Name: בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: למד בידוד ושילוב אנטנות קציר-אור FCP מצורניות Cyclotella meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומני תילקואיד. שיטה זו מאפשרת חקר העברת אנרגיית עירור בתנאי יונים ו-pH משתנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים רנא אורנה חריטן אחמד לסיוע FCP טיהור. פרופסור קלאודיה Büchel הוא הודה המועיל דיונים, לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי קרן מחקר גרמני כדי LD (DI1956-1/1) ושל קרן הומבולדט עבור מלגת פיודור-Lynen LD.

<ol><li>Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18983262">The Dynamics of Photosynthesis.</a> Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).</li>
<li>Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+Responding+to+Excess+Light%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensing and Responding to Excess Light.</a> Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).</li>
<li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).</li>
<li>Li, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pigment-binding+protein+essential+for+regulation+of+photosynthetic+light+harvesting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.</a> Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).</li>
<li>Peers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+light-harvesting+protein+is+critical+for+the+regulation+of+algal+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis.</a> Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).</li>
<li>Correa-Galvis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosystem+II+Subunit+PsbS+Is+Involved+in+the+Induction+of+LHCSR+Protein-dependent+Energy+Dissipation+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).</li>
<li>Bailleul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atypical+member+of+the+light-harvesting+complex+stress-related+protein+family+modulates+diatom+responses+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).</li>
<li>Taddei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisignal+control+of+expression+of+the+LHCX+protein+family+in+the+marine+diatom+Phaeodactylum+tricornutum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum.</a> Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).</li>
<li>Lepetit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diatom+Phaeodactylum+tricornutum+adjusts+nonphotochemical+fluorescence+quenching+capacity+in+response+to+dynamic+light+via+fine-tuned+Lhcx+and+xanthophyll+cycle+pigment+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis.</a> New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).</li>
<li>Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+function+of+light+harvesting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evolution and function of light harvesting proteins.</a> Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).</li>
<li>Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+Diadinoxanthin+Pool+Size+on+Photoprotection+in+the+Marine+Planktonic+Diatom+Phaeodactylum+tricornutum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum.</a> Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).</li>
<li>Ruban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+super-excess+energy+dissipation+in+diatom+algae%3A+comparative+analysis+with+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants.</a> Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).</li>
<li>Mann, D. G. <a target="_blank" href="http://www.phycologia.org/doi/abs/10.2216/i0031-8884-38-6-437.1">The species concept in diatoms.</a> Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).</li>
<li>Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+Characterization+of+the+Excitation+Energy+Transfer+in+the+Fucoxanthin-Chlorophyll+Protein+of+Diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms.</a> Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).</li>
<li>Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272810005761">Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).</li>
<li>Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301010410000601">The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy.</a> Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).</li>
<li>Ramanan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+mechanism%28s%29+of+energy+dissipation+in+the+light+harvesting+complex+of+the+photosynthetic+algae+Cyclotella+meneghiniana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).</li>
<li>Haferkamp, S., Kirchhoff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+molecular+crowding+in+grana+membranes+of+higher+plants+for+light+harvesting+by+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II.</a> Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).</li>
<li>Wahadoszamen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stark+fluorescence+spectroscopy+reveals+two+emitting+sites+in+the+dissipative+state+of+FCP+antennas%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monogalactosyldiacylglycerol+on+the+interaction+between+photosystem+II+core+complex+and+its+antenna+complexes+in+liposomes+of+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids.</a> Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).</li>
<li>Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+fluorescence+analysis+of+the+photosystem+II+antenna+proteins+in+detergent+micelles+and+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes.</a> Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).</li>
