Name: הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למדו את שיטת FLIPS להגברה וריצוף של פרווירוסי HIV-1 באורך מלא מתאים בודד. טכניקת PCR זו מאפשרת לזהות פרווירוסים שלמים בעלי כושר שכפול ולחקור את מאגר ה-HIV הנסתר ביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה דלייני איידס המחקר של הארגון (האתגר) כדי למצוא תרופה (1U19AI096109 ו- 1UM1AI126611-01); amfAR קונסורציום מחקר ב- HIV מיגור (ARCHE) מענק מחקר שיתופי של הקרן לחקר האיידס (amfAR 108074-50-RGRL); מרכז אוסטרלי HIV ומחקר וירולוגיה הפטיטיס (ACH2); מרכז קליפורניה בסן פרנסיסקו-GIVI לחקר האיידס (P30 AI027763); הבריאות הלאומי האוסטרלי ואת מועצת המחקר הרפואי (AAP1061681). ברצוננו להודות ד ר ג'ואי לאי גנומיקה מנהל מתקן במכון Westmead למחקר רפואי את הכשרתו ספריית הכנה ושימוש המיומנות שלו, המרכז Ramaciotti גנומיקה (אוניברסיטת של ניו סאות וויילס, סידני, אוסטרליה) לביצוע רצף. אנו להכיר בהכרת המשתתפים שתרמה דגימות במחקר זה.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

סלטות וזמינותו היא שיטה תפוקה גבוהה ויעילה עבור הגברה, רצף יחיד, ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא. גורמים רבים, צעדים קריטיים בפרוטוקול המשפיעים בהתאם למספר ואיכות של הרצף שהושג זוהו. ראשית, מספר התאים ותדירות זיהום ב- HIV-1 של האוכלוסייה תא להשפיע על המספר של הפרו-וירוס מוגבר. לדוגמה, בפרסום הקודם, רצפים רבים חצי לערך, התקבלו מספר זהה של תמים CD4+ T תאים בהשוואה אפקטור זיכרון CD4+ T תאים. זאת משום תמים תאים בדרך כלל יש תדירות זיהום נמוכה יותר מאשר תאי זיכרון אפקטור2. שנית, פירוק תאים עדיפה על עמודה מבוססי החילוץ שיטות לקבלת דנ א גנומי כפי אין סיכון של איבוד DNA בתהליך החילוץ. לבסוף, כמו כל assay מבוססי ה-PCR, מניעת זיהום הוא קריטי. אזורים נקיים מופרדים צריך להיקרא להכנת תערובות מאסטר, טיפול ה-DNA גנומי, הוספת פקדים חיובית, טיהור DNA כימות ואת ספריית הכנה. זה חשוב במיוחד עבור מבחני עותק יחיד כמו זה המוצג כאן.
מימוש וזמינותו סלטות לכלול תחילה להפעיל פקד חיוביים כגון pNL4-3 פלסמידים ולא משתתף דגימות. זה יאפשר לכל מראש לפתרון בעיות לשימוש של תאים חיוביים HIV-1, כפי הרצפים שהתקבלו ניתן להשוות רצפים הפניה זמין עבור פלסמידים אלה. בעת שימוש תאים חיוביים HIV-1, חשוב לשקול את סוג המשנה של HIV-1 (primers המיועדות סלטות הספציפיים סוג B) ותדירות זיהום של האוכלוסייה תא אם מעט לא הפרו-וירוס הם מוגבר. רצפים פריימר יכול להיות שונה/מחדש כדי להתאים את תתי סוגים אחרים. בנוסף, טוב המכיל פקד חיובי צריכים להיכלל בכל PCR שבוצעה.
סלטות יש להתגבר על המגבלות של מבחני רצף קודמות, לרבות SPS. באמצעות הגברה ורצף ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא, סלטות ניתן לקבוע את כשירות-השכפול פוטנציאלי של הפרו-וירוס HIV-1. זה לא היה אפשרי באמצעות SPS, אשר וסודרו רק אזורים תת-גנומית ונבחר לכן רצפי עם אתרי קישור פריימר ללא פגע. יתר על כן, סלטות מתגבר על המגבלות הקשורות ניצול מרובים הגברה, רצף תחל כפי הועסק על ידי הקודם רצף באורך מלא מבחני1,4. דרך שני סיבובים של PCR פילוח אזורי HIV-1 LTR בשילוב עם הגדרות, סלטות מקטין את מספר ואת המורכבות של צבעי יסוד הנדרש. הטלות ולכן פחות רגישים ההשלכות של פריימר אי-התאמות, כלומר זיהוי שגוי של הפרו-וירוס פגומה וחוסר יכולת להגביר קצת הפרו-וירוס בתוך אוכלוסיה. פרוטוקול סלטות גם יעיל יותר ומאפשר תפוקה גבוהה יותר של רצף מאשר שיטות קודמות.
אין ספק, סלטות מספק יתרונות על פני שיטות קיימות אשר קובעים את ההרכב הגנטי של HIV-1 הפרו-וירוס.... עם זאת, חשוב להכיר את המגבלות של סלטות. ראשית, וזמינותו סלטות לא פותחה ככלי למדידת גודל המאגר HIV-1 סמויה, כמו ניתוח כדי לקבוע אם סלטות מגביר את כל provirus HIV-1 נוכח אוכלוסיה תא שלא הושלמו. סלטות שימושית במקום ביצוע השוואות היחסי של ההרכב של המאגר בין אוכלוסיות תאים שונים2. שנית, השכפול-כשירות של שלם הפרו-וירוס HIV-1 לא ניתן לקבוע בוודאות. בלי ניתוחים ויוו , כגון אלה המבוצעות על ידי הו. et al. 4. שלישית, סלטות לא נועד לקבוע האתר אינטגרציה של הפרו-וירוס HIV-1.
הבדלים קלים בפרוטוקול סלטות באפשרותך להגביר את היישום שלה. לדוגמה, שינויים פריימר רצפים יכול לאפשר שונים ובסוגי HIV-1 מרובים להיות מוגבר ולא רציף. רצף של פלזמה HIV-1 virions אפשרי באמצעות התוספת של סינתזה cDNA לפני ה-PCR מקוננים. ניצול עתידי של מולקולה בודדת רצף שיטות יבטל את הצורך דה נובו הרכבה.
רצף גנטי של הפרו-וירוס HIV-1 משולב הגבירה את ההבנה שלנו של המאגר HIV-1 סמויה. סלטות היא כלי חשוב עבור מחקרים עתידיים שחקרתי את הרכב ופיזור של המאגר סמויה. עם זאת, היישום של סלטות באפשרותך להרחיב מעבר המאגר. מחקרים עתידיים עשויים לנצל הטלות כדי לקבוע מטרות מסוים לטכנולוגיה CRISPR-Cas, או לסייע בזיהוי של קידוד ואזורים ללא קידוד ההופכים את הווירוס קשובים יותר השהיה היפוך סוכנים. רקומבינציה ויראלי כפי שניתן להבין טוב יותר על ידי הסתכלות על האתרים צומת של מחיקות פנימיים גדולים.

