides המעוצבים בהתאם), וזה מהר יותר באופן משמעותי מאשר שיטות הנוכחי. זה כולל את העיצוב gRNA של 1 h (שלבים 1-2.3), דילול aliquot של oligonucleotides של 10 דקות (שלבים 3-5.1), עיכול, טיהור של וקטור הביטוי gRNA pSB700 של 2 h (שלבים 6-6.4), השיבוט של oligonucleotides gRNA אל predi gested pSB700 gRNA ביטוי וקטור בין לילה בטמפרטורת החדר (שלבים 7-7.3), מצדו הגבלה BsmBI צעד אחר צעד של 3 שעות ו- 40 דקות (שלבים 8-8.4), הטרנספורמציה של 16 h (שלבים 9-9.6), ואת האימות של הרצף של פלסמיד ביטוי gRNA של 24 שעות (עם משך הזמן בהתאם סנגר רצף זמינות ומהירות בעקבות הגשת של המושבה חיידקי; שלב 10). העיצוב gRNA לזווג את השינוי רצף לוקח 1 h (שלבים 11-13). GRNA לזווג ה-PCR לוקח 3.5 h (שלבים 14-14.4). השיבוט של השבר PCR לתוך וקטור pSB700 לוקח 3 שעות ו- 40 דקות (שלב 15-16).
הנושאים הכי סביר עשוי להיות מתמודד עם פרוטוקול זה מתייחסים חוסר היעילות הרכבה שער הזהב, טרנספורמציה. כוללות פקד לא הוספה במהלך ההרכבה שער הזהב כדי להמחיש את היעילות של ההרכבה. במהלך השינוי, הפקד חיובי puc19 תספק פקד יעילות טרנספורמציה. נב יציב e. coli אמור לשמש פלסמידים תואם lentiviral, לעתים קרובות דורשת עד > 16 h ב- 30 מעלות צלזיוס להניב מושבות גלוי.

חלבונים הקשורים CRISPR 9 (Cas9) הוא endonuclease מונחה RNA אשר מכוונת מטרה גנומית הרצוי כאשר ומורכבת עם מדריך קטן מעוצב כראוי RNA (gRNA)1,2. gRNAs מהווים רצף 20-נוקלאוטיד (protospacer), אשר משלים רצף גנומית היעד. ליד המטרה גנומית רצף הוא 3' protospacer-הקשורים מוטיב (פאם), אשר נדרש עבור איגוד Cas9. במקרה של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת Cas9 (SpCas9), יש את הרצף הגולה. על איגוד המטרה דנ א, Cas9 cleaves שני גדילי ה-DNA, ובכך מגרה מנגנוני תיקון, שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי לשנות את מיקומה של ריבית. ההפעלה של הנתיב (NHEJ) מועדת לטעויות הלא-הומולוגי הצטרפות-סוף יכול לגרום שיבוש גן המטרה. לחלופין, התיקונים שבוצעו באמצעות רקומבינציה הומולוגית יכול לעורר השילוב יישוב של רצף ה-DNA הרצוי אם תבנית התורם מסופק6. נוקלאז-מת Cas9 (dCas9) משתנים ניתן גם שנוצר3 על ידי מוטציה משקעי בתוך Cas9 החיוניים לפעילות endonucleolytic. dCas9 נשאר המוסמך עבור איגוד ה-DNA, אך לא לחתוך את מטרתה מאוגד. פיוזינג תחומים שונים אפקטור dCas9, מכוון אותו ליד אתר התחלה תעתיק של הגן, dCas9 יכול לשמש עבור אינדוקציה ג'ין סלקטיבית או חלקי הגן להשתיק4,5.
בעוד חזק מאוד, היכולת להשתמש Cas9 כדי להתמקד רצף גנומית של עניין דורש כי משתמש יוצר לראשונה gRNA ייחודי האתר היעד. מגוון שיטות לבניית gRNA ביטוי וקטורים יש כבר בעבר תיאר, רבים של יעילות בדרגות שונות, עולה6,7,8. Amplicons PCR עצמאי יכולה לשמש gRNAs להקרנה מהירה, הולך מן oligonucleotide משלוח. תרביות תאים בתוך מספר שעות; עם זאת, זה דורש Ultramer (מעל 100 bp) oligo סינתזה, שהינו יקר9. . זה גם ניתן לרכוש gBlocks כי הם חסכונית יותר מאשר Ultramers. Cas9 הפך במהירות מרכיב אינטגרלי של ערכת הכלים הביולוגיה המולקולרית המודרנית, שיטה פשוטה, זולה, יעילה במיוחד עבור שכפול gRNA יהיה ברכה לשדה. השיטה המתוארת כאן ננקטה שלנו קבוצה ומעבדות בשיתוף פעולה בשנים האחרונות לייצר gRNAs ייחודי מעל 2,0004.
השיטה מחולקת לרמות מתמקד בטכניקות עבור השיבוט של וקטורים תואם lentiviral המכיל gRNA יחיד או לכל היותר שני gRNAs. עבור הדור של פלסמידים המכיל יותר משני gRNAs, או לשכפל ספריה של gRNAs, גישות אלטרנטיביות מומלצים9,10,11,12.

