Name: השימוש העכבר Splenocytes כדי להעריך את ההשפעה הקשורים הפתוגן התבנית המולקולרית על ביטוי גנים שעון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: חקור את השפעת תבניות מולקולריות קשורות לפתוגן על ביטוי גני השעון בתאי טחול עכברים. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעות רכיבים מיקרוביאליים על השעון המולקולרי במחקר אימונולוגיה וכרונוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי סגל המחקר מעניק מתפקידה המכללה לאמנויות ודין מדעי באוניברסיטת הארטפורד.

במהלך המחקר, טיפול בבעלי חיים וטיפול תאמו מדיניות מכוני הבריאות הלאומיים, היו על פי הנחיות מוסדיים, אושרו על ידי אוניברסיטת הרטפורד טיפול בבעלי חיים מוסדיים בעלי חיים ועל שימוש הוועדה.
1. entrainment של בעלי חיים
הערה: עשרים בת שבוע זכר B6129SF2/J עכברים משמשים במחקר.
<ol><li>Entrain עכברים 12 שעות אור (סטנדרט עילי אור לבן) / כהה 12 h מחזור 2 שבועות לפני הניסוי. הערה: כאן זמן zeitgeber (ZT) 0 מקביל אורות, ZT12 אורות, תוך שמירה על איכות הסביבה גורמים אחרים (קרי, מזון ומים בטמפרטורת החדר) קבוע 21.</li>
</ol>2. הכנת כלי נגינה תרבות בינוני, בינוני אתגר
<ol><li>אוטוקלב מלקחיים ומספריים ויבתר לעטוף זוגות של שקופיות מיקרוסקופ עמומה רדיד אלומיניום, החיטוי.</li>
	<li>היכונו בינוני תרבות על-ידי הוספת סרום שור עוברית (FBS) כדי RPMI 1640 ריכוז סופי של 10%. הכינו 10 מ"ל של אתגר בינונית 50 מ ל צינורות על-ידי הוספת PAMPs הבאים את המדיום תרבות (RPMI עם 10% FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), חום-נהרג ליסטריה (108 HKLM/mL), או PAMP אחר בריכוז המוצע שלה.</li>
	<li>לחמם תרבות בינונית, אתגר בינוני עד 37 ° C באמבט מים, ולשמור כ 70 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS, pH 7.2) בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להוסיף 10 מ של תרבות מדיום באמצעות פיפטה של 10 מ"ל פיפטה סיוע שפופרת 50 מ ל, המקום על קרח.</li>
	<li>להוסיף כ- 30 מ של 70% אתנול 100 מ ל גביע ומקום הקצוות של לנתח מלקחיים ומספריים לתוך כשהספל למניעת זיהום מיקרוביאלי.</li>
	<li>היכונו מאגר פירוק RNA בידוד על-ידי הוספת 10 µL β-Mercaptoethanol (תחת ברדס fume) לכל 1 מ"ל של מאגר RLT בשפופרת 50 מ. לעשות רק את הסכום יהיה צורך (600 µL עבור דגימה, אשר מורכב של 1 x 106 תאים). הערה: RLT מאגר הוא רכיב של ערכת חילוץ RNA התומך הכריכה של RNA למוח סיליקה.</li>
</ol>3. Splenocyte בידוד ואתגר
<ol><li>המתת חסד עכברים במועד מסוים zeitgeber באמצעות הרדמה על-ידי שמירתן בכלוב המקורי שלהם והוספת CO2 לכלוב בספיקה של 3 L לדקה המשך אספקת CO2 ב 1 דקות לאחר עוצר נשימה.</li>
	<li>אשר מת דרך נקע בצוואר הרחם על ידי הצבת באגודל ובאצבע משני צדי הצוואר בבסיס הגולגולת. לחלופין, הקש על מוט בבסיס הגולגולת תוך משיכת במהירות (באמצעות היד השנייה) בבסיס הזנב או הגפיים האחוריות כדי לגרום ההפרדה של חוליות צוואר הרחם של הגולגולת22.</li>