אפיון גנטי של המאגר HIV-1 סמויה, אשר נמשכת אצל אנשים על טיפול תרופתי לטווח ארוך (אמנות), היה חיוני להבנה כי הרוב המכריע של הפרו-וירוס משולבת הם פגומים, פסול השכפול1 , 2. במהלך התהליך של שעתוק במהופך, שגיאות הציג לתוך הרצף proviral משולב. כמה מנגנונים ליצור רצפים proviral פגומים כוללים את מועדת לטעויות האנזים רוורס טרנסקריפטאז HIV-13, תבנית מיתוג4, ו/או APOBEC-induced hypermutation5,6. שני מחקרים שנערכו לאחרונה מצאו כי כ- 5% של הפרו-וירוס HIV-1 מבודד מאנשים על אמנות לטווח ארוך גנטית לא נפגעו, או פוטנציאל שכפול-מוסמך, עשוי לתרום הריבאונד מהירה ב- HIV-1 רמות פלזמה עם הפסקת לאמנות 1 , 2 , 7. הקודם מחקרים זיהו כי שכפול-המוסמכת הפרו-וירוס HIV-1 מתעקש ותמימה. ואת נח זיכרון CD4+ T תא קבוצות משנה (כולל המרכזי, המעבר בתאי T הזיכרון אפקטור), המציין את החשיבות מיקוד אלה תאים בעתיד מיגור אסטרטגיות2,8,9.
בתחילת תובנות בחלוקת, דינמיקה ותחזוקה של המאגר HIV-1 החבויים הושגו דרך הניצול של שיטות רצף יחיד-proviral (SPS) המאפיינות אזורים תת-גנומית של הגנום HIV-110 גנטית ,11,12,13. SPS הוא כלי רב-תכליתי, היכולת רצף provirus יחיד של HIV-1 מ בתוך תא בודד נגועים. SPS זאת, אין אפשרות לקבוע את השכפול-כשירות של הפרו-וירוס, מאז זה רק רצף sub-גנומית אזורים ומתגעגע הפרו-וירוס המכילים מחיקות גדולות בתוך אתרי קישור פריימר. מחקר קודם הראה SPS מגזים בהערכת גודל המאגר שכפול-המוסמכת על ידי 13 - ל 17 פי דרך באופן סלקטיבי רצף שלם אזורים תת-גנומית2.
להתייחס למגבלות של SPS, הו. et al. 4 וברונר. et al. 1 פיתח מבחני לרצף ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא. פעולה זו מותרת התדירות של שלמים גנטית, ולא פוטנציאל שכפול-המוסמכים, HIV-1 הפרו-וירוס אצל אנשים על אמנות לטווח ארוך נקבע. אלה מבחני מוגבר, רציף (via סנגר רצף) אזורים תת-גנומית שהורכבו ואז להשיג provirus HIV-1 של רצף (שלמים או פגום). שלוש מגבלות של גישה זו הם: 1) השימוש תחל רצף מרובים מגביר את הסיכון בשוגג היכרות עם פגמים לתוך הרצף proviral, 2) פריימר אי-התאמות עשוי למנוע הגברה של הפרו-וירוס מסוים, ולעתים קרובות 3) לא ניתן לפתור כל רצף proviral עקב טכני השיטות האלה.
כדי להתגבר על המגבלות של קיימים מבחני proviral רצף באורך מלא של HIV-1, פיתחנו Full -Length אניוהקבוצתית Proviral Sequencing (היפוך) וזמינותו. סלטות הוא רצף הדור הבא (הגדרות)-assay מבוסס אשר מגביר את רצף ליד באורך מלא (שלמים או פגומים) HIV-1 הפרו-וירוס באופן תפוקה גבוהה ויעילה. סלטות מספק יתרונות מבחני הקודם, כיוון שהוא מגביל את מספר תחל מנוצל; לכן, זה מקטין את הסיכוי פריימר אי-התאמות, אשר עשוי להגביל את אוכלוסיית הפרו-וירוס שנתפסו או שלא במתכוון להציג פגמים לתוך רצף ויראלי. סלטות הוא גם פחות טכנית מאתגר יותר מבחני הקודם והיא כוללת 6 צעדים עיקריים: תאים 1) פירוק של נגוע ב- HIV-1, 2) הגברה של יחיד הפרו-וירוס HIV-1 באמצעות PCR מקוננים בנטילת הגבלת דילול באמצעות תחל ספציפי עבור שנשמרת מאוד HIV-1 5' ואזור 3' U5 LTR (איור 1 א'), 3) טיהור, כימות של מוצרים מוגבר, 4) הכנת ספריה הפרו-וירוס מוגבר על המיתרים, 5) הגדרות, ו-6) דה נובו הרכבה של הפרו-וירוס ברצף כדי לקבל את contigs של כל אחד provirus בודדים.
רצפים שנוצרו על-ידי היפוך יכול לעבור השלילה מחמירים כדי לזהות את אלה אשר ומתפקד פוטנציאל שכפול-כשיר מבחינה גנטית (איור 1C)2. הפרו-וירוס גנטית ללא פגע חסרי כל פגמים ידועה והתוצאה בדור של provirus פסול השכפול. פגמים אלה כוללים: היפוך רצפים, מחיקות פנימי גדול, עצירה hypermutation/ברישול codons, frameshifts או מוטציות בגן 5' אריזה אות או מרכזי אחוי התורם (MSD).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> איור 1: השלבים הקריטיים וזמינותו רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך). (א) ה-HIV-1 DNA הגנום עם אתרי מחייב פריימר 5' 3' U5 LTR ואזורים המשמשים סלטות כדי להגביר ליד באורך מלא (פגום ולא תקין) HIV-1 הפרו-וירוס באמצעות PCR מקוננים. הפריסה (B) של צלחת PCR 96-ובכן, המכיל מדגם 80 וולס (20 בארות כל דילול), בארות בקרה שלילית 4 ושליטה חיובי 1. טוב. (ג) תהליך של אלימינציה המשמש לזיהוי שלמים גנטית, ולא פוטנציאל שכפול-המוסמכים, HIV-1 הפרו-וירוס. דמות זו שונתה מ. Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>מדולל ל-5 מ"מ עבור תמיסת תחליף PCR מקוננת</td></tr><tr><td>Nonidet P 40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>96 באר thermocycler</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל 96 בארות thermocycler</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA פולימראז נאמנות גבוהה</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x מאגר נאמנות גבוהה [600 מ"מ Tris-SO4 (pH 8.9), 180 מ"מ (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"מ MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>תערובת נוקלאוטידים PCR, 10 מ"מ</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים</td><td></td><td></td> PCR1 ו-PCR2 <td>מומלחים. יש לדלל ל-(100 ומיקרו; M) עם צלחת PCR H2O</td></tr><tr><td>96 באר, חצי חצאית, פינה חד פעמית, שקוף</td><td>axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' אטמי דבק</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>נדרש לאיטום 96 לוחות PCR באר</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 שיבוט מולקולרי זיהומי (pNL4-3)</td><td>המגיב הבא הושג באמצעות תוכנית ריאגנטים לאיידס של NIH, החטיבה לאיידס, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 שיבוט מולקולרי זיהומי (pNL4-3) מד"ר מלקולם מרטין (Cat# 114).</td><td></td><td>מדולל ל-105 עותקים/מ"ל ומשמש כספינר צלחת PCR בקרה חיובית</td></tr><tr><td>או צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחנית E-GEL 48 1% Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Precast 1% agarose gels (שני ג'לים משמשים לכל צלחת 96 בארות). ניתן להחליף כל ג'ל אגרוז 1%. מכיל אתידיום ברומיד.</td></tr><tr><td>DirectLoad סמן DNA רחב טווח</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>ניתן להחליף כל סולם עם טווח של עד 10 kb</td></tr><tr><td>ניתן להחליף מכשיר Mother E-Base</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>נדרש להפעלת ג'ל אגרוז טרומי 48 באר 1% ג'ל</td></tr><tr><td>Doc EZ מערכת תיעוד ג'ל</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>ניתן להשתמש בכל מערכת הדמיה לאתידיום ברומיד המכילה ג'ל אגרוז ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>באיטום</td> <td>חום מתקלף PlateMaxAxygen</td><td>HS-200</td><td>סרט איטום חום לאחסון לטווח ארוך</td></tr><tr><td>96 באר 0.8 מ"ל צלחת אחסון</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>0.8 מ"ל 96 באר צלחת נדרשת לטיהור PCR מבוסס חרוזים מגנטיים</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (ערכת טיהור PCR)</td> <td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>ערכת טיהור PCR מבוססת חרוזים מגנטיים. ניתן להחליף ערכות טיהור PCR אחרות כאן (למשל ערכת טיהור PCR מהירה של QIAquick (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי, טהור. 200 הוכחה, לביולוגיה מולקולרית</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>שייקר</td><td></td><td></td> מיקרופלייט <td>מאגר אופציונלי</td></tr><tr><td>EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>מאגר אלוטיון</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת Quant-iT PicoGreen dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>כתם מבוסס פלואורסצנטי למדידת ריכוז dsDNA</td></tr><tr><td>קורא</td><td></td><td></td><td></td>מיקרופלייט</tr><tr><td>Nextera XT ערכת הכנת ספריית DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>צלחות PCR קשות 96 בארות</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>נדרש עבור ערכת הכנת ספריית DNA Nextera XT</td></tr><tr><td>ערכת כימות ספרייה - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>ניתן להחליף ערכות כימות ספריות אחרות (למשל ערכת Lo-Rox לכימות ספריית DNA של JetSeq (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>מערכת אלקטרופורזה אוטומטית. שימוש בשילוב עם ערכת DNA עם רגישות</td></tr><tr><td>גבוהה ערכת DNA עם רגישות גבוהה</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת Illumina MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס hiv-1 עבור הדור הבא רצפי

