Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

שיטה זו יכולה להיות לענות על שאלות מפתח בשדה איון הלבלב על התביור איון הלבלב, התבגרות, ואת ההתחדשות. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת איסוף של תאי איון לבלב יחידים עבור הדור של נתוני רצף RNA תא יחיד באיכות גבוהה. היישום של טכניקה זו להרחיב לכיוון הטיפול בסוכרת ומחלות אנדוקריניות אחרות הקשורות ללבלב באמצעות ניתוח תעתיק של תאים בודדים אנדוקריניים הלבלב על התנאים הפתולוגיים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו החדרת המחט לתוך צינור המרה הצר של הלבלב עבור זיקוק יכול להיות מסובך. ליום העוברי 17.5 עוברים. לאחר פתיחת חלל הבטן, השתמש פינצטה מרפק להעביר את הרקמה הקרביים לצלחת תחתית שחורה שישה סנטימטר המכיל PBS קר.

השתמש מלקחיים כדי לנתק את הלבלב מן הרקמה הקרבית. ומ מניחים את רקמת הלבלב בבקבוקון 20 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של תווי קולגן קרים. עבור יום לאחר הלידה אפס עד 15 עכברים, בזהירות לנתח את כל האונות של הלבלב לפני הצבת הרקמה לתוך הקולגן.

עבור יום לאחר הלידה 18 עד 60 עכברים, תחילה להסיר את xiphoid ולחלץ את המעי בצד ימין של חלל הבטן. לדחוף את האונות המדיאליות שמאלה ויימין של הכבד לכל צד כדי לחשוף את כיס המרה ואת צינור המרה המשותף. ומהדקים את התריסום עם זוג מלחצי כלי קטנים בעמדות העליונות והתחתונות כדי לאגף את האתר שבו צינור המרה נכנס לתריסריון.

לאחר מכן, לטעון מזרק 5 מיליליטר מצויד מחט 30 מד עם פתרון קולגן קר. ולהשתמש במיקרוסקופ כדי להכניס את קצה המחט לתוך כיס המרה. בזהירות ובזהירות לתפעל את המחט דרך צינור המרה המשותף.

ולדכא את הבוכנה כדי לפנק את הלבלב עם אחד עד חמישה מיליליטר של פתרון הקולגנס בהתאם לגודל העכבר. כאשר כל הפתרון כבר perfused, להשתמש במקלפים כדי להעביר מיד את הלבלב לבקבוקון 20 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פתרון קולגן קר טרי. כאשר כל רקמת הלבלב נאספה, מניחים את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, ואחריו שלוש עד חמש דקות של רעידות עדינות.

לאחר מכן לסנן את המוצר מתעכל דרך מסננת ניילון 0.25 מילימטר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר חדש. ולהשתמש מזרק 20 מיליליטר המכיל PBS קר קרח לשטוף ביסודיות את מסננת. עבור יום לאחר הלידה 18 עד 60 לבלב, צנטריפוגה מדגם מסונן resuspend הרקמה ב 30 מיליליטר של PBS קר.

ואז decant ההשעיה רקמה לתוך צלחת שחורה תחתונה שישה סנטימטר, ולהשתמש פיפטה מיקרוליטר 200 ומיקרוסקופ ניתוח כדי לבחור את איונים להעברה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל נפח קטן של PBS קר. ליום עוברי 17.5 לאחר יום לידה 15 הלבלב, צנטריפוגה רקמת הלבלב מסונן לשימוש חוזר את גלולה בתתבת טריפסין-EDTA עבור דגירה ארבע דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, בעדינות לנסות לדרג את גלולה במשך דקה אחת עם פיפטה 200 microliter, ואחריו תוספת של 0.5 פעמים את נפח סרום חזיר עוברי קר עם מערבולת עדינה כדי לעצור את העיכול.

לאחר מכן לאסוף את העיכול על ידי צנטריפוגה resuspend התאים ב 200 microliters של מאגר FACS בצינור FACS 5 מיליליטר למיון לפי ציטומטריה זרימה. עבור קטיף תא יחיד ותזה, aliquot מאגר תריס התא מוכן טרי לתוך שמונה צינורות PCR רצועה, ולהעביר תא בודד לתוך כל אחד. Vortex הדגימות כדי lyse התאים לשחרור של RNA, ואחריו צנטריפוגה במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס, ואחסון מיידי על קרח.