	<li>תרסיס המטען עכבר עם 70% אתנול ולנגב במגבת נייר. הנח את העכבר על הגב ועל מוטה מעט על הצד השמאלי שלו. לחתוך את הפרווה, באמצעות לנתח מספריים, לאורך הצד השמאלי של העכבר, על באמצע הדרך בין הכניסה לבין האחוריות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, לתפוס את הצפק ולהפוך בזהירות חתך כדי לא לפגוע בטחול. להסיר את הטחול עם מלקחיים ומניחים לתוך צינור סטרילי 50 מ ל המכיל כ- 10 מ"ל של תרבות התקשורת על קרח. חזור על החיות הנותרים. הערה: הטחול הוא הצבע של שעועית כליה, זה ארוך ושטוח יותר הכליה.</li>
	<li>
העברה הטחול אחת עם 2 מ של תרבות בינוני צלחת פטרי סטריליות קטן.
	<ol>
<li>Homogenize הטחול על ידי שפשוף זה בין החלק עמומה של שתי שקופיות עמומה סטרילי. במידת האפשר, לשמור את הנושא ואת התאים בטווח הבינוני במהלך תהליך המגון.</li>
		<li>פעם ביסודיות הומוגני, pipet mL 2 של תרבות בינוני המכיל את splenocytes דרך מסננת תא 40 µm ניילון לתוך צינור 50 מ.</li>
		<li>חזור על השלבים שלעיל טחולים הנותר באמצעות זוגות חדשים של שקופיות עמומה, צינורות 50 מ עם תרבות בינוני, תא strainers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף כל אחד הצינורות 50 מ ל המכיל את splenocytes עבור הנפח הכולל של 10 מ"ל/צינור 8 מ של מדיום קר תרבות. לקבוע את מספר תאים למיליליטר באמצעות של hemocytometer.</li>
	<li>להוסיף כ עונה 1 פרק 106 תאים/טוב 6-ובכן תרבות צלחות. הוסף תאים מספר בארות אשר תואמים מספר PAMPs שונים בשימוש עבור הניסוי, כוללים פקד טוב. להוסיף 3 מ"ל של תרבות מדיום או 3 מ"ל של אתגר בינוני הבארות בהתאמה.</li>
	<li>דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 ב-3 שעות.</li>
	<li>לגרד את התאים מתחתית היטב באמצעות טיפ pipet µL 1,000 קשורה micropipette P1000. להעביר את המדיום המכילות את התאים באמצעות אותו 1,000 µL pipet העצה לרכבת התחתית 15 מ"ל.</li>
	<li>גלולה התאים באמצעות צנטריפוגה ב x 167 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר תא עם 5 מ של PBS.</li>
	<li>גלולה התאים בפעם השנייה ב 167 x g למשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, ומוסיפים µL 600 פירוק מאגר בגדר תא כדי lyse התאים. לאחר מכן המשך בידוד ה-RNA.</li>
</ol>4. RNA בידוד ו- cDNA סינתזה
<ol><li>לבודד את הרנ א מ- splenocytes באמצעות ערכת חילוץ RNA לפי הנחיות היצרן ולבצע את העיכול הדנ א על עמודות 'אופציונלי'.</li>
	<li>לפני cDNA סינתזה, לקבוע ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume כדי לוודא הריכוז בטווח ה-RNA אופטימלית (עד 2 µg) של cDNA סינתזה הערכה.</li>
	<li>
CDNA Synthesize עבור כל אחת הדגימות באמצעות ערכת שעתוק במהופך על פי הוראות היצרן. השתמש µL 10 של RNA לכל אחת הדגימות באמצעי אחסון התגובה הכולל 20 µL. בסיום שעתוק לאחור (thermocycler לרוץ) להוסיף 20 μL H2O על כל תגובה.