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

וזמינותו Full-Length בודדים Proviral רצף (היפוך) היא שיטה יעילה, תפוקה גבוהה שנועדה להגביר את רצף יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה), HIV-1 הפרו-וירוס. סלטות מאפשר קביעת ההרכב הגנטי של HIV-1 משולב בתוך אוכלוסיה התא. דרך זיהוי פגמים בתוך רצפים proviral HIV-1 המתעוררות במהלך שעתוק במהופך, כגון מחיקות פנימי גדול, עצירה ברישול codons/hypermutation frameshift מוטציות, מוטציות/מחיקות ב- cis מתנהגים הרכיבים הנדרשים עבור virion ההבשלה, סלטות ניתן לזהות משולב הפרו-וירוס מסוגל שכפול. וזמינותו סלטות יכול להיות מנוצל כדי לזהות הפרו-וירוס HIV-1 חסר פגמים אלה, ולכן הם פוטנציאל שכפול-מוסמך. פרוטוקול סלטות כרוך: פירוק של תאים נגועים ב- HIV-1, מקונן PCR של יד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא (באמצעות תחל ממוקד 5 HIV-1' ו 3' משמאל לימין), טיהור DNA, כימות, ספריית הכנה עבור הדור הבא רצף (הגדרות), הגדרות, דה נובו הרכבה של proviral contigs, השלילה פשוטה לזיהוי שכפול-המוסמכת הפרו-וירוס. סלטות מספק יתרונות על פני שיטות מסורתיות שנועדה רצף משולב הפרו-וירוס HIV-1, כגון רצף יחיד-proviral. סלטות מגביר את רצף ליד הפרו-וירוס באורך מלא הפעלת שכפול כשירות להיות נחוש, ואתה משתמש גם פחות תחל ההגברה מונע את ההשלכות של אי התאמות פריימר. סלטות הוא כלי שימושי להבנת הנוף גנטי של משולב HIV-1 הפרו-וירוס, בעיקר בתוך המאגר סמויה, עם זאת, ניצול שלו יכול להאריך יישום שבו נדרש ההרכב הגנטי של HIV-1 משולב.