<table><tbody><tr><td>BsmBI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ליגאז</td><td>אנזימטי/ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>L6030-LC-L/M0202S</td><td></td></tr><tr><td>מאגר 3.1</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP)</td> <td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין מיני-פרפ ערכת</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>מיומן כימית E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019l, C2987l או C3040H</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה סטנדרטיים, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR 8 רצועות Axygen</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-222-250</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler עם בקרת צעדי טמפרטורה ניתנת לתכנות</td><td>BioRad,</td> <td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>UV ספקטרופוטומטר (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSB700 פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>#64046</td><td></td></tr><tr><td>NEB יציב מוכשר E. coli (יעילות גבוהה)</td><td>New England Biolabs</td><td>c3040</td><td></td></tr><tr><td>מרק ליזוגני (LB)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מאגר אמפיצילין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE (1 מ"מ EDTA, 10 מ"מ Tris-Cl, pH 7.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSN007 פלסמיד</td><td>Addgene</td><td><a href="https://www.addgene.org/102440/">102440</a></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr מדריך ה-rna שיבוט בתרבית של מערכות

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

פרוטוקול מחולקת לרמות מתאר שיטות יעיל עבור הדור יעיל וחסכוני של מדריך הקשורים Cas9 RNAs. שתי אסטרטגיות חלופיות עבור מדריך שיבוט RNA (gRNA) מתוארים בהתבסס על השימוש של אנזים הגבלה בסוג IIS BsmBI בשילוב עם קבוצת וקטורים תואם. מחוץ הגישה לשירותי רצף סנגר כדי לאמת את הווקטורים שנוצרה, אין ציוד מיוחד או ריאגנטים נדרשים מלבד אלה הינם סטנדרטיים למעבדות הביולוגיה המולקולרית המודרנית. השיטה מחולקת לרמות זה מיועד בראש ובראשונה שכפול אחד gRNA יחיד או וקטור לבטא gRNA לזווג אחד בכל פעם. פרוצדורה זו אינה סקיילבילית טוב לדור של ספריות המכיל אלפי gRNAs. למטרות אלה, מומלץ מקורות חלופיים של סינתזה oligonucleotide כגון סינתזה oligo-צ'יפס. לבסוף, בעוד פרוטוקול זה מתמקד קבוצת וקטורים יונקים, האסטרטגיה הכללית פלסטיק והוא ישים מכל יצור אם הווקטור המתאים gRNA זמין.

השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה הן עבור היצירה של וקטורים ביטוי גם gRNA יחיד או מזווג. GRNA יחיד להביע וקטורים יכולים להיווצר על-ידי predigesting עמוד השדרה וקטור (איור 1) ואחריו נבדק זה בסדרה של oligonucleotides קצר או באמצעות שער הזהב שיבוט בו-זמנית לעכל את עמוד השדרה של וקטור, מאתרים ומפסיקים את זה פנימה סדרת oligonucleotides קצר בתגובה אחת. סיפק גם הוא שיטה לייצר וקטורים המכילים 2 gRNAs, אחד מונע על ידי יזם עצמאי משלו, על-ידי שיבוט קטע PCR מותאם אישית (איור 2).
שיבוט מוצלח עבור כל הפרוטוקולים מחולקת לרמות יגרום המראה של מושבות יותר באופן משמעותי עבור המרות עם ה-DNA הוספה המתאים יותר בצלחת הבקרה הוספה לא (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig1.jpg"> איור 1: העיכול של וקטור הביטוי gRNA pSB700. .1% ג'ל agarose משמש. ליין 1: pSB700 נימולים. ליין 2: pSB700 לחתוך עם BsmBI.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig2.jpg"> איור 2: מזווג gRNA PCR. .1% ג'ל agarose משמש. ליין 1: מדריך לזווג PCR שבר של ~ 490 bp.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig3.jpg"> איור 3: מוצלח שיבוט של טרנספורמציה של פלסמיד gRNA. החלונית השמאלית מציגה ליברות והפך אמפיצילין צלחת עם בהצלחה מושבות. החלונית ' נכון ' מציגה צלחת הבקרה הוספה לא מציג שום מושבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57998/57998fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>pSB700 מדריך ביטוי וקטור</td>
			<td>1-5 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>נב מאגר 3.1</td>
			<td>4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים מזוקקים</td>
			<td>μL עד 40</td>
		</tr>
<tr>
<td>הנפח הכולל</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: עיכול הגבלה של הווקטור הביטוי gRNA pSB700 עם BsmBI.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Oligos annealed gRNA (בודדת או במאגר התגובה)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSB700 BsmBI-מעוכלים מדריך ביטוי וקטור</td>
			<td>1 μL (~ 100-250 ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x T4 DNA ליגאז התגובה מאגר</td>
			<td>2 μL (1 x ריכוז סופי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>T4 DNA ליגאז</td>
			<td>1 μL (120 יחידות)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים מזוקקים</td>
			<td>15 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>הנפח הכולל</td>
			<td>20 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: מצדו תגובה של gRNA oligonucleotides אל predigested pSB700 gRNA ביטוי וקטור.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>נפח (1 x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ליגאז T4</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>נב מאגר 3.1</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>וקטור (למשל, pSB700) (40 fmol)</td>
			<td>1 μlL</td>
		</tr>
<tr>
<td>הוסף - קדימה ולהפוך oligos או ה-PCR מקטע כפול מדריך (40fmol)</td>
			<td>1 μL (0.5 μL לפנים ולא לאחור 0.5 μL)</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: צעד אחר צעד BsmBI ההגבלה, gRNA מצדו תגובה שילוב.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מדריך 1</td>
			<td>רצף 3 מושבות</td>
		</tr>
<tr>
<td>עבור 2 מדריכים</td>
			<td>רצף מושבות 5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>עבור 3 מדריכים</td>
			<td>רצף מושבות 10-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>עבור 4 מדריכים</td>
			<td>רצף מושבות 15-20</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: המספר המומלץ של מושבות רצף עבור gRNA במאגר שיבוט תגובות.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>רכיב ה-PCR</td>
			<td>תגובה 50 µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר לפנים 10 מיקרומטר</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר הפוכה 10 מיקרומטר</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x Phusion HF או המאגר GC</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs 10 מ מ</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>תבנית ה-DNA</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phusion DNA פולימראז</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוקלאז ללא מים</td>
			<td>µL עד 50</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: תערובת PCR gRNA לזווג.

. הנה, פשוט, יעיל, בעלת שיטה חסכונית של שיבוט sgRNA מחולקת לרמות.