<li>Natali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-harvesting+Complexes+%28LHCs%29+Cluster+Spontaneously+in+Membrane+Environment+Leading+to+Shortening+of+Their+Excited+State+Lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).</li>
<li>Gundermann, K., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+fluorescence+yield+of+fucoxanthin-chlorophyll+complexes+%28FCP%29+involved+in+non-photochemical+quenching+in+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).</li>
<li>Ahmad, R. A., Dietzel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+cellular+K%2B+gradients+by+valinomycin+induces+diatoxanthin+accumulation+in+Cyclotella+meneghiniana+cells+and+alters+FCPa+fluorescence+yield+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro.</a> Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).</li>
<li>Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+artificial+media+for+marine+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+Mikrobiologie%22%5BJournal%5D)">The development of artificial media for marine algae.</a> Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).</li>
<li>Jeffrey, S., Humphrey, G. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0015379617307783">New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton.</a> Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).</li>
<li>Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+Composition+and+Pigmentation+of+Fucoxanthin%E2%88%92Chlorophyll+Proteins+in+Diatoms%3A+Evidence+for+a+Subunit+Involved+in+Diadinoxanthin+and+Diatoxanthin+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding.</a> Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269787905872">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).</li>
<li>Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin-Chlorophyll+Proteins+in+Diatoms%3A+18+and+19+kDa+Subunits+Assemble+into+Different+Oligomeric+States%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States.</a> Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).</li>
<li>Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+composition+of+the+unicellular+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii+and+the+diatom+Cyclotella+meneghiniana+investigated+by+MALDI-TOF+MS+and+TLC%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).</li>
<li>Gundermann, K., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+yield+of+the+trimeric+fucoxanthin-chlorophyll-protein+FCPa+in+the+diatom+Cyclotella+meneghiniana+is+dependent+on+the+amount+of+bound+diatoxanthin%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin.</a> Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).</li>
<li>Miloslavina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+fluorescence+study+on+the+location+and+mechanism+of+non-photochemical+quenching+in+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).</li>
<li>Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+xanthophyll+cycle+activity+and+of+non-photochemical+fluorescence+quenching+by+two+alternative+electron+flows+in+the+diatoms+Phaeodactylum+tricornutum+and+Cyclotella+meneghiniana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).</li>
<li>Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272814000681">Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).</li>
<li>Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+Lhcx+protein+Fcp6+of+the+diatom+Cyclotella+meneghiniana+in+the+macro-organisation+and+structural+flexibility+of+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).</li>
<li>Darley, W. M. Biochemical composition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarley%2C+WM+%22The+biology+of+diatoms%22">The biology of diatoms</a>. 13, 198-223 (1977).</li>
<li>Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+large+single+bilayer+liposomes+by+a+fast+and+controlled+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).</li>
<li>Zumbuehl, O., Weder, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+of+controllable+size+in+the+range+of+40+to+180+nm+by+defined+dialysis+of+lipid-detergent-mixed+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).</li>
<li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Scientific Reports. 2 (306), (2012).</li>
<li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ליפוזומים FCP להרכב השומנים הטבעיים מספקים כלי שימושי, פשוט לשחזור לחקור את מאפייני ספקטרוסקופיות במבחנה. הסביבה השומנים ב FCP ליפוזומים דומה המצב בתוך קרום תילקואיד, והוליד תוצאות ניסויית כי הם קרובים יותר בתנאי הטבע.
ישנם מספר יתרונות של שימוש meneghiniana ג מערכת מודל עבור FCP האנטנה. הוא גדל יחסית מהר, היא איתנה יותר בהשוואה מינים אחרים דגם צורניות, למשל, Thalassiosira pseudonana. התאים לשבור קל יחסית בתוך הטחנה חרוז, מה שמאפשר עבור תשואה גבוהה של מתחמי תילקואיד ...

אורגניזמים פוטוסינתטיים כגון diatoms חייב להתמודד עם המשתנה לתנאי תאורה ולהגיב עם מנגנונים מתוחכמים להתאקלמות יעילות גבוהה פוטוסינתטיים ומפלגות להגן מפני נזק חמצוני-צילום הנגרמת על ידי האור מוגזמת. תהליך אור-מגן הגדולות ב פרוקריוטים פוטוסינתטיים הוא אנרגיה גבוהה quenching (qE) האור נספג המתרחשת כמו התרומה העיקרית-פוטו אטמוספרי quenching (NPQ) תחת מתח אור תנאים1,2 ,3. האור האיסוף מתחמי אנטנות (LHC) מעורבים בוויסות עירור אנרגיה העברת מסלולים. בתגובה אור גבוהה המושרה נמוך- pH של לומן כלורופלסט, מתגי מערכת אנטנה מן האור קציר למדינה המדינה quenching. מדינה dissipative אנרגיה מגן photosystems (PS) ואת שאר מכלולי ממברנה תילקואיד צילום-חמצון. ב פוטוסינתטיים פרוקריוטים, ה-qE בדרך כלל הנגרמת על ידי שני גורמים1,2,3. גורם אחד הוא האור מיוחדים קציר חלבון המגיב ה- pHנמוך. החלבון PsbS מעוררת את קיוE צמחים גבוהים יותר4. LhcSRs5, מווסת על ידי פעילות PsbS, זירוז שE אצות6. Diatoms בעלי חלבונים כמו Lhcx אשר לארגונם הקשורים LHCSRs7,8,9,10.