וזמינותו סלטות מגביר, רצף יחיד, ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא. הפרוטוקול כרוך 6 צעדים כדי להשיג ליד רצפים proviral באורך מלא. השלבים הבאים כוללים: פירוק של תאים, PCR מקוננים באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס, טיהור DNA, כימות, קביעת רצף ספריית הכנה, המיתרים, נגוע, דה נובו הרכבה של וסודרו הפרו-וירוס. בסוף כל שלב יכול להיחשב מחסום שבו האיכות של המוצר (למשל הוגדל DNA, DNA מטוהרים, רצף ספריה או רצף) יכול להיות מוערך לפני השלב הבא. סקירה כללית של המבדק הופיעה בסוף כל שלב, התוצאות הצפויות המותווה להלן.
בעקבות PCR מקוננים, מוצרים מוגבר מופעלים על 1% agarose ג'ל (איור 3). איכות הראשונית ה-PCR יכול להיקבע על ידי ביקורת הפקדים שליליים או חיוביים. בקרה שלילית בארות המכיל מוצר מוגבר להצביע על זיהום ולציין בארות בקרה חיובית חסר של מוצר מוגבר הגברה לא מספיקות. בשלב הבא, בארות המכיל מוצר מוגבר שנבחרו עבור רצף. כדי להימנע בארות המכילים תערובות של הפרו-וירוס מוגבר מרובים, רק בארות המכיל מוצר מוגבר רצים מובילים דילול נחשבים עבור רצף. על-פי התפלגות פואסון, דילול מובילים נמצא כאשר 30% של בארות הן חיוביות עבור מוצר מוגבר. בשלב זה דילול, יש 80% סיכוי הבארות הללו מכילים provirus מוגבר של יחיד. בנוסף, ניתן לאבחן בארות המכיל הפרו-וירוס מוגבר מרובים באורכים שונים בשלב זה כמו להקות מרובים יופיעו על הג'ל. לא צריך להיות נבחרה הבארות הללו עבור קביעת רצף (איור 3).
בעקבות טיהור של מוגבר הפרו-וירוס שנבחר עבור רצף, כימות מבטיחה שום דנ א proviral אובדים במהלך שלב טיהור. אם ריכוז הדנ א provirus מוגבר &lt; 0.2 ng/µL, המדגם הנותרים ב PCR2 הצלחת יכול להיטהר. מחסום דומה מתרחש בעקבות הכנה הספרייה, שבו כל ספריה בודדים לכמת. פעולה זו מבטיחה הפרו-וירוס בודדים יש כבר דוקטור מפוצלים, מתויג, מוגבר לפני רצף. ספריות proviral בודדים הם איחדו בכמויות equimolar כדי ריכוז ספריית הסופי של 4 nM (או כפי שמוגדר על ידי המתווכת רצף). אם הריכוז של ספריית proviral בודדים הוא נמוך מדי, זה יכול ייכללו ממאגר ספריית רצף או הספרייה הפרט מוכן שוב. בדיקה אחרונה של הריכוז של הספרייה במאגר מבוצע לפני רצף יחד עם המאשרת את אורך קטע הממוצע.
פעולות בקרת איכות לפני השלב הרכבה דה נובו מבטיחה את האיכות הקריאות נהגו להרכיב את contig proviral הסופי. השלבים הבאים כוללים: הסרה של מתאם רצפים, קיצוץ של 5' ו- 3' נוקלאוטידים, מגבלה האיכות המחמירים, ועל התעלמות קריאות קצרות. CLC גנומיקה עבודה, שעליו מונחים יכול לספק דוחות בקרת איכות יכול לשמש לפני כדי להעריך את איכות הראשונית של קריאות, מדריך זמירה הגדרות, ולאחר מכן לאחר כדי לקבוע אם הגזם היה מספיק כדי להסיר אזורים באיכות נמוכה. בנוסף, להרכבה דה נובו , איכות contigs התאספו יכול להיות מוערך על עומק מספיק (&gt; 1000 X), שויון של כיסוי (איור 4A). ניתן גם לזהות אוכלוסיות מעורבות בשלב זה. תערובות של הפרו-וירוס באורך מלא (~ 9 kb) מרובות מזוהים באמצעות הנוכחות של SNPs מרובים עם תדירות של יותר מ-40%, ואילו תערובות של קצר (מכיל פעולת מחיקה פנימי גדול), הפרו-וירוס באורך מלא יכול להיות מזוהה על ידי לא אחיד לקרוא סיקור בעקבות מיפוי הפניה באורך מלא מהמשתתף אותו (איור 4B).
