Name: Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאים אנדוקריניים בלבלב עכברים וריצוף RNA תא בודד לניתוח תמסורתי מפורט. טכניקה זו מאפשרת חקר התפתחות תאי האי וההטרוגניות שלהם למחקר סוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים המרכז הלאומי על חלבון מדעי, בייג'ינג (אוניברסיטת פקינג) ואל מרכז פקין-צינג עבור פלטפורמת מחשוב מדעי החיים. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע, טכנולוגיה של סין (2015CB942800) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31521004, 31471358 ו 31522036), מימון ממרכז פקין-צינג עבור מדעי החיים ג-R.X.

<ol><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li>
<li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">On the origin of the beta cell.</a> Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li>
<li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+Advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li>
<li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li>
<li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li>
<li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data%3A+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+in+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li>
<li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v025i01">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li>
<li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadley%2C+W+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer Science & Business Media. (2009).</li>
<li>Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016).</li>
<li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ב פרוטוקול זה, הפגנו שיטה יעילה, קלה לשימוש עבור הלומדים את פרופילי ביטוי תא בודד של תאי β בלבלב. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבודד תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט, כדי לבצע ניתוח transcriptomic תא בודד.
השלב הקריטי ביותר הוא בידודו של תאי β יחיד במצב טוב. הלבלב באופן מלא perfused כדאי להגיב עיכול עוקבות. לא מספיק זלוף, אשר בדרך כלל מתרחשת בלבלב הגבי, יביא תשואה נמוכה איון. לאחר זלוף, הפעם עיכול, ומנענע בעוצמה דורשים תשומת לב מיוחדת. עיכול יתר, שנוצר דגירה ארוך טיימס וחסון רועדת, י...

הלבלב הוא איבר חיוני מטבולית אצל יונקים. הלבלב מורכבת האנדוקרינית אקסוקרינית של תאים. תאים האנדוקרינית הלבלב, לרבות מייצרי אינסולין תאי β α תאים מייצרי גלוקגון, אשכול ביחד ב- איי לנגרהנס ולווסת coordinately גלוקוז מערכתית הומאוסטזיס. תפקוד לקוי של התאים האנדוקריניים תוצאות סוכרת, אשר הפך בעיה מרכזית בבריאות הציבור ברחבי העולם.
בתאי האנדוקרינית הלבלב נגזרות Ngn3+ אבות במהלך מופרה1. מאוחר יותר, במהלך תקופת הלידה, התאים האנדוקריניים להתרבות כדי איונים ילדותי טופס. תאים אלה ילדותי להמשיך לפתח ולהפוך בהדרגה איונים בוגרת, אשר הופכים vascularized בעושר לווסת את הגלוקוז בדם הומאוסטזיס מבוגרים2.
למרות זוהתה קבוצה של גורמי תעתיק, המסדירים β תאית התמיינות, מסלול מדויק ההבשלה של תאי β הוא עדיין לא ברור. יתר על כן, תהליך ההבשלה של תאי β גם כרוך ברגולציה של התא-3,הרחבה-מספר-4 הדור של הטרוגניות הסלולר5,6. עם זאת, מנגנוני הרגולציה של תהליכים אלה לא טוב נחקרו.
תא בודד RNA-רצף היא גישה רב-עוצמה פרופיל תא subpopulations, לאתר את התא שושלת היוחסין מסלולים התפתחותית7. מנצל את הטכנולוגיה הזאת, המפתח האירועים המתרחשים במהלך התפתחות הלבלב איון יכול לפענח ברמה תא בודד8. בין הפרוטוקולים רצפי RNA בתא יחיד, חכם-seq2 מאפשר את הדור של cDNA באורך מלא עם רגישות משופרת, דיוק, השימוש של ריאגנטים סטנדרטי-עלות נמוכה יותר9. חכם-seq2 לוקח כ יומיים לבנות ספריית cDNA רצף10.
כאן, אנו מציעים שיטה בידודו של תאי β התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מ הלבלב של העובר כדי העכברים הטרנסגניים למבוגרים Ins1-RFP11, באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), וניתוחים הביצועים של transcriptomic רמת תא בודד, באמצעות טכנולוגיית Smart-seq2 (איור 1). פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי לנתח את transcriptomes מכל הסוגים התא האנדוקרינית הלבלב במצבים נורמליים, פתולוגי, הזדקנות.