</li>
	<li>לבנות עיקול רגיל באמצעות micropipette P10 או P20 אספנו את ה-mRNA של שליטה כמה דוגמאות (למשל, 5 µL מדגימות 2 על סך של 10 µL) לתוך צינור 0.5 mL כדי להכין את cDNA.<ol>
<li>להוסיף 10 µL 2 x מיקס מאסטר רוורס טרנסקריפטאז.</li>
		<li>בסיום שעתוק לאחור, להוסיף 10 µL של H2O ברכבת התחתית התגובה, אשר ישמש הריכוז ההתחלתי ("1") בסדרת דילול של העקומה סטנדרטי.</li>
		<li>לבצע סדרה 10-fold דילול (1 עד 10-4) על-ידי הוספת 45 µL של מים באמצעות של micropipette P100 או P200 לתוך ארבעה צינורות 0.5 mL המיועד 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.<ol>
<li>להוסיף 5 µL הריכוז ההתחלתי "1" לתוך הצינור הראשון (10-1) באמצעות micropipettor P20, מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, ואז העברת 5 µL מהצינור 10-1 לתוך הצינור המיועד 10-2 ומיקס.</li>
			<li>להעביר 5 µL באמצעות micropipette P20 מהצינור 10-2 לתוך הצינור המיועד 10-3 ומערבבים. להעביר 5 µL באמצעות micropipettor P20 מהצינור 10-3 לתוך הצינור המיועד 10-4 ומערבבים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR)
<ol><li>לקבוע כימות היחסי של mRNA רמות על ידי qPCR. במסגרת ניסיוני הגדר, בחר כימיה "כימות – יחסית סטנדרטי עיקול" ו- "TaqMan". שינוי האחסון תגובה ל- 10 µL. להזין את המידע הרלוונטי הפריסה צלחת (למשל, יעד ג'ין, עיקול רגיל, כתב, וכו ').</li>
	<li>הכנת התגובה כך שהוא מכיל 0.5 µL של וזמינותו פריימר/בדיקה, 5 µL של גנים ביטוי מיקס מאסטר, µL 2 H2O ו- 2.5 µL של cDNA (10 – 100 ng).<ol>
<li>להכין תערובת בסיס על-ידי הכפלת כל אחד ריאגנטים הקודם (למעט cDNA) לפי מספר תגובות, וודאו שכללתם את אלה של העקומה סטנדרטי, פקדים שלילי, ביצוע כל התגובה כפילויות, ו 2 תגובות נוספות יעבור לחשבון וריאציה pipetting.</li>
		<li>Pipet 7.5 µL של המיקס מאסטר מוכן לתוך בארות שנקבע מראש בצלחת 96-ובכן התגובה של micropipette או של פיפטה רב-ערוצי. Pipet µL 2.5 של cDNA לתוך הבאר המתאים אלמונים ותקני ולאחר 2.5 µL של H2O לתוך הבארות שליטה שלילי.</li>
		<li>כוללים מבחני פריימר/בדיקה עבור גנים שעון מולקולרי שונים, וכוללים גם של assay עבור פקד אנדוגני (למשל, β-אקטין).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לקבוע ערכי הביטוי יחסי, לחשב את הכמות היחסית רעה עבור כל שכפול ולאחר מכן, עבור כל דגימה, לחלק את הכמות היחסית רעה עבור הגן היעד על ידי הכמות היחסית רעה עבור β-אקטין.</li>
</ol>6. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי, להזין נתונים לתוכנית תחת האפשרות סטטיסטיקה בעמודה. בחר חד-כיווני אנובה עם הבדיקה לאחר הוק של Dunnett כדי להעריך את ההבדלים בין ערכים רשע שעון גנים לאחר אתגר PAMP לעומת הפקד.</li>
</ol>