לתמלול הפוך, הדגירה את lysates במשך שלוש דקות ב 72 מעלות צלזיוס ואחריו דקה אחת על הקרח. בקצרה צנטריפוגה הדגימות במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס ולהוסיף 5.7 microliters של תערובת שעתוק הפוך לכל מדגם כדי להביא את הנפח הכולל ל 10 microliters עבור כל מדגם. לאחר מערבולת עדינה וצנטריפוגה, לטעון את הדגימות לתוך תרמוצ'ילר ולהתחיל את תוכנית שעתוק הפוך.

לקבלת preamplification תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, להוסיף 15 microliters של תערובת PCR לכל מדגם המכיל את התגובות גדיל הראשון, ואחריו מערבולת עדינה צנטריפוגה. לאחר מכן טען את הדגימות לתוך התרמוצ'יקלר והתחל את תוכנית PCR. לטיהור PCR, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של פסי טיהור דנ"א לשימוש חוזר לכל דגימה, וערבבו היטב על-ידי מערבולת.

ואז במהירות לסובב את הדגימות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הנוזל תוך הימנעות יישוב של חרוזים. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הדגימות על מעמד מגנטי מתאים, מסירים בזהירות ומשליכים את העל-טבעי כאשר הפתרון ברור. לשטוף את חרוזים עם שתי שטיפות 30 שניות ב 200 microliters של טרי מוכן 80% אתנול לכל לשטוף.

ולהשליך את האתנול הנותר לאחר הכביסה השנייה. כאשר חרוזים יש אוויר מיובש, להוסיף 11 microliters של מים ללא גרעין כדי לחמק יעד ה-DNA מן חרוזים, ואחריו מערבולת. ואז במהירות צנטריפוגה הדגימות, להחזיר את הדגימות לעמוד המגנטי עד הפתרון ברור ולהעביר 10 microliters של כל מדגם לצינור PCR חדש.

cDNA מוגבר בהצלחה צריך להיות באורך מלא מעל 500 זוגות בסיס, להיות מועשר מ 1.5 עד שני זוגות בסיס קילו. יתר על כן, יש בדרך כלל 500 עד 600 זוג בסיס העשרה של cDNA נצפתה באינסולין RFP אחד בתוספת תאים, אשר עשוי לייצג את תעתיקי האינסולין. עם זאת, שברי cDNA ליד 100 זוגות בסיס הם dimers פריימר, אשר נגרמות בדרך כלל על ידי פריימרים מוגזמים אשר יש להסיר על ידי חזרה על שלב טיהור DNA.

שברי cDNA בין 100 ל 500 זוגות בסיס בדרך כלל מייצגים cDNA מושפל, אשר נגרמת על ידי מצב תא רע או בעיות באזור, כגון זיהום RNase ויש לא לכלול. לאחר טיהור ספריות cDNA עבור רצף, cDNA הנע בין 250 ל 450 זוגות בסיס ניתן להשיג באמצעות תוספת של חטיפי טיהור DNA לסיבוב הראשון והשני של טיהור. לאחר טיהור חטיפי DNA, ציון איכות ריצוף צריך להיות גדול מ 30 במהלך הערכת איכות ריצוף.

כדי להשיג תאים באיכות גבוהה לניתוחים במורד הזרם, תאים עם פחות מ -0.5 מיליון קריאות ממופות או עם פחות מ -4, 000 גנים שזוהו אינם נכללים, מה שמקל על אפיון קבוצות שונות של תאים וזיהוי גנים המתבטאים באופן הטרוגני בקבוצות שונות לאחר ניתוח רכיבים עיקריים וקיבוץ היררכי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעיין בלבלב במהירות לפני עיכול הקולגנס כדי למנוע איון על העיכול ולשמור על הסביבה החופשית RNase במהלך הליכים תא יחיד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיה ותרבות של איון כדי להקל על הדמיה של מבנה איון ולבחון תגובות תאיות וגירוי סמים.

לאחר הפיתוח, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחקר הלבלב לחקור את המנגנונים של פיתוח שושלת איון והתחדשות, כמו גם התקדמות סוכרת ביונקים.