הגורם השני של קיוE הוא מחזור xanthophyll בהם קרוטנואידים של האנטנה המרה לצורה צילום-מגן על ידי דה-epoxidation, חזר על-ידי epoxidation. צמחים, אצות, violaxanthin מומר וזאקסנטין. ב- diatoms, diadinoxanthin מומר diatoxanthin, אשר לאחר מכן עולה בקנה אחד עם מידת NPQ11. האור צורניות קציר אנטנה בעלת כמה מוזרויות למרות שזה אבולוציונית הקשורים LHCs בשאריות אצות וצמחים. מתג האור קציר להגנה-צילום מהיר מאוד, הקיבולת NPQ גבוה יותר לעומת צמחים12. זו יכולה להיות סיבה אחת למה diatoms מצליחים מאוד בתוך נישות אקולוגיות שונות כך הם אחראים עד 45% של אושיאניק הייצור הראשוני נטו13. לכן, צורניות אור קציר מערכות הן אובייקט מעניין של מחקר פוטוסינתזה.
Diatoms, כאילו המין ממוקדת Cyclotella meneghiniana, בעלי אור פנימי תילקואיד קציר מערכות קרוי הפיגמנטים הם לאגד - fucoxanthin, כלורופיל (קלוא) ו- c, ולכן האור FCP. קציר חלבונים, כגון FCPs, הם מוטבע במערכת ממברנה תילקואיד המורכבת ממספר שכבות קרום. Diatoms יוצרים להקות של שלושה thylakoids. מתחם זה המצב מקשה ללמוד אותן ברמה המולקולרית בתוך הקרומית תילקואיד. בנוסף, רכיבים רבים לתרום ברגולציה של אור קציר (ראה לעיל). לכן, בגישות רבות, מתחמי הם בודדו אותנו מהמתרחש קרום באמצעות דטרגנטים קלים, כגון n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), אשר solubilize את הקרום אבל לשמור את מתחמי FCP ללא שינוי. מחקרים רבים ספקטרוסקופיות בוצעו באמצעות solubilized FCP לחקור את התפלגות האנרגיה העברת14,15,16,17. עם זאת, גישה זו לשעבר הייתה מוגבלת מאחר ברגולציה של העברת האנרגיה צריך excitonic אינטראקציה עם מתחמי אנטנות או photosystems אחרים. לפיכך, אלו סוגים של מחקרים לא יכול להתבצע עם מתחמי solubilized כי האינטראקציה בין מתחמי אובד.
תכונה חשובה בתקנה האנטנה הוא "מולקולרי הצפיפות" של האנטנה, photosystems קרום תילקואיד18. . לשעבר, בגישה פשוטה בוצע כדי לדמות את האפקט הזה במבחנה. ? הנוזל הוסר, מה שמוביל צבירה אקראי של מתחמי אנטנות. למרות שחלק מהנתונים סביר היה מתקבל על ידי17,זו הגישה19, הסרת דטרגנט אינו משקף את המצב ויוו , יש כמה מגבלות מאז מתחמי לא אינטראקציה בעוד השלישון הרגיל שלהם מבנה.