<ol><li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators%3A+lessons+from+diverse+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li>
<li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22483041">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).</li>
<li>Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+shock+induces+circadian+gene+expression+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells.</a> Cell. 93, 929-937 (1998).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+Central+and+Peripheral+Circadian+Oscillators+in+Transgenic+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+circadian+rhythms+in+mammalian+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms.</a> Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).</li>
<li>Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Clock+Proteins+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Circadian Clock Proteins and Immunity.</a> Immunity. 40, 178-186 (2014).</li>
<li>Keller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+clock+in+macrophages+controls+inflammatory+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).</li>
<li>Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+expression+of+clock+genes+in+mouse+macrophages%2C+dendritic+cells%2C+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells.</a> Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pattern-recognition+receptors+in+innate+immunity+update+on+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Publ.+Gr%22%5BJournal%5D)">The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors.</a> Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).</li>
<li>Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+responses+to+endotoxin+treatment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Circadian responses to endotoxin treatment in mice.</a> J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).</li>
<li>Okada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+LPS+Causes+Transient+Suppression+of+Biological+Clock+Genes+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats.</a> J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).</li>
<li>Haimovich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+endotoxin+synchronizes+and+suppresses+clock+gene+expression+in+human+peripheral+blood+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes.</a> Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).</li>
<li>Curtis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+innate+immunity+in+macrophages+by+miR-155+targeting+Bmal1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).</li>
<li>Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Circadian+Clock+Controls+Toll-like+Receptor+9-Mediated+Innate+and+Adaptive+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity.</a> Immunity. , (2012).</li>
<li>Gibbs, J. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22184247">The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines.</a> PNAS. 109, 582-587 (2012).</li>
<li>Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3654533/">Circadian rhythm abnormalities.</a> Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).</li>
<li>Bovbjerg, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+disruption+and+cancer%3A+sleep+and+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation.</a> Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).</li>
<li>Fu, L., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock%3A+pacemaker+and+tumour+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).</li>
<li>Germain, A., Kupfer, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18680211">CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION.</a> Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5158/basic-mouse-care-and-maintenance">Basic Mouse Care and Maintenance.</a> JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition.</a> AVMA. , (2013).</li>
<li>Silver, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-associated+molecular+patterns+alter+molecular+clock+gene+expression+in+mouse+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes.</a> PLoS One. , 12-15 (2017).</li>
<li>Silver, A. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844017321199">Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells.</a> Heliyon. , 00579(2018).</li>
<li>Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: 
 <a target="_blank" href="https//phenome.jax.org">https//phenome.jax.org</a> (2018).</li>
</ol>

