Caenorhabditis נפה:, מכשיר low-tech ו מתודולוגיה לצורך מיון אורגניזמים רב תאיים קטנים
4 ביולי 2018
בפרוטוקול הנוכחי כולל מתודולוגיה מיון וניקוי של אוכלוסיות תואם גיל Caenorhabditis elegans. הוא משתמש פשוטה, זולה, והכלי בהזמנה אישית יעילה להשגת ניסיוני אוכלוסיה גדולה של נמטודות למחקר.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה מולקולרית, הכוללות בדיקות הדורשות שלבי התפתחות ספציפיים של C.elegans. כמו מבחנים של רמות ביטוי גנים וחלבונים. היתרון של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בחירה מדויקת ויעילה של מספר רב של C.elegans לפי גודל גוף, זה מקל על השימוש במבחנים שבדרך כלל יהיו מונעים זמן ועלות.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם לא יכולים לבצע את שלב התחלופה הקשתית או שהם לא שומרים על זרימת התמיסה במרכז הרשת. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכביסה וההיפוך. חלקם עשויים להתקשות לפרש ולדמיין תנועות ספציפיות בטקסט.
כדי להתחיל, רכשו שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל עם מכסים, ולאחר מכן השתמשו במקדחה מדורגת כדי להסיר את המרכז מהשפה הפנימית של המכסים. במידת הצורך, השתמש בקובץ, נייר זכוכית או כלי סיבובי כדי לנקות ולשייף את הקצוות והחלק העליון של המכסים. ואז חותכים דיסק של רשת ארוגה מונופילמנט ניילון, מעט קטנה יותר מקוטר המכסה.
מרקם את המשטחים העליונים של המכסים, ונקה אותם עם אתנול. לאחר שאפשרו למכסים להתייבש, מרחו דבק ציאנואקרילט על המשטחים העליונים של שני המכסים. לאחר מכן, הניחו את דיסק רשת המונופילמנט על מכסה מודבק אחד.
הפוך את המכסה השני על גבי הרשת ולחץ את המכסים בחוזקה זה לזה. לאחר ששכבת הדבק הראשונה מתייבשת, מרחו טבעת נדיבה של דבק ציאנואקרילט סביב הרווח החיצוני בין המכסים. לאחר מכן, סמן את המסנן בגודל נקבוביות הרשת המתאים לו.
ראשית, הניחו את המסננת מעל צינור חרוטי מסומן בנפח 50 מ"ל. לאחר מכן תמיסת מלח פיפטה דרך מרכז המסננת עד שנוצרת טיפה, מתלכדת ומטפטפת ממרכז המסנן. בעזרת מאגר M9, שטפו אוכלוסייה של C.elegans מצלחת מקדחה, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה פסטר מזכוכית כדי להעביר את המאגר המכיל את התולעים בצד העליון של רשת המונופילמנט.
פועל במרכז הרשת, שטוף את המסנן עם מאגר M9, חזור על שלב שטיפה זה לפי הצורך כדי להעביר את כל החיידקים והתולעים הקטנות יותר דרך הרשת. לאחר מכן, חבר צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל לחלק העליון של המסננת, התולעים שנאספו בעבר גדולות מהנקבוביות ברשת יפנו לחלק הפנימי של הצינור החדש. הסר את צינור הפסולת והפוך במהירות את המסננת.
לאחר מכן שטפו את הרשת עם מאגר M9 לתוך צינור האיסוף החדש. אפשר לתולעים שנאספו להתיישב כדקה אחת, ואז שאב בזהירות את תמיסת החיץ הרחק מכדור התולעים. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, יוצרים טיפות תולעים על צלחת NGM ומניחים להן להתייבש.
לבסוף, יש לשטוף את המסננת במי אוסמוזה הפוכה ואתנול. לאחר שהמסננת מתייבשת, יש לאחסן אותה בכלי נקי לשימוש עתידי. השלך את המסננת כאשר היא מפתחת מראה נפול.
בפרוטוקול זה נבנתה מסננת למיון וניקוי אוכלוסיות תואמות גיל של C.elegans. בעלי חיים בקבוצת הטיפול במסננת הפגינו דפוס תנועה נורמלי וספונטני לאורך כל הבגרות. בנוסף, קבוצות האיסוף והמסננת לא הראו הבדלים משמעותיים בקצב שאיבת הלוע.
בעלי חיים בקבוצת המסננת הגיבו גם באופן נורמלי לגירוי מכני קדמי או אחורי בהשוואה לכל קבוצות הטיפול בכל אחד מימי הבדיקה. לבסוף, הושוותה פוריותן של קבוצות הטיפול; השימוש במסננת לא השפיע באופן משמעותי על מספר הצאצאים בהשוואה לקבוצת הטיפול ב-PICK. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מעשר דקות.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפעול במרכז אזור הרשת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב ולהשתמש נכון במסננת Caenorhabditis כדי למיין תולעים לפי גודל גוף.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתווה מתודולוגיה למיון וניקוי של אוכלוסיות תואמות-גיל של Caenorhabditis elegans באמצעות כלי המיוצר באופן מיוחד. הוא מאפשר לחוקרים להשיג אוכלוסיית ניסוי גדולה באופן יעיל וכלכלי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- שלבים התפתחותיים ספציפיים של C.elegans הם קריטיים עבור בדיקות שונות.
- בדיקות עשויות לכלול רמות ביטוי של גנים וחלבונים.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות גוזלות זמן ויקרות.