השימוש ליפוזומים מתגבר על כמה מן המגבלות לשעבר. מבנה שלישוני הוא עדיין מלא ללא פגע. קרום ליפוזום מספק סביבה ומעין מקורית מתחמי אנטנות. הקרום מפריד את החלק הפנימי של ליפוזום מהסביבה שבחוץ. באמצעים אלה, ליפוזומים מספקים שני תאים התגובה ללימודים של יון ו- pH מעברי צבע כמו גם לגבי תחבורה תהליכים. עוד יותר, הפרמטרים של המערכת ניסיוני יכול להיות נשלט בקלות רבה יותר ללימודי תילקואיד ממברנה. ליפוזומים הוצגו כבר להיות כלי מצוין ללמוד מתחמי פוטוסינתטיים. מוקד מרכזי בעבר היה על צמח LHC שבו ההשפעה של הרכב השומנים שינו נבחנה ב- LHC II20. גישות אחרות, אינטראקציית חלבון בין II LHC שונים היו ובדוקים21. כמו כן, מחקרים באצות בוצעו המתארים קיבוץ באשכולות ספונטני בין LHC22. בהתחשב החשיבות של diatoms עבור המערכת האקולוגית הימית, בוצעו מחקרים מעטים יחסית עם מתחמי אנטנות של diatoms. שני מחקרים חקרו את מתחמי אנטנות של ממוקדת Cyclotella meneghiniana, איפה קיבוץ באשכולות של האנטנה FCP23 ואת ההיענות של FCP-מעברי צבע אלקטרוכימי24 הוצגו. לפיכך, ליפוזומים הינם כלי מצוין ללמוד צורניות אנטנות, שלהם אינטראקציה, תקנה בתנאים כמעט מקורי. ליפוזומים רב-תכליתי מאז תנאים רבים כמו הרכב השומנים, גודל ליפוזום, חלבון צפיפות, יכול להיות נשלט השלב מימית שמסביב. יתר על כן, השיטה דורשת כמויות נמוכות של דגימות. מערכת ניסיונית היא מאוד לשחזור ועמיד. מידור של ליפוזומים מאפשר ללמוד pH, יון מעברי צבע, אשר חשובים גורמים ברגולציה של מתחמי אנטנות.
כאן נתאר את ניתוקה של מתחמי אנטנות FCP מ ג meneghiniana ואת ההתאגדות שלהם בתוך ליפוזומים להרכב השומנים תילקואיד טבעי. בנוסף, אנחנו מספקים נתונים למופת ספקטרוסקופיות פלואורסנציה solubilized FCP ולהשוות אותם עם FCP בליפוזומים. השיטה מסכמת ידע ופרוטוקולים סטנדרטיים המתקבל השיפורים של Gundermann ו- Büchel 201223, נטלי ואח 201622אחמד ו-2017 Dietzel24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה. (1) מתייחס פסקה 1 המתאר צמיחת תאים, הפרעה ובידוד תילקואיד עם בעקבות ההפרדה FCP סוכרוז צפיפות מעברי צבע; מ ג -תאיםCyclotella meneghiniana . (2) הכנת התערובת השומנים תילקואיד טבעי (MGDG, DGDG ו- SQDG) שמתואר בפיסקה 2 ויצירת השומנים-דטרגנט הקזאין עם octylglycoside (OG). גודל מוגדר השומנים-מיצלה מושגת על ידי ההבלטה באמצעות ממברנות של קוטר נקבובית מוגדרים. FCP ואת השומנים-הקזאין האחידה-ליפופרוטאין מוגדרות מראש: יחס חלבון ודטרגנטים ו β-DDM הם מוסרים דרך מבוקר דיאליזה ויוצרים FCP proteoliposomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table><tbody><tr><td>500 מ"ל בקבוקוני צנטריפוגה צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>במהירות גבוהה</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill VI 2</td><td>Edmund-B&uuml; hler (edmund-buehler.de)</td><td></td><td>גרסה חדשה יותר: Vibrogen-Zellm&uuml; hle Vl 6</td></tr><tr><td>Silibeads S 400 ומיקרו; m</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>5223-7</td><td></td></tr><tr><td>Silibeads S 1,-1,3 מ"מ</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>4504</td><td></td></tr><tr><td>משפך מסנן VitraPOR - por1</td><td>ROBU GmbH</td><td>21121</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני אולטרה-צנטריפוגציה פוליקרבונט (30 מ"ל) עבור T-865</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)314348</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אולטרה צנטריפוגה דיסקברי 90SE</td><td>סורוול</td><td>n.a.rotor</td><td></td></tr> <tr><td>T 865</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>51411</td><td></td></tr><tr><td>תא מונה תאים נויבאואר (משופר)</td><td>קארל רוט לבורבדארף (Carlroth.com)</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>זייס מיקרוסקופ פרימוסטר (7)</td><td>אופטיק-פרו (optik-pro.de)</td><td>51428</td><td></td></tr><tr><td>קובטות זכוכית אופטית (6040-OG)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>"6040-10-10"</td><td></td></tr><tr><td>V-630 ספקטרופוטומטר UV-VIS (כולל תוכנה)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>V-630</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-ברורים 17 מ"ל עבור AH629</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>רוטור AH629-17-mL</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>54285</td><td></td></tr><tr><td>ממברנה concentrator_Centriprep חיתוך 30 