המחבר אין לחשוף.

בתוך פרוטוקול זה, ספקטרופוטומטרים microvolume יכול לשמש כדי לכמת ולהעריך את טוהר הרנ א בשימוש בקביעת ביטוי גנים. חומצות גרעין לספוג אולטרא סגול-260 ננומטר, חלבונים בדרך כלל סופגים אור-280 ננומטר, ואילו אחרים מזהמים פוטנציאליים בשימוש במהלך שגרת החילוץ RNA (למשל, פנול) לזיהוי ב- 230 ננומטר. לכן, על-ידי הערכת את ספיגת יחס (א)-260/280 ננומטר (RNA לחלבון) ו- 260/230 nm (RNA לחלבון מזהמים) איכות הרנ א יכול להיות מוערך. RNA באיכות גבוהה יש יחס A260/280 בין 1.8 – 2.1, כמו יחסי נמוך יותר להצביע על זיהום חלבון. דוגמה RNA...

שעון אב ביונקים, אשר האחראית תנודות 24 שעות ביממה עבור כמעט כל ההיבטים של פיזיולוגיה והתנהגות, הינו ממוקם במרחק העל-תצלובתי (SCN) של ההיפותלמוס1,2. בנוסף, ויסות תהליכים ביולוגיים ברמת organismal מסנכרנת שעון אב היקפיים שעונים הסלולר ברחבי הגוף3,4,5. בעוד המנגנון שעון מולקולרי מורכבת לפחות 3 לולאות משוב תעתיק translational שלובים, הליבה מורכבת של התקופה (Per1-3), קריפטוכרום (Cry1-2), Bmal1, ואת השעון גנים6,7. מלבד שמירה על התזמון מדויק של השעון המולקולרי הליבה, כמה מוצרים ג'ין שעון נלווים (למשל, Rev-erbα , Dbp) גם לווסת את הביטוי של גנים שאינם שעון, קרי, שעון מבוקר גנים (CCGs)6 , 7.
הפונקציונליים שעונים מולקולרית תוארו שונים ברקמות מערכת החיסון (למשל, הטחול ובלוטות הלימפה)8 , תאים (למשל, B תאים, תאים דנדריטים, מקרופאגים)8,9. תאים אלה לזהות ולהגיב פתוגן-הקשורים מולקולרית דפוסים (PAMPs), שנשמרת הרכיבים מיקרוביאלי, באמצעות קולטנים זיהוי מערכת החיסון מולדים כגון אגרה דמוי קולטנים (TLRs)10. עד כה, 13 TLRs תפקודית תוארו, אשר מזהה את המרכיבים חיידקים כגון רכיבי הקיר תא החיידק, השוטוניים חלבון מיקרוביאלי חומצות גרעין10. PAMP, ליפופוליסכריד (LPS), מרכיב דופן התא של חיידקים גראם שליליים מזוהה על-ידי TLR4, הוכח לשנות מקצבים השעון הביולוגי ברמות organismal והן מולקולרית. לדוגמה, ויוו האתגר של LPS מושרה עיכובים photic כמו שלב כפי שנמדד על-ידי פעילות עכברים11 והוביל לביטוי גנים שעון מופחת ב SCN ו הכבד כפי שנקבע על ידי הכלאה בחיי עיר ו- PCR כמותי, בהתאמה, בעוד עכברושים12. לאחר ויוו אתגר עם התקליטים, ניתוח של דם היקפיים אנושי לויקוציטים13 ו רקמת השומן התת עורית14 גילה ביטוי שונה של מספר גנים השעון כפי שנמדדה באמצעות qPCR. לבסוף, שמחוץ LPS באתגרים של מקרופאגים האנושי מקרופאגים הצפק העכבר, הוביל גם שינו שעון ביטוי כפי שהיא נמדדת qPCR14.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך את השפעת התקליטים PAMPs, ODN1826 (oligonucleotides סינטטי המכיל unmethylated מוטיבים CpG), וחום-נהרג ליסטריה (HKLM), מזוהה על-ידי TLR4, TLR9 ו- TLR2, בהתאמה, על שעון מולקולרי ביטוי גנים ב העכבר splenocytes. הפרוטוקול כולל העכבר ספלנקטומיה, בידוד splenocyte, אתגר, RNA החילוץ, סינתזה cDNA qPCR להעריך ביטוי של מספר גנים שעון. פרוטוקול זה מאפשר רכישת מספר גדול של תאים חיסוניים עם מעט מאוד חיים בזמן או מניפולציה הסלולר, אז מה שיכול להיות מאותגרת שמחוץ עם PAMPs שונים. השעון המולקולרי הוכח לווסת את ההיבטים השונים של ה8,15,של התגובה החיסונית16, לכן, שיבוש של השעון המולקולרי סביר לפגום את הווריאציה תלויי-זמן נאות של התגובה החיסונית. בנוסף, מאז שיבושים של השעון הביולוגי יכול להוביל מבעיות17,18,19,20, זה עשוי להיות עניין לחוקרים לאתגר את splenocytes עם מגוון רחב של מולקולות ולהעריך את השפעתם על השעון.

<table><tbody><tr><td>מגלשות חלביות</td><td>פישר</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>מסננות תאים</td><td>פישר</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 או 74106</td><td></td></tr><tr><td>RNase Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 6 בארות</td><td>דנוויל</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan מבחני ביטוי גנים b-actin</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>מבחני ביטוי גנים של TaqMan Per2</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan מבחני ביטוי גנים Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan מבחני ביטוי גנים Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan מבחני ביטוי גנים Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>מכונת qPCR StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp צלחת תגובה מהירה 96 בארות (0.1 מ"ל)</td><td>ThermoFisher</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח סטטיסטי</td><td>פריזמה 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

השימוש העכבר splenocytes כדי להעריך את ההשפעה הקשורים הפתוגן התבנית המולקולרית על ביטוי גנים שעון