<table><tbody><tr><td>קולגנאז P</td><td>Roche</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 מלקחיים</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם BD מחט 1/2 אינץ' אורך</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>סטריאו פלואורסצנטי מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>סטריאו Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96-Well PCR Microplate</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>מחצלת איטום סיליקון</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>צינור PCR באר דקה</td><td>אקסטרגן</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>סדרן תאים</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה נימית</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase רקומביננטי</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II reverse transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>מאגר גדיל ראשון (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean חרוזים XP חרוזים</td><td>Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR ירוק מאסטר מיקס</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep DNA ספריית ערכת הכנה V2 עבור Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>כלול 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB,</td></tr><tr><td>ערכת אינדקס TAE TruePrep V3 עבור Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD203</td><td>כולל 16 N6XX ו-24 N8XX</td></tr><tr><td>ערכת ניתוח שברי NGS ברגישות גבוהה</td><td>טכנולוגיות אנליטיות מתקדמות</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS ללא Ca2+ ו-Mg2+</td><td></td><td></td><td>138 מ"מ NaCl; 5.34 מ"מ KCl 4.17 מ"מ NaHCO<תת>3; 0.34 מ"מ Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Isolation</td><td></td><td></td><td>buffer 1 & times; HBSS מכיל 10 מ"מ HEPES, 1 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ גלוקוז, pH 7.4</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> FACS <td>1 ופעמים; HBSS מכיל 15 מ"מ HEPES, 5.6 מ"מ גלוקוז, 1% FBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN פריימר</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr> <tr><td>פריימרים</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdh פריימר</td><td></td><td></td> קדימה <td>5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh פריימר</td><td></td><td></td> הפוך <td>5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 פריימר</td><td></td><td></td> קדימה <td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 פריימר</td><td></td><td></td> הפוך <td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

תאים האנדוקרינית הלבלב, אשר מקובצים ב איונים, לווסת את חילוף החומרים האנרגיה והיציבות של גלוקוז בדם. סוגי תאים נפרדים באיונים, כולל הורמון האינסולין תאי β, נבדלים אבות האנדוקרינית נפוצה בשלב העוברי. תאים אנדוקריני ילדותי להרחיב באמצעות התפשטות תאים ולומדים במהלך תקופה ארוכה כמחנכת התפתחותית. עם זאת, המנגנונים תהליכים אלה אינם מוגדרים בבירור. תא בודד RNA-רצף היא גישה מבטיחה עבור אפיון אוכלוסיות תאים נפרדים מסלולים עקיבה תא שושלת היוחסין בידול. כאן, אנו מתארים שיטה עבור RNA בתא יחיד-הרצף של תאי β בלבלב מבודד מן הלבלב עובריים, neonatal ופוסט.

הלבלב היו גזור מן העכברים עובריים, neonatal ופוסט (איור 2 א ו- 2B). עבור עכברים שגילם 18 יום לאחר הלידה, האפקט העיכול תלויה מידת זלוף; לכן, הזריקה הוא הצעד החשוב ביותר עבור בידוד איון (איור 2C-2E ו לטבלה 6). כמה שיותר collagenase שהוזרק כפי שהיה ניתן להשלים הלבלב במהלך שלב זה. הלבלב המנופח לחלוטין מוצג איור דו-ממדי. אם זלוף אינה מוצ...

אנו מתארים שיטה בידודו של תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט ואחריו רצפי RNA בתא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח של השושלת האנדוקרינית הלבלב פיתוח, תא dynamics הטרוגניות, transcriptomic.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