kDa</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>4307</td><td></td></tr><tr><td>Biometra Minigel-Twin</td><td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td><td>846-010-100</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כתמי כסף פלוס</td><td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td><td></td><td>גיליון אלקטרוני משרדי</td></tr><tr><td>חופשי</td><td>1610449 בסיס המסמך</td><td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td><td></td></tr> <tr><td>קובטות זכוכית מיוחדות לפלואורסצנטיות (101-0S)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>101-10-20</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופלואורומטר FP-6500 (כולל תוכנה)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>FP-6500</td><td></td></tr><tr><td>מאגר טעינת SDS Roti-Load</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>n-octyl &beta;-D-glucopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1300</td><td>הכינו תמיסת מלאי בכלורופורם</td></tr><tr><td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1310</td><td>הכינו תמיסת מלאי בכלורופורם</td></tr><tr><td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1230</td><td>להכין תמיסת מלאי בכלורופורם</td></tr><tr><td>L-אלפא-פוספטידילגליצרול (PG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>37-0150</td><td>להכין תמיסת מלאי בכלורופורם</td></tr><tr><td>L-&alpha;-פוספטידילכולין</td><td>סיגמא-אולדריץ' (sigmaaldrich.com)</td><td>P3782 SIGMA</td><td>להכין תמיסת מלאי באמבט סוניקטור כלורופורם</td></tr><tr><td>S-50TH</td><td>Sonicor (getmedonline.com</td><td>SONICOR-S-50TH</td><td></td></tr><tr><td>מיני מכבש</td><td>אוונטי ליפידים קוטביים (Avanti.com)</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Nuleopore ממברנת פוליקרבונט</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)610005</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>קרום דיאליזה Visking 14 kDa חתך</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>0653.1</td><td>מרתיחים במים מזוקקים לפני השימוש</td></tr><tr><td>סופח</td> <td>Biobeads SM2Biorad (Bio-rad.com)</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>קופולימר סוכרוז אפיכלורהידרין - Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני אולטרה-צנטריפוגציה פוליקרבונט (2.7 מ"ל) עבור TFT 80.4</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>252150</td><td></td></tr><tr><td>רוטור TFT 80.4</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>54356</td><td></td></tr><tr><td>חומר המפורט לפי סדר המראה </td><td></td><td></td><td>להוראות בטיחות ספציפיות אנא עיין בגיליונות בטיחות החומרים ובמדריכי הדבקה. חומרי מעבדה סטנדרטיים וחומרים אינם מופיעים.</td></tr></tbody></table>

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות cyclotella meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

הביצועים פוטוסינתטיים של צמחים, אצות, diatoms בחוזקה תלוי התקנה מהירה ויעילה של אור קציר, אנרגיה בתהליכי העברה קרום תילקואיד של מהכלורופלסט. האור קציר האנטנה של diatoms, שנקרא fucoxanthin כלורופיל a/c איגוד החלבונים (FCP), נדרשים עבור בליעת אור ומרכזי יעיל להעברת התגובה פוטוסינתטיים גם לגבי צילום-הגנה מפני אור מוגזמת. הבורר בין שתי פונקציות הוא עניין ארוכת שנים של מחקר. רבים מהמחקרים הללו בוצעו עם FCP ב הקזאין דטרגנט. ללימודים אינטראקציה, דטרגנטים הוסרו, מה שהוביל את מצבור לא ספציפי של מתחמי FCP. בגישה זו, קשה יותר להפלות בין חפצים נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. לפיכך, ניתן לקבל מידע בעל ערך רב יותר אודות FCP ואור ממברנה מאוגד אחרים קציר מתחמי על ידי לימוד אינטראקציות חלבון-חלבון, העברת אנרגיה ותכונות ספקטרוסקופיות אחרים אם הם מוטבעים בסביבתם השומנים מקורית. היתרון העיקרי הוא שיש ליפוזומים בגודל מוגדר, יחס של ליפיד/חלבונים מאת אשר נשלטת היקף FCP קיבוץ באשכולות. עוד יותר, שינויים בהרכב pH ויון המסדירים אור קציר ויוו יכול בקלות להיות מדומה. בהשוואה ממברנה תילקואיד, ליפוזומים הם הומוגני יותר ומורכב פחות, מה שהופך אותו קל יותר להשיג ולהבין נתונים ספקטרוסקופיות. הפרוטוקול מתאר את ההליך של בידוד FCP, טיהור, הכנה ליפוזום תיאגוד FCP לתוך ליפוזומים להרכב השומנים הטבעיים. היא תוצאה של יישום אופייני הם נתנו ודן.

