מזרק-להזרקה רשת אלקטרוניקה עבור יציב אלקטרופיזיולוגיה מכרסמים כרונית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד תהליכי הזדקנות באים לידי ביטוי במוח, כיצד המוח מתפתח וכיצד מחלות מוח נוצרות ומתקדמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאלקטרוניקת רשת אינה מעוררת תגובה חיסונית כרונית בגליוזיס לאחר השתלתה במוח ומאפשרת אינטגרציה חלקה עם הרקמה העצבית שמסביב. ידגימו את ההליך טאו ג'ואו, סטודנט לתואר שני בקבוצת ליבר, וג'ונג מין לי, פוסט-דוקטורנט בקבוצת ליבר.

כדי להתחיל בהליך, טען פרוסת סיליקון נקייה למאייד תרמי והתאדה 100 ננומטר ניקל. לאחר מכן, יש לסובב את הפוטו-רזיסט השלילי SU-8 2000.5 על הפרוסה במהירות של 400 סיבובים לדקה לעובי SU-8 משוער של 400 עד 500 ננומטר. טען את הוופל ליישור מסכה כדי לחשוף את ה-SU-8 עם מסיכת פוטוליתוגרפיה המתאימה לשכבת הרשת התחתונה SU-8.

חשיפה במינון קו I של 100 מילי-ג'אול לסנטימטר מרובע. אותם, טבלו את מגש הוופל של מפתח SU-8. ערבב בעדינות את התמיסה במשך שתי דקות, עד שתבנית הרשת ב-SU-8 התפתחה במלואה.

לאחר מכן, שטפו את הוופל במגש של אלכוהול איזופרופיל למשך דקה אחת וייבשו בפן. אופים קשה את הוופל על צלחת חמה בחום של 180 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, יש לסובב את ציפוי LOR 3A על הפרוסה ב-4,000 סיבובים לדקה לעובי משוער של 300 ננומטר.

ציפוי ספין S1805 חיובי לאור ב-4,000 סיבובים לדקה בעובי משוער של 500 ננומטר. לאחר מכן, טען את הוופל לתוך יישור מסכה כדי לחשוף את ה-S1805 עם מסכת פוטוליתוגרפיה שתיים המתאימות לחיבורי המתכת וכניסה, רפידות פלט. נחשף במינון קו H ב-40 מילי-ג'אול לסנטימטר מרובע, ולאחר מכן טבל את הפרוסה במגש של מפתח CD-26 Photoresist.

ערבב בעדינות את התמיסה למשך דקה אחת עד שתבנית חיבורי המתכת התפתחה במלואה. שוטפים את הוופל במגש מים נטולי יונים למשך דקה אחת ומייבשים אותו. לאחר מכן, התאדה תרמית שלושה ננומטר כרום ואחריו 80 ננומטר זהב.

טבלו את הוופל בכוס שטוחה של PG מסיר למשך כשלוש שעות, עד שהמתכת חתכה במלואה, והשאירו את המתכת רק באזורי החיבור והקלט הרצויים, כרית הפלט של אלקטרוניקת הרשת. חזור על ציפוי הסיבוב, הליתוגרפיה, האידוי וההרמה כדי להשאיר שלושה ננומטר של כרום ו-50 ננומטר פלטינה באזורי האלקטרודות. לאחר מכן, חזור על ציפוי הספין והפוטוליתוגרפיה של SU-8 כדי להגדיר את שכבת הרשת העליונה של SU-8.

טפל בפרוסה בפלזמת חמצן ב 50 וואט למשך דקה אחת. לאחר מכן, טבלו את הוופל בתחריט ניקל בתמיסה למשך כשלוש שעות, עד שאלקטרוניקת הרשת השתחררה לחלוטין מפרוסת הסיליקון. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להעביר את בדיקות הרשת האלקטרוניות המשוחררות מתחריט ניקל לכוס של 100 מיליליטר של מים נטולי יונים.

לאחר מכן, העבירו את האלקטרוניקה של הרשת לכוס טרייה של מים נטולי יונים לפחות שלוש פעמים כדי להבטיח שטיפה. כדי להעמיס את אלקטרוניקת הרשת למחט, הכנס מחט נימית זכוכית לכוס 100 מיליליטר של PBS המכילה את אלקטרוניקת הרשת. מקם את קצה המחט ליד הכניסה, רפידות הפלט של בדיקת אלקטרוניקה רשת ומשוך ידנית את המזרק כדי למשוך בדיקה אלקטרונית רשת לתוך המחט.

דחוף ומשוך את בוכנת המזרק כשהיא עדיין שקועה במי מלח כדי להתאים את מיקום אלקטרוניקת הרשת בתוך המחט. כדי להזריק אלקטרוניקה רשת למוח של עכבר, השתמש במקדחה דנטלית ובמסגרת סטריאוטקסית כדי לפתוח קרניוטומיה בקואורדינטות הרצויות על הגולגולת. פתח קרניוטומיה שנייה הרחק מאתר ההזרקה להכנסת בורג או חוט גרף מנירוסטה.

לאחר מכן, תקן מצע הידוק לגולגולת בעזרת מלט דנטלי. חתך ברוחב של כמילימטר אחד במצע משפר את אמינות שלב הקיפול בהמשך ההליך. לאחר מכן, התקן את מחזיק הפיפטה עם המחט המכילה אלקטרוניקה רשת לתוך המסגרת הסטריאוטקסית באמצעות קצה זווית ישרה clamp.