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

שיטה זו מאפשרת יצירה קלה של פלסמידים של ביטויי RNA מנחים לניסויים בהנחיית CRISPR. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי שיבוט יכול להתבצע בשלב אחד מדריך מזווג RNAs ניתן ליצור באמצעות פלסמידים ביטוי RNA מדריך יחיד. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, לדלל את פריימרים lyophilized במאגר TE 1X לריכוז סופי של 100 micromolar.Aliquot כמות שווה של פריימרים קדימה ואחרץ לתוך צינורות כובע רצועת PCR. וורטקס לערבב. לאחר מכן, לסובב את תערובות RNA RNA oligonucleotide ב 100 פעמים G במשך 15 שניות.הדגירה את התגובה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפני הגדרת הקשירה. הוסף בין מיקרוגרם אחד לחמישה מיקרוגרם של וקטור ביטוי מדריך PSB700 שנבחר ל- BSNB1 באמצעות 0.5 מיקרוליטרים של BSNB1 לכל מיקרוגרם של וקטור אחד. מוסיפים מים מזוקקים עד שהנפח הכולל הוא 40 מיקרוליטרים ונוהגים את העיכול במשך שעה ב-55 מעלות צלזיוס.הפעל את מוצרי העיכול על 1.5% ג'ל אגרוז נמס נמוך. חותכים את רצועת עמוד השדרה הווקטורית המתעכלת המתאימה לרסיס בגודל של כ-9 קילו-בבס. מעבירים את פרוסת הג'ל לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרית, יש לחלץ את הדנ"א מג'ל אגרוז בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן לדלל את ה-DNA לתוך 10-15 microliters של מאגר TE כדי לקבל אלוט מרוכז. כאשר מוכנים לבצע קשירה להוסיף 15 microliters של מים מזוקקים לבקבוקון.הוסף 1 microliter של מדריך RNA בעבר annealed oligonucleotides, מיקרוליטר אחד של BSNB1 מתעכל PSB700 מדריך ביטוי וקטור ו 2 microliters של 10XT4 מאגר תגובת ליגס DNA. ואז לערבב את הפתרון הזה על ידי מערבולת. הוסף מיקרוליטר אחד של רצועות DNA ומערבולת שוב.סובב את הפתרון ב 100 פעמים G במשך 15 שניות. הדגירה את התגובות בטמפרטורת החדר במהלך הלילה הקפדה לכלול תגובה שלילית לא להוסיף שליטה כי יש וקטור מתעכל BSNB1 לבד ללא מדריך annealed RNA אוליגוט להוסיף. כדי להתחיל, להסיר E.coli מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותו על קרח במשך 5 עד 10 דקות.הוסף 0.5 microliters של תערובת התגובה מוכנה שמונה microliters של E.coli מוסמך. שומרים את התערובת על הקרח במשך 30 דקות. מחממים את התערובת ב-42 מעלות במשך 45 שניות.ואז לתת לתערובת לנוח על קרח במשך שתי דקות. באמצעות שייקר סיבובי, לשחזר את התרבות 250 microliters של מדיה SOC באמצעות התנאים המפורטים כאן עבור NEB DH5a או אורוות NEB. לאחר מכן, צלחת 80 microliters של התרבות על צלחת מרק lysogeny עמידות לאנטיביוטיקה מתאימה.דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עבור NEB DH5a או ב 30 מעלות צלזיוס עבור אורוות NEB. כדי להתחיל, השתמש בפרוטוקול PCR המיוחד Phusion GC כדי ליצור את הקטע הדרוש כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפעל מוצר PCR זה בג'ל 1%agarose וודא כי רצועה אחת נראית בכ- 490 זוגות בסיסים.באמצעות ערכת מיצוי ג'ל לחתוך ולחלץ מוצר PCR זה. ואז aliquot מוכן 1X מאסטר לערבב לתוך צינורות PCR. באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף מיקרוליטר אחד של מוצר PCR בריכוז של 40 femtomoles לכל מיקרוליטר.במיקרוליטר אחד של וקטור PSB700 להוסיף ריכוז של 40 femtomoles לכל מיקרוליטר. כלול פקד הכנסה ללא שימוש במיקרוליטר מים אחד במקום במדריך RNA אוליגונוקלאוטידים. לעכל את הווקטור ואת ligate מוסיפה בתגובה אחת באמצעות פרוטוקול שער הזהב המתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר התגובה הראשונית שער הזהב להוסיף 0.5 microliters נוספים של האנזים BSNB1 לכל תגובה. המשך את התגובה ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. כאשר תגובת שער הזהב הושלמה המשך לתהליך הטרנספורמציה E.coli שתואר קודם לכן.במחקר זה, וקטורים ביטוי RNA מדריך יחיד נוצרים בהצלחה באמצעות שתי שיטות. בשיטה הראשונה, עמוד השדרה הווקטורי מתעכל מראש ומקוטט בסדרה של אוליגונוקלאוטידים קצרים. השיטה השנייה השתמשה בשכפול שער הזהב כדי לעכל ולזלול בו זמנית בתגובה אחת.RNA מדריך מזווג המביעים וקטורים, כל מונע על ידי מקדם עצמאי משלו נוצרים בהצלחה על ידי שיבוט קטע PCR מותאם אישית. שיבוט מוצלח עבור אחת משיטות אלה יגרום המראה של מושבות יותר באופן משמעותי עבור טרנספורמציות עם DNA הכנס המתאים בהשוואה לוח בקרה לא הכנס. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לא לכלול פקדי הוספה בשלב השכפול שלך.בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו הנדסת אפיגנום ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות כמו מה ההשפעות חתימות כרומטין יש על ביטוי גנים.