הפרוטוקול מתאר את ניתוקה של שבר FCP סה כ מ Cyclotella meneghiniana שהשתלבה ליפוזומים להרכב מקורי השומנים. הבידוד תילקואיד מאוד לשחזור, אבל התשואה תילקואיד עשויים להשתנות. התוצאה היא מקובלת, אם יותר מ- 50% של פיגמנטים כל התאוששו בשלב 1.1.4. יותר מ- 80% הוא אופטימלי.
Solubilization של thylakoids הוא שלב קריטי. ממברנות solubilized היטב מתקבלים אם תגובת שיקוע לאחר שלב 1.2.2 מכיל את רוב הפיגמנטים. ההפרדה של FCP מן photosyste...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד fucoxanthin כלורופיל a/c מחייב חלבונים (FCP) מ- diatoms ועד לשלב אותם בתוך ליפוזומים עם יצירות השומנים טבעית ללמוד עירור העברת אנרגיה על שינויים בהרכב יון.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

שיטה זו יכולה לעזור לנו להבין שאלות מפתח במחקר פוטוסינתזה, כגון דעיכת אנרגיית האור שנלכדה ומתחמי קצירת האור, הקינטיקה שלה ויעילות ההעברה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהליפוזומים מספקים תא ממברנה הדומה למצב המקורי של קרום תילקואיד, המאפשר מחקרים על שינויים ביונים וב-pH במהלך הפוטוסינתזה. כדי להתחיל את הפרוטוקול, צנטריפוגה הכינה בעבר תאי C.meneghiniana ב-4, פי 300 G ברוטור מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס עם בקבוקוני צנטריפוגה של 500 מיליליטר למשך 15 דקות.השעו מחדש את מאגר ההומוגניזציה של כדורי התא על ידי ניעור ופיפטינג. העבירו את המתלה לצינור פלסטיק מתאים יחיד והגבילו את הנפח הסופי ל-12 מיליליטר. לאחר מכן, מצננים מראש את טחנת החרוזים והציוד למשך כ- 60 דקות.ממלאים את הכוס של 50 מיליליטר עד 75% בתערובת חרוזי זכוכית, ומוסיפים את תרחיף התאים. מערבבים אותו בעזרת מרית או מוט זכוכית ומוסיפים HB במידת הצורך. לשיבוש תאים, השתמש בפולסים של שבעה על 45 שניות במהירות מלאה, עם קירור של 30 שניות בין כל פולס.סנן את התאים המופרעים מעל משפך מסנן זכוכית ושטוף אותם על ידי שפיכת ה-HB על חרוזי הזכוכית עד שהם נראים צלולים. לאחר מכן, אסוף את שבר הכביסה עם המסנן ושמור על הנפח הסופי נמוך מ -150 מיליליטר. צנטריפוגה של הדגימה למשך 15 דקות ב-140 פעמים G באמצעות שלושה צינורות פלסטיק של 50 מיליליטר כדי לגלול את פסולת התא.העבירו בזהירות את הסופרנטנט לבקבוקוני אולטרה-צנטריפוגה מפוליקרבונט בנפח 20 מיליליטר והשליכו את הגלולה. מלאו את הבקבוקונים ב-HB. לאזן את המשקל. צנטריפוגה ברוטור מתאים למשך שעה בטמפרטורה של 300, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את ממברנות התילקואיד.השעו מחדש את גלולת הממברנה עם כמה שפחות מאגר כביסה, בעזרת מברשת צייר קטנה. מלאו את בקבוקוני האולטרה-צנטריפוגה מפוליקרבונט במאגר כביסה. לאזן את משקלם.צנטריפוגה אותם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 200, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הממברנות השטופות בעזרת מברשת הצייר. אסוף את כל התילקואידים בבקבוקון דגימה אחד של 15 מיליליטר.