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

מהתנהגות על ביטוי גנים, השעון הביולוגי לווסת כמעט בכל ההיבטים של פיזיולוגיה. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה אתגר splenocytes עכבר עם ליפופוליסכריד פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) (LPS), ODN1826, חום-נהרג ליסטריה ולבחון את השפעתם על מולקולרית היממה שעון. בעבר, מחקרים התמקדו בחינת השפעתה של LPS על השעון המולקולרי באמצעות מגוון של גישות ויוו ו- ex-vivo מבחר דגמים (למשל, עכבר, חולדה, האדם). פרוטוקול זה מתאר את הבידוד ואת האתגר של splenocytes, כמו גם את המתודולוגיה כדי להעריך את השעון ג'ין ביטוי האתגר שלאחר באמצעות PCR כמותי. גישה זו ניתן להעריך לא רק את ההשפעה של רכיבים חיידקים על השעון המולקולרי אבל מולקולות אחרות כמו גם זה עשוי לשנות את הביטוי של השעון. גישה זו יכול להיות מנוצל כדי לקנטר לגזרים את המנגנון המולקולרי של כיצד משפיע על האינטראקציה קולטן PAMP-אגרה-כמו שעון הביטוי.

עכברים הוקרבו ב ZT13, splenocytes היו מבודדים והזמנו שמחוץ עם PAMPs LPS, ODN1826, או HKLM. לאחר 3 שעות, RNA היה מבודד, qPCR שימש להערכת רמות הביטוי היחסי של הגנים שעון מולקולרי השעון, Per2, Dbp, ו- Rev-erbα לעומת תאים שליטה לאתגר. לאחר PAMP אתגר, רמות הביטוי השעון לא היו שונים באופן משמעותי מאשר הביטוי בתאים שליטה (איור 1א'). רמות הביטוי Per2 היו גבוהות משמעותית בתאים הם אתגר LPS ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה באמצעות העכבר splenocytes לגלות דפוסי מולקולריים הקשורים הפתוגן שמשנות ביטוי גנים שעון מולקולרי.

השימוש העכבר Splenocytes כדי להעריך את ההשפעה הקשורים הפתוגן התבנית המולקולרית על ביטוי גנים שעון