חבר את השקע הצדדי של מחזיק הפיפטה למזרק של חמישה מיליליטר המהודק במשאבת מזרק עם צינור נימי באורך 0.5 עד מטר. לאחר מכן, השתמשו במסגרת הסטריאוטקסית כדי למקם את קצה המחט במיקום ההתחלה הרצוי בתוך המוח. מקם את המצלמה כדי להציג את החלק העליון של בדיקת האלקטרוניקה של הרשת בתוך מחט הזכוכית.

התחל את הזרימה על ידי הגדרת משאבת המזרק למהירות נמוכה ולחיצה על התחל. הגדל לאט את קצב הזרימה אם בדיקת האלקטרוניקה של הרשת אינה נעה בתוך המחט. כאשר בדיקת האלקטרוניקה של הרשת מתחילה לנוע בתוך המחט, השתמש במסגרת הסטריאוטקסית כדי למשוך את המחט באותו קצב שבו מוזרקת בדיקת האלקטרוניקה של הרשת תוך שימוש במיקום המקורי המסומן של אלקטרוניקת רשת כמדריך.

המשיכו להזרים מי מלח ולהחזיר את המחט לאחור עד שהמחט יצאה מהגולגולת. לאחר מכן, עצור את הזרימה ממשאבת המזרק. בהליך זה, השתמש במסגרת הסטריאוטקסית כדי להנחות בזהירות את המחט למצע הידוק הכבלים השטוח והגמיש פנימה על פני הפער, תוך הזרמת התמיסה עם משאבת המזרק כדי ליצור רפיון בחיבורי האלקטרוניקה של הרשת.

ברגע שהמחט נמצאת מעל מצע ההידוק ומעבר לפער, המשך את הזרימה בקצב מהיר כדי להזריק את כניסת האלקטרוניקה של הרשת, רפידות פלט על מצע ההידוק. בעזרת פינצטה ופיפטה של מים נטולי יונים, כופפו את הכניסה, רפידות הפלט לזווית של 90 מעלות קרוב ככל האפשר לכניסה הראשונה, החוצה כרית. לאחר הכניסה, רפידות הפלט מיושרות ומקופלות ובזווית של 90 מעלות לגזע הרשת, יבש אותן במקומם עם אוויר דחוס זורם בעדינות.

חותכים את מצע ההידוק בקצה המיצר כ-0.5 עד מילימטר אחד מקצה הכניסה, רפידות הפלט. כמו כן, חתכו חלקים זרים של מצע ההידוק שיעכבו את ההחדרה למחבר ה-zif 32 ערוצים המותקן על ה-PCB. לאחר מכן, הכנס את רפידות הקלט, הפלט למחבר ה-zif על ה-PCB וסגור את התפס.

השתמש באלקטרוניקה למדידה כדי למדוד את העכבה בין התעלות לבורג ההארקה כדי לאשר ממשק מוצלח. אם ערכי העכבה גבוהים מדי, שחרר את מחבר ה-zif, כוונן את ההכנסה ובדוק שוב עד לאישור חיבור מוצלח. לאחר מכן, כסו את מחבר ה-zif ואלקטרוניקת הרשת החשופה עם מלט דנטלי להגנה.

הפוך את ה-PCB ברווח במצע וקבע את ה-PCB עם מלט על גולגולת העכבר. להקלטות הנעות בחופשיות, שחרר את העכבר מהמסנן לאחר הכנסת הקדם-מגבר PCB והארקת בורג הייחוס. הקלט למשך הזמן הרצוי באמצעות מערכת רכישת הנתונים בזמן שהעכבר מתנהג בחופשיות.

מוצגות כאן מפות חום השדה המקומיות המייצגות מבדיקות האלקטרוניקה של רשת 32 הערוצים שהוזרקו להיפוקמפוס העכבר ולקליפת המוח הסומטוסנסורית. הנתונים נרשמו בזמן שהעכבר חקר בחופשיות את הכלוב שלו חודשיים וארבעה חודשים לאחר ההזרקה. משרעת פוטנציאל השדה המקומי מקודדת בצבע בהתאם לסרגל הצבע מימין.

עקבות מסנן מעברים גבוהים, שחורים, המראים פעילות זינוק מונחים על הספקטרוגרמה עבור כל אחד מ-32 הערוצים. להלן הספייק המבודד לאחר מיון הנתונים המשורטטים. פעילות זינוק של יחידה בודדת זוהתה ב-26 מתוך 32 הערוצים, חודשיים לאחר ההזרקה וארבעה חודשים לאחר ההזרקה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את ממשק ה-I/O כדי לאשר חיבור חשמלי מוצלח לבדיקת האלקטרוניקה של הרשת. עכבת המדידה עוזרת לפתור את המקור של כל בעיה והיא קריטית לזיהוי בעיות בממשק או ייצור. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע היסטולוגיה על מנת לחקור את הסביבה התאית סביב כל אלקטרודה מוקלטת.

בניגוד לבדיקות מוח קונבנציונליות ונוקשות, ניתן להשאיר אלקטרוניקה רשת ברקמה במהלך ההיסטולוגיה, מה שמאפשר לתאם במדויק נתוני אלקטרופיזיולוגיה עם ניתוח אימונוהיסטוכימי.