מלאו צינורות אולטרה-צנטריפוגה בתמיסת שיפוע סוכרוז למעלה לנפח של מיליליטר אחד. מקפיאים את הצינורות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהם קפואים לחלוטין. לאחר מכן, הניחו לצינורות להפשיר בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, השתמש בדגימות המתאימות ל-125 מיקרוגרם כלורופיל והתאם אותן עם מאגר B1 לנפח של 0.9 מיליליטר. לצורך המסה, הוסף N.Dodecyl Beta D maltopyranoside לריכוז סופי של 20 מילימולר. הפוך את הצינור שלוש פעמים.הניחו אותו על קרח למשך 20 דקות עם ניעור עדין כדי למנוע היווצרות קצף. צנטריפוגה למשך חמש דקות בחום של 12,000 פעמים G בצנטריפוגה שולחנית מקוררת מראש בארבע מעלות צלזיוס. טען את הסופרנטנט על השיפוע, ואל תטען יותר מ-125 מיקרוגרם של כלורופיל כולל לכל שיפוע אם משתמשים בבקבוקונים של 17 מיליליטר.צנטריפוגה למשך 22 שעות בטמפרטורה של 100, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. שחזר את שברי ה-FCP החומים הרצויים מהשיפוע באמצעות מזרק. הערכת עוצמת האחסון.לאחר מכן, הסר אליקוט של חמישה מיקרוליטר ודלל אותו ב-995 מיקרוליטר של B1A. לאחר מכן, מדוד את נפח הדגימה המשוחזרת בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר. שטפו את מתחמי ה-FCP על ידי הוספת נפח כפול מהנפח המשוחזר עם מאגר B1 נטול חומרי ניקוי.רכז את הדגימות ברכז ממברנה עם חתך של 30 קילודלטון ב-1,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס לספיגה ב-672 ננומטר של לפחות 20. פיפטו את הנוזלים לתוך צינור תגובה של שני מיליליטר והתאדו את הכלורופורם באמצעות זרימת חנקן עדינה ופזרו את השומנים על כל שטח בסיס הצינור. תנו לחנקן לזרום עד שכל הממס יתאדה.ממיסים את תערובת השומנים ב-29 מיקרוליטר של N Octyl beta d glucopyranoside בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. דגרו על תערובת השומנים למשך 10 דקות בחום של 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו את תערובת השומנים באמבט סוניקטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שלוש פעמים למשך שלוש דקות.מניחים את התערובת על קרח למשך 30 שניות בין כל סוניקציה. הוסף 221 מיקרוליטר של מאגר טריצין ו-250 מיקרוליטר של מאגר דיאליזה פי ארבעה. השתמש במכבש עם ממברנות פוליקרבונט 0.1 מיקרון כדי לקבל קוטר ליפוזום מוגדר של 50-70 ננומטר.הרכיבו את המכבש עם הממברנה ותמיכת המסנן. שטפו והרטיבו את הציוד, ועבדו בזהירות ובאיטיות כדי למנוע בועות אוויר, והדקו היטב את המכלול. מלאו מזרק במאגר דיאליזה פי ארבעה והרטיב מראש את המכבש עד שלא ניתן לראות בועות במזרק השני.מרחו את מיצלות חומר הניקוי השומני על המכבש ולחצו את התמיסה ממזרק אחד למשנהו קדימה ואחורה. חזור על שלב זה חמש פעמים, עד שהתמיסה נראית הומוגנית. עברו לשילוב קומפלקסי ה-FCP והוסיפו FCP השווה ל-20 מיקרוגרם כלורופיל a בנפח כולל של 500 מיקרוליטר של מאגר B1A ל-250 מיקרוליטר של מיצלות השומן המוחצנות בתוספת 250 מיקרוליטר DP פי ארבעה. דגרו את הדגימות במשך שלושה מרווחים למשך שלוש דקות כל אחת ב-25 מעלות צלזיוס בתרמו-מיקסר ב-1,500-3,000 סל"ד, המופרעות על ידי הפסקה של 30 שניות על הקרח.חותכים את המכסה של ארבעה צינורות תגובה של 1.5 מיליליטר ממש מתחת לחלק העליון, ונותנים טבעת שעדיין מתאימה למכסה. הכן חתיכות של 1.5 על 1.5 סנטימטר של ממברנות דיאליזה ושטוף אותן ב -20 מיליליטר של מאגר דיאליזה חד פעמי. מלאו כל מכסה ב -250 מיקרוליטר מהדגימה.