- הדגמות חזותיות הן חיוניות להבנת המתודולוגיה.
מטרת המחקר
- לספק שיטה יעילה לברירת C.elegans לפי גודל הגוף.
- להקל על ביצוע בדיקות הדורשות שלבים התפתחותיים ספציפיים.
- לשפר את הנגישות עבור חוקרים שאינם בקיאים בטכניקה זו.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- כלי בהתאמה אישית למיון נמטודות.
- שלב הפיכה מקושת לשטיפה יעילה.
- שמירה על זרימת התמיסה במרכז הרשת.
- הדגמות חזותיות לסיוע בלמידה.
תוצאות עיקריות
- הושגה בחירה מדויקת של מספרים גדולים של C.elegans.
- השיטה מפחיתה את הזמן והעלות עבור בדיקות ביולוגיה מולקולרית.
- הבנה משופרת של תנועות ספציפיות באמצעות עזרים חזותיים.
- נגישות מוגברת עבור חוקרים שאינם מכירים את השיטה.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע שיטה מהימנה למיון של C.elegans.
- עזרים חזותיים חיוניים ללמידה יעילה של הטכניקה.
- מתודולוגיה זו יכולה להועיל באופן משמעותי למחקר בביולוגיה מולקולרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
במחקר ופיתוח בביו-פרמה, השגת אוכלוסיות מסונכרנות של אורגניזמי מודל כגון C. elegans היא קריטית לבדיקות סריקה פנוטיפית ותיקוף מטרות בעלות הדירות. נפה ה-Caenorhabditis מאפשרת מיון מהיר וכלכלי לפי גודל הגוף, ובכך מפחיתה את נטל הזמן והמשאבים בזרימות עבודה של גילוי מוקדם. הדבר תומך באמון חזוי במוכנות הבדיקה ובמיון תיק הפיתוח (portfolio triage) על ידי הבטחת קלטים ביולוגיים אחידים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות אוכלוסיות תולעים בעלות גיל תואם לקבלת תוצאות פנוטיפיות עקביות.
- ערך תפעולי: מספק שיטה בעלות נמוכה וניתנת להרחבה ליצירת קבוצות מסונכרנות ללא צורך בציוד מיוחד.
- ערך חיזוי: מפחית שונות ביולוגית בבדיקות, ובכך משפר את מהימנות הנתונים לצורך הפחתת סיכונים ביעדים טיפוליים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות בהמשך, באמצעות בידוד של שלבי התפתחות ספציפיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת התולעים, המשפרת את השחזוריות בין פלטות בדיקה ומסעות סריקה.
- יכולת הרחבה: תמיכה בצרכים של סריקה עם תפוקה גבוהה באמצעות עיבוד מהיר של אוכלוסיות תולעים גדולות בתוך פחות מעשר דקות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: שומרת על נאמנות פנוטיפית משלב הגילוי ועד לאישוש פרה-קליני, על ידי שימור מדדי תנועתיות, תגובה למעמ চাপ ופוריות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת הערכה מהימנה של רמות ביטוי גנים וחלבונים באוכלוסיות מסונכרנות, ובכך תומכת בהתאמה של סמנים ביולוגיים.
- קידום מותאם סיכונים: מסייעת בקבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי אספקת קלטים עקביים של מערכת המודל לצורך פרופיל יעילות ורעילות.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
נפת ה-Caenorhabditis מתאימה לרצף הגילוי מהשלב של גילוי ראשוני ועד לזיהוי מוביל (Lead Identification), והיא תומכת באופן ספציפי במוכנות של הבדיקות ובשחזוריות של הסריקה עבור סריקות פנוטיפיות המבוססות על C. elegans.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי אספקת אוכלוסיות תולעים אחידות לצורך הבהרת מסלולים וסריקה תפקודית.
- סריקה: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות מיון מבוסס גודל, מה שמבטיח גודל ושלב התפתחות עקביים של התולעים להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר פלטים כמותיים מופרדים לפי גודל, המאפשרים לצומיות להשוות תנאים בין שלבים התפתחותיים שונים עם רעש מופחת.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי שמירה על סממני בריאות מרכזיים (ניידות, תגובת תסיס/סטרס, פוריות) לאחר המיון, ובכך תומך בתקפות של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר בארגון: משמש ככלי רב-פעמי עם תחזוקה נמוכה עבור צוותים ופרויקטים שונים, ומקדם סטנדרטיזציה בטיפול באורגניזם מודל.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית בבדיקות פנוטיפיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של תהליכי הכנת תולעים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התקדמות (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על נתונים אמינים ממערכת מודל ספציפית לשלב.
שיקולי יישום
- נדרשות מיומנויות מעבדה בסיסיות להרכבת נפה ולטיפול בתמיסות.
- נדרשת גישה למבחנות קוניות, רשת ניילון, דבק ציאנואקרילט ובחרי תמיסות סטנדרטיים (M9, סליין).
- נדרשת הכשרה בין-צוותית על תפעול נכון הממוקד ברשת ועל טכניקת ההפיכה כדי להבטיח עקביות.
- שיקולי התאמה כוללים בחירת גודל נקבי הרשת עבור שלבי התולעת המיועדים ותאימות עם מערכות שונות של NGM או תרביות נוזליות.
- מגבלות מעשיות כוללות שקיעה אפשרית של הרשת עם הזמן, מה שדורש החלפה תקופתית כדי לשמור על דיוק המיון.