בהתאם ליישום, היישור הסופי, ניתן לאבחן באמצעות כלים כגון ggtree זמינים כחבילה "r: A שפה וסביבה עבור מחשוב סטטיסטי"27. במחקר שנערך לאחרונה, סלטות היה מנוצל כדי רצף HIV-1 הפרו-וירוס מהזיכרון תמימה, המרכזי, המעבר, ו אפקטור CD4+ T תאים מבודדים מאנשים על אמנות לטווח ארוך, במטרה לזהות אם קבוצות משנה לתא מסוים הראה גבוה יותר הפרופורציות של שלמים גנטית ולא כשיר פוטנציאל שכפול HIV-12. . הנה, ייצוג חזותי של הרצף מבודד משתתף אחד של מחקר זה (משתתפת 2026) מוצג (איור 5). המשתתף, הרוב (97%) של רצפי היו פגומים, עם רצפי שלמים שנמצאו אפקטור וזיכרון המעבר CD4+ T תאים. כלי ויזואליזציה זה שימושי עבור מציג את מספר רצפי עם מחיקות פנימי גדול ומיקומם הגנום. זה יכול להיות מוערת בהמשך כדי לציין רצפים עם עצירה ברישול codons, frameshift מוטציות מחיקות/מוטציות MSD האתר ו/או אריזה אות.
אחד היישומים של וזמינותו סלטות הוא הזיהוי של שלמים גנטית ולא כשיר פוטנציאל שכפול HIV-1 הפרו-וירוס. במחקר שנערך לאחרונה של רצפי 531 מבודד CD4+ T תאים 6 המשתתפים על אמנות לטווח ארוך, 26 (5%) שלמים גנטית HIV-1 הפרו-וירוס היו מזוהה2. הפרו-וירוס נותרת פגומה כלל אלה עם היפוך רצפים (6%), מחיקות פנימי גדול (68 אחוז), עצירה ברישול codons/hypermutation (9%), frameshift מוטציות (1%) פגמים אריזה האות ו/או מוטציות באתר MSD (11%) .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> איור 2: סקירה של זרימת עבודה עבור דה נובו הרכבה של הפרו-וירוס HIV-1. השלבים העיקריים בתהליך העבודה כוללים: 1) רצף לקרוא בקרת איכות, 2) מיזוג זוגות חופפים, 3) דה נובו הרכבה ולאחר 4) מיפוי בניין הקונצנזוס היו בצבע אדום, כחול, ירוק וכתום, בהתאמה. דמות זו שונתה מ. Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> איור 3: דוגמה ג'ל agarose של ה-PCR מוגבר הפרו-וירוס HIV-1- וולס 1, 2, 3, 6, 9 ו-10 מכילים מוגבר הפרו-וירוס HIV-1. 10 טוב מכיל את provirus עם מחיקה פנימי גדול, 2 טוב מכיל הגברה משותף של שני הפרו-וירוס HIV-1 באורכים שונים (תערובת) ומכיל 12 ובכן בקרה חיובית. הערה האחוזים של בארות המכיל מוצר מוגבר הוא 60%, הנמצא מעל האחוז הנדרש כדי לבודד תבניות יחיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> איור 4: דוגמה פלט של מיפוי קריאה. דוגמה (A) הוכחת אפילו כיסוי עקב ההגברה של provirus HIV-1 באורך מלא יחיד. בעקבות הרכבה דה נובו , ימופו כל קורא contig התאספו כדי לייצר רצף קונצנזוס. פלטפורמת תוכנה מאפשר את קריאות ממופה שייבדקו מספיק ואפילו כיסוי. דוגמה (B) הוכחת שיתוף הגברה של שני הפרו-וירוס HIV-1 באורכים שונים (תערובת). כדי לקבוע תערובות, קריאות הן למפות רצף ההתייחסות באורך מלא (~ 9 kb) מהמשתתף אותו וקרא מיפוי בדק. הנוכחות של כיסוי לא אחיד מציין תערובת. איור זה מתרבה באישור Qiagen14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> איור 5: דוגמה ויזואליזציה של HIV-1 רצפים proviral מבודד CD4+ T תא קבוצות משנה של הפרט על אמנות לטווח ארוך. בודדים HIV-1 רצפים proviral מיוצגים על ידי קווים אופקיים. דמות זו שונתה מ. Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך) מספקת שיטה יעילה, תפוקה גבוהה עבור הגברה רצף של יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס והיא מאפשרת קביעה של הפוטנציאל שלהם שכפול-כשירות. סלטות מתגבר על המגבלות של מבחני הקודם שנועדה רצף המאגר HIV-1 סמויה.