שיטה זו יכולה להיות לענות על שאלות מפתח בשדה איון הלבלב על התביור איון הלבלב, התבגרות, ואת ההתחדשות. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת איסוף של תאי איון לבלב יחידים עבור הדור של נתוני רצף RNA תא יחיד באיכות גבוהה. היישום של טכניקה זו להרחיב לכיוון הטיפול בסוכרת ומחלות אנדוקריניות אחרות הקשורות ללבלב באמצעות ניתוח תעתיק של תאים בודדים אנדוקריניים הלבלב על התנאים הפתולוגיים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו החדרת המחט לתוך צינור המרה הצר של הלבלב עבור זיקוק יכול להיות מסובך. ליום העוברי 17.5 עוברים. לאחר פתיחת חלל הבטן, השתמש פינצטה מרפק להעביר את הרקמה הקרביים לצלחת תחתית שחורה שישה סנטימטר המכיל PBS קר.השתמש מלקחיים כדי לנתק את הלבלב מן הרקמה הקרבית. ומ מניחים את רקמת הלבלב בבקבוקון 20 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של תווי קולגן קרים. עבור יום לאחר הלידה אפס עד 15 עכברים, בזהירות לנתח את כל האונות של הלבלב לפני הצבת הרקמה לתוך הקולגן.עבור יום לאחר הלידה 18 עד 60 עכברים, תחילה להסיר את xiphoid ולחלץ את המעי בצד ימין של חלל הבטן. לדחוף את האונות המדיאליות שמאלה ויימין של הכבד לכל צד כדי לחשוף את כיס המרה ואת צינור המרה המשותף. ומהדקים את התריסום עם זוג מלחצי כלי קטנים בעמדות העליונות והתחתונות כדי לאגף את האתר שבו צינור המרה נכנס לתריסריון.לאחר מכן, לטעון מזרק 5 מיליליטר מצויד מחט 30 מד עם פתרון קולגן קר. ולהשתמש במיקרוסקופ כדי להכניס את קצה המחט לתוך כיס המרה. בזהירות ובזהירות לתפעל את המחט דרך צינור המרה המשותף.ולדכא את הבוכנה כדי לפנק את הלבלב עם אחד עד חמישה מיליליטר של פתרון הקולגנס בהתאם לגודל העכבר. כאשר כל הפתרון כבר perfused, להשתמש במקלפים כדי להעביר מיד את הלבלב לבקבוקון 20 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פתרון קולגן קר טרי. כאשר כל רקמת הלבלב נאספה, מניחים את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, ואחריו שלוש עד חמש דקות של רעידות עדינות.לאחר מכן לסנן את המוצר מתעכל דרך מסננת ניילון 0.25 מילימטר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר חדש. ולהשתמש מזרק 20 מיליליטר המכיל PBS קר קרח לשטוף ביסודיות את מסננת. עבור יום לאחר הלידה 18 עד 60 לבלב, צנטריפוגה מדגם מסונן resuspend הרקמה ב 30 מיליליטר של PBS קר.ואז decant ההשעיה רקמה לתוך צלחת שחורה תחתונה שישה סנטימטר, ולהשתמש פיפטה מיקרוליטר 200 ומיקרוסקופ ניתוח כדי לבחור את איונים להעברה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל נפח קטן של PBS קר. ליום עוברי 17.5 לאחר יום לידה 15 הלבלב, צנטריפוגה רקמת הלבלב מסונן לשימוש חוזר את גלולה בתתבת טריפסין-EDTA עבור דגירה ארבע דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, בעדינות לנסות לדרג את גלולה במשך דקה אחת עם פיפטה 200 microliter, ואחריו תוספת של 0.5 פעמים את נפח סרום חזיר עוברי קר עם מערבולת עדינה כדי לעצור את העיכול.לאחר מכן לאסוף את העיכול על ידי צנטריפוגה resuspend התאים ב 200 microliters של מאגר FACS בצינור FACS 5 מיליליטר למיון לפי ציטומטריה זרימה. עבור קטיף תא יחיד ותזה, aliquot מאגר תריס התא מוכן טרי לתוך שמונה צינורות PCR רצועה, ולהעביר תא בודד לתוך כל אחד. Vortex הדגימות כדי lyse התאים לשחרור של RNA, ואחריו צנטריפוגה במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס, ואחסון מיידי על קרח.לתמלול הפוך, הדגירה את lysates במשך שלוש דקות ב 72 מעלות צלזיוס ואחריו דקה אחת על הקרח. בקצרה צנטריפוגה הדגימות במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס ולהוסיף 5.7 microliters של תערובת שעתוק הפוך לכל מדגם כדי להביא את הנפח הכולל ל 10 microliters עבור כל מדגם. לאחר מערבולת עדינה וצנטריפוגה, לטעון את הדגימות לתוך תרמוצ'ילר ולהתחיל את תוכנית שעתוק הפוך.לקבלת preamplification תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, להוסיף 15 microliters של תערובת PCR לכל מדגם המכיל את התגובות גדיל הראשון, ואחריו מערבולת עדינה צנטריפוגה. לאחר מכן טען את הדגימות לתוך התרמוצ'יקלר והתחל את תוכנית PCR. לטיהור PCR, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של פסי טיהור דנ"א לשימוש חוזר לכל דגימה, וערבבו היטב על-ידי מערבולת.ואז במהירות לסובב את הדגימות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הנוזל תוך הימנעות יישוב של חרוזים. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הדגימות על מעמד מגנטי מתאים, מסירים בזהירות ומשליכים את העל-טבעי כאשר הפתרון ברור. לשטוף את חרוזים עם שתי שטיפות 30 שניות ב 200 microliters של טרי מוכן 80% אתנול לכל לשטוף.ולהשליך את האתנול הנותר לאחר הכביסה השנייה. כאשר חרוזים יש אוויר מיובש, להוסיף 11 microliters של מים ללא גרעין כדי לחמק יעד ה-DNA מן חרוזים, ואחריו מערבולת. ואז במהירות צנטריפוגה הדגימות, להחזיר את הדגימות לעמוד המגנטי עד הפתרון ברור ולהעביר 10 microliters של כל מדגם לצינור PCR חדש.cDNA מוגבר בהצלחה צריך להיות באורך מלא מעל 500 זוגות בסיס, להיות מועשר מ 1.5 עד שני זוגות בסיס קילו. יתר על כן, יש בדרך כלל 500 עד 600 זוג בסיס העשרה של cDNA נצפתה באינסולין RFP אחד בתוספת תאים, אשר עשוי לייצג את תעתיקי האינסולין. עם זאת, שברי cDNA ליד 100 זוגות בסיס הם dimers פריימר, אשר נגרמות בדרך כלל על ידי פריימרים מוגזמים אשר יש להסיר על ידי חזרה על שלב טיהור DNA.שברי cDNA בין 100 ל 500 זוגות בסיס בדרך כלל מייצגים cDNA מושפל, אשר נגרמת על ידי מצב תא רע או בעיות באזור, כגון זיהום RNase ויש לא לכלול. לאחר טיהור ספריות cDNA עבור רצף, cDNA הנע בין 250 ל 450 זוגות בסיס ניתן להשיג באמצעות תוספת של חטיפי טיהור DNA לסיבוב הראשון והשני של טיהור. לאחר טיהור חטיפי DNA, ציון איכות ריצוף צריך להיות גדול מ 30 במהלך הערכת איכות ריצוף.כדי להשיג תאים באיכות גבוהה לניתוחים במורד הזרם, תאים עם פחות מ -0.5 מיליון קריאות ממופות או עם פחות מ -4, 000 גנים שזוהו אינם נכללים, מה שמקל על אפיון קבוצות שונות של תאים וזיהוי גנים המתבטאים באופן הטרוגני בקבוצות שונות לאחר ניתוח רכיבים עיקריים וקיבוץ היררכי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעיין בלבלב במהירות לפני עיכול הקולגנס כדי למנוע איון על העיכול ולשמור על הסביבה החופשית RNase במהלך הליכים תא יחיד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיה ותרבות של איון כדי להקל על הדמיה של מבנה איון ולבחון תגובות תאיות וגירוי סמים.לאחר הפיתוח, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחקר הלבלב לחקור את המנגנונים של פיתוח שושלת איון והתחדשות, כמו גם התקדמות סוכרת ביונקים.