crispr-guide-rna-cloning-for-mammalian-systems

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי לתכנן ולבצע מיקוד מרובבת של משפרי עם החלבון פיוז'ן deactivating SID4X-dCas9-קראב, המכונה גם משפר הפרעה (משפר-i). פרוטוקול זה מאפשר זיהוי משפרי המווסתים ביטוי גנים ואסטמה ומקילה על ניתוח היחסים בין משפרי ויסות גנים מטרה משותפת.

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

כאן, אנו מציגים מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה בקלות מגה-פלקס gRNA וקטורים עבור גישות CRISPR/Cas9. STAgR הופך gRNA ריבוב פשוטה ויעילה, הניתנים להתאמה אישית.

פרוטוקול ניתן להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR)

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה יעילה עבור הדור היעיל של פלסמידים המבטאים הן את אנזים CRISPR והן את RNA מדריך יחיד (sgRNAs). שיתוף פעולה של תאים יונקים עם וקטור sgRNA / CRISPR זה וקטור כתב לוציפראז כפול הבוחן תיקון הפסקה דו-גדילי מאפשר הערכה של יעילות נוקאאוט.

בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

הפרוטוקול מתאר כיצד ליצור מיובלסטים נוק-אאוט באמצעות CRISPR/Cas9, החל מתכנון של רנ"א מנחים ועד לשיבוט תאי ואפיון של שיבוטים נוק-אאוט.

פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/Cas9 בתיווך נגיף לנטי

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

העברת עורכי גנום כ-RNA היא אמצעי עוצמתי במיוחד לשינוי הגנומים של תאי יונקים ראשוניים וקווי תאים. מטרת הפרוטוקול היא להעביר עורכי גנום כ-mRNA לתאים ראשוניים ולקווי תאים ביונקים, ולאחר מכן ריצוף וניתוח ממוקדים של Illumina כדי לכמת את תוצאות העריכה.

עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך

כאן, אנו מפרטים את השיטה של S equen של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מאפשר מיפוי גנום רחב של interramolecular ו intermolecular RNA-RNA אינטראקציות in vivo . SPLASH ניתן ליישם את המחקר RNA אינטראקציות של אורגניזמים כולל שמרים, חיידקים ובני אדם.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

למד שיטה יעילה לשיבוט פלסמידים לביטוי RNA מדריך בודד עבור ניסויים ב-CRISPR. הטכניקה מאפשרת שיבוט בצעד אחד ויצירת זוגות RNA מדריך לעריכת גנים ומהנדסת אפיגנום.

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

גלה סרטונים נוספים