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והכרונוביולוגיה, כגון כיצד רכיבים מיקרוביאליים משנים את השעון המולקולרי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא קלה לביצוע, מעריכים את ההשפעות של רכיבים מיקרוביאליים שונים על השעון המולקולרי, והיא ניתנת לשחזור רב. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הכינו מדיום תרבית על ידי הוספת סרום בקר עוברי ל-RPMI 1640 לריכוז סופי של 10%הכינו 10 מיליליטר של מדיום אתגר עבור כל אחד מה-PAMPS שייבדקו בצינורות של 50 מיליליטר על ידי הוספת מדיום תרבית PAMP הרשום.מרססים תא מטען עכבר שהוכן בעבר באתנול 70% ומנגבים אותו במגבת נייר. הנח את העכבר על גבו, מוטה מעט על צדו הימני. לאחר מכן, חתכו את הפרווה באמצעות מספריים מנתחים לאורך הצד השמאלי של העכבר, בערך באמצע הדרך בין הרגליים הקדמיות והאחוריות.בעזרת מלקחיים תפסו את הצפק ובצעו חתך בזהירות מבלי לפגוע בטחול. הסר את הטחול בעזרת מלקחיים והנח אותו בצינור סטרילי של 50 מיליליטר המכיל כ -10 מיליליטר של מצע תרבית על קרח. לאחר מכן העבירו את הטחול עם שני מיליליטר של מדיום תרבית לצלחת פטרי קטנה וסטרילית.הומוגניזציה של הטחול על ידי טחינתו בין החלק החלבי של שתי מגלשות חלביות סטריליות. לאחר ההומוגניות היסודית, פיפטה את שני המיליליטר של מדיום התרבות המכיל את הטחול דרך מסננת תאי ניילון של 40 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר. הוסף שמונה מיליליטר של מדיום תרבית קרה לכל אחד מצינורות 50 מיליליטר המכילים את הטחול, לנפח כולל של 10 מיליליטר לצינור.קבע את מספר התאים למיליליטר באמצעות המוציטומטר. הוסף בערך 10 פעמים 10 לתאים השישיים לבאר לצלחות תרבית של שש בארות. לאחר הוספת התאים, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום תרבית או שלושה מיליליטר של מדיום אתגר לתאים.לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש שעות. מגרדים את התאים מתחתית הבאר באמצעות קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר המחובר למיקרופיפטה P1000. עם אותו קצה פיפטה, העבירו את המדיום המכיל את התאים לצינור של 15 מיליליטר.גלולה את התאים ב -167 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט ושטוף את כדור התא עם חמישה מיליליטר PBS. לאחר גלולת התאים בפעם השנייה ב-167 פעמים גרם למשך חמש דקות, הסר את הסופרנטנט והוסף 600 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכדור התא.בודד RNA מטחול באמצעות ערכת מיצוי RNA בהתאם להוראות היצרן ובצע את עיכול ה-DNA האופציונלי על העמודה. לסנתז cDNA עבור כל אחת מהדגימות באמצעות ערכת השעתוק ההפוך בהתאם להוראות היצרן. השתמש ב-10 מיקרוליטר RNA עבור כל אחת מהדגימות בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר.משוך mRNA מכמה דגימות בקרה לתוך צינור של 0.5 מיליליטר כדי להכין את ה-cDNA שישמש לעקומה הסטנדרטית בעת ביצוע PCR כמותי. הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר טרנסקריפטאז הפוכה פי 2. בסיום השעתוק ההפוך, הוסף 10 מיקרוליטר מים לצינור התגובה, המשמש כריכוז ההתחלה בסדרת הדילול לעקומה הסטנדרטית.בצע סדרת דילול פי עשרה על ידי הוספת 45 מיקרוליטר מים לארבעה צינורות של 0.5 מיליליטר המיועדים 10 למינוס 1, 10 למינוס שתיים, 10 למינוס שלוש ו-10 למינוס ארבע. הוסף חמישה מיקרוליטר מריכוז ההתחלה אחד לצינור השני, 10 למינוס אחד, באמצעות מיקרו-פיפטר P20. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים ואז מעבירים חמישה מיקרוליטר מהצינור 10 למינוס אחד לצינור המיועד 10 לצינור מינוס שתיים ומערבבים.מעבירים חמישה מיקרוליטר באמצעות מיקרופיפטה P20 מהצינור 10 למינוס שתיים לתוך הצינור המיועד 10 למינוס שלוש ומערבבים. לבסוף, העבירו חמישה מיקרוליטר באמצעות מיקרו-פיפטר P20 מהצינור 10 למינוס שלוש לתוך הצינור המיועד 10 למינוס ארבע וערבבו. הכן את התגובה כך שתכיל 0.5 מיקרוליטר של בדיקת הפריימר, חמישה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר לביטוי גנים, שני מיקרוליטרים של מים ו-2.5 מיקרוליטר של cDNA.פיפטה דגימות ה-RNA לתוך צלחת qPCR של 96 בארות. דגרו מבחני בדיקת פריימר עבור גנים שונים של שעון מולקולרי וכללו בדיקה לבקרה אנדוגנית, וטענו אותה למכונת qPCR כדי לקבוע את הכימות היחסי של רמות ה-mRNA. בתוך מערך הניסוי, בחר כמות, עקומה סטנדרטית יחסית וכימיה של TaqMan.לאחר מכן, שנה את נפח התגובה ל -10 מיקרוליטר. הזן את המידע הרלוונטי בפריסת הצלחת. qPCR בוצע על RNA מבודד כדי להעריך את רמות הביטוי היחסיות של גני השעון המולקולרי, שעון, Per2, Dbp ו-Rev-erb אלפא.לאחר אתגר PAMP, רמות ביטוי השעון לא היו שונות באופן משמעותי בהשוואה לתאי הביקורת. רמות הביטוי של Per2 היו גבוהות משמעותית בתאים מאותגרים עם LPS ו-ODN1826 בהשוואה לבקרות ללא עוררין. LPS היה ה-PAMP היחיד ששינה את ביטוי האלפא של Rev-erb מכיוון שרמות ה-mRNA היו נמוכות משמעותית מאשר בבקרות הבלתי מעורערות.רמות mRNA נמוכות משמעותית נצפו עבור Dbp לאחר אתגר עם כל אחד מה-PAMPs בהשוואה לביקורת. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש במולקולות שאינן PAMPs כדי להעריך את השפעתן על השעון המולקולרי בטחול.