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של דיסקציה הלבלב הדמיה פרוסה וירטואלית, ועל כימות הבאים של כל ה-GFP-tagged בתאי בטא בלבלב כולו.

ב כימות באתרו של המיסה הלבלב בטא תא עכברים

מנסה לאמוד בתפקוד β-תאי מבחנה באמצעות עכבר איים מבודדים לנגרהנס הוא מרכיב חשוב במחקר של הפתופיזיולוגיה סוכרת ותרופות. בעוד רבים יישומים במורד הזרם זמינים, פרוטוקול זה מתאר במפורש המדידה של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים (cAMP) כפרמטר חיוני קביעת פונקצית β-תאים.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

בפרסום זה, אנו מתארים הליך מהיר ונוח לבידוד ותאי לבלב acinar העיקריים culturing מהלבלב העכברי. שיטה זו מהווה גישה רבת ערך כדי ללמוד את הפיסיולוגיה של תאי לבלב אקסוקרינית רגילים / untransformed העיקריים טריים.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים במייקרו-הסביבה של הלבלב עוברי, רקמת עכבר בילוד ומבוגרים, תוך התמקדות הבידוד של תאי mesenchymal. שיטה זו מאפשרת יצירת פרופיל של ביטוי גני התא והפרשת חלבון על מנת להבהיר את האותות החיצוניים המווסתים פיתוח לבלב, פונקציה, tumorigenesis.

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

תאים מטאפלסטיים של הלבלב הם מבשרי תאים ממאירים המעוררים גידולים בלבלב. עם זאת, בידוד תאי לבלב שלמים הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לדיסוציאציה של רקמת הלבלב. התאים יכולים לשמש לריצוף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) או לתרבית משותפת דו-ממדית או תלת-ממדית.

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרוסות לבלב אנושיות מתורמי איברים שנפטרו כדי לחקור את תפקוד התאים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. גישה חדשנית זו מאפשרת לחקור איים נורמליים ופגועים מבנית ואת יחסי הגומלין המורכבים בין תאים אנדוקריניים ואקסוקריניים.

יצירת פרוסות רקמת לבלב אנושית לחקר פיזיולוגיה אנדוקרינית ואקסוקרינית של הלבלב

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

למדו שיטה לבידוד תאים אנדוקריניים בלבלב עכברים וריצוף RNA תא בודד לניתוח תמסורתי מפורט. טכניקה זו מאפשרת חקר התפתחות תאי האי וההטרוגניות שלהם למחקר סוכרת.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

גלה סרטונים נוספים