הניחו בזהירות את הממברנה על המכסה כך שהתא יתמלא לחלוטין בדגימה ולא יתרחשו בועות אוויר. הדק את טבעת צינור התגובה על המכלול כך שהתא יהיה סגור. דיאליזה של הדגימות ב-50 מיליליטר של מאגר דיאליזה חד פעמי למשך 12-16 שעות על קרח על שייקר נופל.החלף את המאגר במאגר דיאליזה טרי והוסף שבעה מיליגרם של חרוזים סופחים כדי להסיר את חומרי הניקוי הנותרים למשך שש שעות לפחות. החלף שוב את מאגר הדיאליזה, ודיאליזה של הדגימות למשך 12 שעות נוספות. שחזר את הליפוזומים על ידי ניקוב קרום הדיאליזה עם קצה מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר ושאוף את כל הליפוזומים ממכסה צינור התגובה.צנטריפוגה את ליפוזומי ה-FCP בלפחות שני מיליליטר של מאגר דיאליזה 1X למשך 1.5 שעות ב-100, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. שחזר את הליפוזומים על ידי סיבוב צינור הצנטריפוגה בזווית של 45 מעלות. אפשר לליפוזומים לנוע למטה למשך דקה אחת.שחזר את ליפוזומי ה- FCP בנפח סופי של 25-50 מיקרוליטר, והימנע מהפרעה למשקעים. הבדלים בספקטרום הספיגה המנורמל מצביעים על אובדן פיגמנט, המתרחש באזור הספקטרלי שבין 500 ל-550 ננומטר, שבו קרוטנואידים נספגים. אובדן פיגמנט מקובל אם הקומפלקסים עדיין מתפקדים, מסומנים על ידי ספקטרום פליטה ועירור דומה.תפוקת הקרינה של הכלורופיל הנובעת מ-FCP בליפוזומים מופחתת עקב אינטראקציה אקסיטונית באשכולות FCP. ההשפעה של שיפוע יון אשלגן על תפוקת הקרינה של FCP נבדקה בנוכחות מאגר סטנדרטי, שיורד ב-30 אחוז אם מוסיפים אשלגן כלורי. שיפוע האשלגן שוחרר על ידי ולינומיצין, המשחזר את הקרינה של FCP לרמה הראשונית ומאשר את ההשערה כי קומפלקסים של FCP מגיבים לשיפועי ריכוז יוני אשלגן in vivo.בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כמו פלואורסצנציה של טמרסול, בדיקת משאבה, וספקטרוסקופיה של מולקולה בודדת על מנת לחקור שאלות נוספות בהעברת אנרגיית אור.

isolating-incorporating-light-harvesting-antennas-from-diatom

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

פרוטוקול זה מפרט את הבנייה מחדש של קומפלקסים לקצירת אור במבחנה. חלבוני הממברנה האינטגרליים הללו מתאמים כלורופיל וקרוטנואידים ואחראים לקצירת אור בצמחים גבוהים יותר ובאצות ירוקות.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

כאן, מתואר פרוטוקול ליצירת תבניות חלבון מווסתות אור והפיכות עם דיוק מרחבי-זמני גבוה בקרומי שומנים מלאכותיים. השיטה מורכבת מפוטואקטיבציה מקומית של החלבון iLID (דימר משופר המושרה באור) המשותק על קרומי המודל אשר, תחת אור כחול, נקשר לחלבון השותף שלו ננו (SspB מסוג פראי).

תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

למד בידוד ושילוב אנטנות קציר-אור FCP מצורניות Cyclotella meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומני תילקואיד. שיטה זו מאפשרת חקר העברת אנרגיית עירור בתנאי יונים ו-pH משתנים.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

גלה סרטונים נוספים