the-use-mouse-splenocytes-to-assess-pathogen-associated-molecular

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

מקור: מדנספצ'ר, ג'. ה. ופסלר, מ. ב. שיטה לא פולשנית וטכנית לא אינטנסיבית לאינדוקציה ופנוטיפ של דלקת ריאות חיידקית ניסיונית בעכברים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים את תהליך כימות העומס החיידקי בטחול של עכבר נגוע כדי להעריך את חומרת ההדבקה. הטחול ההומוגני מדולל ומצופה באופן סדרתי כדי לקבוע את העומס הכולל של החיידקים. הנתונים שהתקבלו מספקים תובנות על אינטראקציות בין מארח לפתוגן בתוך רקמת מערכת הרכבת.

הערכת עומס חיידקים בטחול העכבר לצורך מחקרי זיהום

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

העברת לימפוציטים bm12 למושתל C57BL/6 היא מודל מבוסס של זאבת אדמנתית מערכתית. כאן אנו מתארים כיצד ליזום מחלה באמצעות מודל זה וכיצד לאפיין תאי עזר זקיקי T, תאי B במרכז הנבט ותאי פלזמה על ידי ציטומטריית זרימה.

דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6

כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

פרוטוקול זה מתאר כימות של מטרות ציטוקין מרובות בו-זמנית בתרביות רקמה supernatants שנאסף splenocytes העכבר מגורה באמצעות פלטפורמה המבוססת על חומרים חרוז מולטיפלקס cytometer זרימה.

מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה

טכנולוגיה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית פיתח ' מאפשר ניטור לטווח ארוך של שעתוק של גנים שעון היממה העל-תצלובתי (SCN) לנוע בחופשיות עכברים בזמן אמת, ברזולוציה הטמפורלית גבוהה.

אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים

MALT1 מסדיר מולדת חסינות אך איך זה מתרחש נשאר מעורפל. השתמשנו החומר המדכא paracaspase סלקטיבית MALT1 הטכנולוגי-827 לפענח את התרומה של MALT1 איתות מולדת במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי כמו אגרה או C-type, הוכחת MALT1 מסדיר את הייצור של תאים מיאלואידים ציטוקינים, ויוצאת של קולטני לקטין דמוי C-type, באופן סלקטיבי.

תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

כאן, אנו מתארים מיקוד פשוט שיטה הדמיה כדי להמחיש את הלוקליזציה באתרו של תאים הפרשה את ציטוקינים אינטרפרון גמא באיברי הלימפה משני מוראין. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור ויזואליזציה של ציטוקינים אחרים ברקמות שונות.

הדמיה של אינטרפרון באתרו הפקת גמא בטחול העכבר בעקבות זיהום יסטריה חיידקי

חקור את השפעת תבניות מולקולריות קשורות לפתוגן על ביטוי גני השעון בתאי טחול עכברים. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעות רכיבים מיקרוביאליים על השעון המולקולרי במחקר אימונולוגיה וכרונוביולוגיה.

השימוש העכבר Splenocytes כדי להעריך את ההשפעה הקשורים הפתוגן התבנית המולקולרית על ביטוי גנים שעון

גלה סרטונים נוספים