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום HIV כגון קביעת ההרכב הגנטי של proviruses HIV וסוגי תאים שונים. במיוחד זיהוי אלה שהם שלמים גנטית ופוטנציאל שכפול מוסמך. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לנו להגביר כמעט באורך מלא HIV proviruses מתאים נגועים ב- HIV יחיד ולאחר מכן רצף אלה על ידי רצף הדור הבא.כדי להתחיל, הכן את כל המאגרים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. להשיג גלולת תא ולהוסיף מאה microliters של מאגר תזה למיליון תאים. מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.Lyse התאים על ידי דגירה במחזור תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולאחר מכן להוסיף 85 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כדי להתחיל הגברה יחיד HIV-1 DNA proviruses לערבב את reagents עבור PCR הסיבוב הראשון כמפורט בטבלה אחד של פרוטוקול הטקסט. הוסף 38 microliters ל 85 בארות בצלחת PCR 96 היטב תווית צלחת זו כמו PCR 1.לאחר מכן, להעביר את לוחית PCR 1 לאזור ברור המיועד לתוספת של DNA גנומי. באמצעות טריס הידרוכלוריד מדללים באופן סדרתי את הדנ"א הגנומי מיחס של 1 עד 3 ליחס של 1 עד 81 ומוודאים להכין 45 מיקרוליטרים של כל דילול. הוסף שני מיקרוליטרים של דנ"א גנומי מדולל לכל דגימה היטב ושני מיקרוליטרים של טריס הידרוכלוריד לכל באר בקרה שלילית.לאטום את הצלחת כולה למעט שליטה חיובית היטב. לאחר מכן, עבור לאזור המיועד לתוספת של השליטה החיובית. מוסיפים שני מיקרוליטרים של השליטה החיובית ל באר המתאימה ולאחר מכן לאטום את הצלחת לחלוטין.השתמש ספינר צלחת PCR כדי לסובב בקצרה את לוח PRC 1 ולהמשוך את כל התוכן שיורית מצדי הבארות. הפעל את לוח PCR 1 במחזור התרמי כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מערבבים את הרה-גנטים לסיבוב השני של PCR כמפורט בטבלה הראשונה.הוסף 28 מיקרוליטרים של תערובת PCR 2 זו ל-85 בארות של צלחת PCR חדשה של 96 בארות. סמן לוח זה כ- PCR 2. באמצעות ספינר צלחת, לזמן קצר לסובב את לוח PCR 1 כדי למשוך את כל התוכן שיורית מצדי הבארות.הוסף 80 מיקרוליטרים של טריס הידרוכלוריד לכל באר של צלחת זו. לאחר מכן, השתמש פיפטה ערוץ mutli להעביר שני microliters מכל באר של לוח PCR 1 ל בארות המתאימות בצלחת PCR 2. לאטום את צלחת PCR 2 עם עטיפת דבק ברורה.בקצרה לסובב את לוח PCR 2 ספינר צלחת. בינתיים, לאטום את צלחת PCR 1 עם סרט איטום חום לאחסון לטווח ארוך במינוס 20 מעלות צלזיוס. הפעל את לוח PCR 2 במחזור תרמי כמפורט בפרוטוקול הטקסט.ואז לסובב בקצרה את לוח PCR 2 כדי למשוך את כל התוכן שיורית מצדי הבארים. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 60 microliters של טריס הידרוכלוריד לכל באר. לאחר מכן, הפעל 15 microliters של כל באר על שני 48 היטב precast אחד אחוז ג'לים אגרוז המכילים אתידיום ברומיד.זהה את בארות המכילות את המוצר המוגבר ואת הגדלים המשוערים שלהן ושמור את תמונת הג'ל. לאחר מכן, לקבוע את הדילול שבו לא יותר מ 30 אחוז של בארות חיוביות עבור מוצר מוגבר. ראשית, השתמש ספינר צלחת לסובב בקצרה את לוח PCR 2 ולהמשוך את כל התוכן שיורית מצדי הבארות.מעבירים 40 מיקרוליטרים מה בארות המכילות מוצר מוגבר ל בארות המתאימות של צלחת מידי חדשה של 96 בארות. לאחר מכן, הגדר ערכת טיהור מבוססת הזנה מגנטית המוודאת להביא את החמרוזים המגנטיים לטמפרטורת החדר ולהכין פתרון טרי של 80 אחוז אתנול. לאחר שהחרוזים מגיעים לטמפרטורת החדר, הם מוודאים שהם נמצאים בהשבתה יסודית.בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של חרוזים ל-40 המיקרוליטרים של המוצר המוגבר בכל באר של צלחת ה-midi. מערבבים על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה 10 פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לאחר מכן, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי ולתת לו לנוח במשך שתי דקות. לאחר מכן, הסר והשליך את העל-טבעי. כשהצלחת עדיין על הדוכן, שטפו את חרוזים על ידי הוספת מאתיים מיקרוליטרים של תוסף האתנול של 80 אחוז לכל באר.דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant. חזור על תהליך שטיפה זה פעם אחת מהוספת אתנול להשלכת על טבעי. באמצעות פיפטה רב ערוצית להסיר כל אתנול עודף.תן את האוויר חרוזים יבש במשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את הצלחת מהעמוד. מוסיפים 30 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון לכל באר ומערבבים על ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה 10 פעמים.דגירה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. מניחים את הצלחת בחזרה על מעמד מגנטי ולתת לו לנוח במשך שתי דקות. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 25 microliters של supernatant ל בארות המתאימות של צלחת PCR חדשה 96 היטב.לאחר מכן, השתמשו בפוטומטר ספקטרום כדי לקבוע ולתיעד את הריכוז המשוער של כל מוצר דנ"א מוגבר. הגדר ערכת כימות דנ"א כפולה ודלל את המאגר לפעמים אחת במים סטריליים ללא DNAs. הוסף 99 מיקרוליטרים של המאגר למספר מתאים של בארות ריקות בצלחת תרבות רקמה תחתונה שטוחה.לאחר מכן, להוסיף מאה microliters של חיץ לשלוש בארות ריקות. כדי שכל מוצר מוגבר יימדד, הוסף מיקרוליטר אחד של דנ"א מטוהר בטריליקט לכל מאגר המכיל באר. לדלל lambda כפול תקוע DNA 10 לקפל משני ננוגרם למיקרוליטר לנקודה אפס אפס ננוגרם למיקרוליטר כדי להכין את הסטנדרטים.הוסף מאה מיקרוליטרים של כל תקן דנ"א כפול תקוע לשלוש בארות. לדלל את צבע florescence 1 עד 200 עם חיץ. הוסף במהירות מאה מיקרוליטרים לכל באר המכילה מדגם, ריק או סטנדרטי ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.לאחר מכן, לכסות את הצלחת עם נייר כסף, כדי למנוע מגע עם אור. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, להקליט את פליטת florescence. השתמש במדידות המוקלטות כדי לקבוע את הריכוז של דנ"א כפול תקוע בכל דגימה.לאחר מכן לדלל כל מוצר מטוהר עם מים לריכוז של נקודת אפס שתי ננוגרם לכל microliter. בעקבות PCR מקונן, המוצרים המוגברים פועלים על ג'ל אגרוז אחוז אחד. ניתן לקבוע את האיכות הראשונית של ה- PCR על-ידי בדיקת הפקדים.מכיוון שפקדים שליליים המכילים מוצר מוגבר מצביעים על זיהום ועל הבקרות החיוביות ללא מוצר מוגבר מצביעים על הגברה לא מספקת. רק בארות פועלות בדילול נקודת קצה המכילות פרווירוסים מוגברים בודדים נחשבים לתרשים. בעוד בארות המכילות proviruses מוגברת מרובים באורכים שונים ניתן לדמיין בשלב זה, הם לא צריכים להיבחר עבור רצף.עבור הרכבת דה נובו, ניתן להעריך את איכות הרציף שהורכב לעומק מספיק ושוויון כיסוי. ניתן לזהות בשלב זה גם אוכלוסיות מעורבות על ידי נוכחות של כיסוי לא אחיד. ייצוג חזותי של הרצפים המבודדים ממשתתף אחד מגלה כי 97 אחוזים מהרצפים שלהם פגומים.עם רצפים שלמים שנמצאו בתאי CD4 חיוביים של אפקט וזיכרון מעבר. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי רק מוצרים מוגברים שהושגו בדילול מגביל, זה המקום שבו לא יותר מ 30 אחוזים של בארות חיוביות, מכילים provirus יחיד. בעקבות הליך זה, מוצרים מוגברים ניתן לרצף כדי לקבוע את ההרכב הגנטי של פרווירוסים HIV.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום HIV לחקור את ההפצה של פרווירוסים HIV שלמים גנטית וסוגי תאים שונים בחולים על טיפול כדי לקבוע היכן גנטית שלם ופוטנציאל שכפול proviruses מוסמך להסתיר. אל תשכח כי עבודה עם תאים נגועים ב- HIV יכול להיות מסוכן ואמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים ועובד מעבדה מוסמכת תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

amplification-near-full-length-hiv-1-proviruses-for-next-generation

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

HIV כמיהות ניתן להסיק באזור V3 המעטפה ויראלי. V3 הוא PCR מוגבר בשלושה עותקים באמצעות מקוננות RT-PCR, רצף, ופירשו באמצעות תוכנת bioinformatic. דוגמאות עם רצף עם 1 או יותר (ים) עם ציונים נמוכים g2P מסווגים וירוס לא R5.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

לכמת רמות של HIV-1 RNA בפלסמה רצף יחיד HIV-1 הגנום של אנשים עם המון ויראלי מתחת לגבול הגילוי (50-75 עותקים / מ"ל) קשה. כאן אנו מתארים כיצד לחלץ ולכמת רנ"א נגיפי בפלסמה בזמן אמיתי באמצעות PCR assay כי מהימן אמצעים HIV-1 RNA עד 0.3 עותקים / מ"ל ​​וכיצד להגביר את הגנום הנגיפי על ידי רצף הגנום יחיד, ממדגמים עם המון ויראלי נמוך מאוד.

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

ג'נומיקס וירוס אחד (SVG) הוא שיטה לבודד ולהגביר את הגנום של virons בודד. השעיות נגיפיות של מכלול מעורב מסודרים באמצעות cytometry זרימה לשקופית מיקרוסקופ עם בארות בדידות המכילות agarose, ובכך ללכוד את virion והפחתת גז הגנום במהלך עיבוד במורד הזרם. ההגברה הגנום כולו מושגת באמצעות הגברה עקירה מרובה (מד"א) וכתוצאה מכך חומר גנטי שמתאים לסידור.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

בדיקת עמידות לתרופות ל-HIV-1 אנשים נגועים נכשלו טיפול תרופתי (ART) יכולה להדריך את הטיפולים בעתיד ולשפר את תוצאות טיפול. תוצאות בריאותיות אופטימיזציה של פרט ואוכלוסייה בשכיחות איידס גבוהה, אך משאב מוגבל הגדרות סופו של דבר תדרוש גנוטיפ עמידות לתרופה במחיר סביר ונגיש ושיטות פרשנות.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

תחרות צמיחה בין נגיפים כמעט איזוגניים מספקת מדידה רגישה לקביעת כושר השכפול היחסי. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים בניית שיבוטים רקומביננטיים של HIV-1, תחרות התפשטות וגידול וירוסים ושיטות ניתוח המותאמות להניב תוצאות רגישות ועקביות.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המיפוי גנום רחב של אתרי אינטגרציה של מולוני Murine לוקמיה וירוס מבוססי וקטורים רטרוביראל בתאים אנושיים.

Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

כאן אנו מציגים בגישה רצף עמוק המספקת של קביעה לא משוחדת של nascent-3' טרמיני, כמו גם פרופילים mutational של מולקולות דנ א חד גדילי. היישום העיקרי הוא אפיון nascent retroviral משלימים DNAs (cDNAs), intermediates שנוצר במהלך התהליך של retroviral שעתוק במהופך.

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

בעבר שאנו אימות פרוטוקול עבור amplicon מבוסס הגנום השלם וירוס אוסוטו (אוסווי) רצף על פלטפורמת רצף nanopore. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפירוט רב יותר ולקבוע את קצב השגיאה של תא הזרימה nanopore R10.

אימות הגנום השלם רצף Nanopore, באמצעות וירוס אוסוטו כדוגמה

הפרוטוקול מתאר שיטה להחדרת מגוון גנטי נשלט בגנום נגיף הפטיטיס C על ידי שילוב סינתזת RNA מוטנטית באורך מלא באמצעות PCR נוטה לשגיאות וגנטיקה הפוכה. השיטה מספקת מודל לבחירת פנוטיפ וניתן להשתמש בה עבור גנומים ארוכים של 10 קילובייט של נגיף RNA בעל חוש חיובי.

גנטיקה הפוכה כדי להנדס וריאנטים של נגיף RNA בעל חוש חיובי

למדו את שיטת FLIPS להגברה וריצוף של פרווירוסי HIV-1 באורך מלא מתאים בודד. טכניקת PCR זו מאפשרת לזהות פרווירוסים שלמים בעלי כושר שכפול ולחקור את מאגר ה-HIV הנסתר ביעילות.

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

גלה סרטונים נוספים