השימוש העכבר Splenocytes כדי להעריך את ההשפעה הקשורים הפתוגן התבנית המולקולרית על ביטוי גנים שעון

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והכרונוביולוגיה, כגון כיצד רכיבים מיקרוביאליים משנים את השעון המולקולרי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא קלה לביצוע, מעריכים את ההשפעות של רכיבים מיקרוביאליים שונים על השעון המולקולרי, והיא ניתנת לשחזור רב. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הכינו מדיום תרבית על ידי הוספת סרום בקר עוברי ל-RPMI 1640 לריכוז סופי של 10%הכינו 10 מיליליטר של מדיום אתגר עבור כל אחד מה-PAMPS שייבדקו בצינורות של 50 מיליליטר על ידי הוספת מדיום תרבית PAMP הרשום.

מרססים תא מטען עכבר שהוכן בעבר באתנול 70% ומנגבים אותו במגבת נייר. הנח את העכבר על גבו, מוטה מעט על צדו הימני. לאחר מכן, חתכו את הפרווה באמצעות מספריים מנתחים לאורך הצד השמאלי של העכבר, בערך באמצע הדרך בין הרגליים הקדמיות והאחוריות.

בעזרת מלקחיים תפסו את הצפק ובצעו חתך בזהירות מבלי לפגוע בטחול. הסר את הטחול בעזרת מלקחיים והנח אותו בצינור סטרילי של 50 מיליליטר המכיל כ -10 מיליליטר של מצע תרבית על קרח. לאחר מכן העבירו את הטחול עם שני מיליליטר של מדיום תרבית לצלחת פטרי קטנה וסטרילית.

הומוגניזציה של הטחול על ידי טחינתו בין החלק החלבי של שתי מגלשות חלביות סטריליות. לאחר ההומוגניות היסודית, פיפטה את שני המיליליטר של מדיום התרבות המכיל את הטחול דרך מסננת תאי ניילון של 40 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר. הוסף שמונה מיליליטר של מדיום תרבית קרה לכל אחד מצינורות 50 מיליליטר המכילים את הטחול, לנפח כולל של 10 מיליליטר לצינור.

קבע את מספר התאים למיליליטר באמצעות המוציטומטר. הוסף בערך 10 פעמים 10 לתאים השישיים לבאר לצלחות תרבית של שש בארות. לאחר הוספת התאים, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום תרבית או שלושה מיליליטר של מדיום אתגר לתאים.

לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש שעות. מגרדים את התאים מתחתית הבאר באמצעות קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר המחובר למיקרופיפטה P1000. עם אותו קצה פיפטה, העבירו את המדיום המכיל את התאים לצינור של 15 מיליליטר.

גלולה את התאים ב -167 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט ושטוף את כדור התא עם חמישה מיליליטר PBS. לאחר גלולת התאים בפעם השנייה ב-167 פעמים גרם למשך חמש דקות, הסר את הסופרנטנט והוסף 600 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכדור התא.

בודד RNA מטחול באמצעות ערכת מיצוי RNA בהתאם להוראות היצרן ובצע את עיכול ה-DNA האופציונלי על העמודה. לסנתז cDNA עבור כל אחת מהדגימות באמצעות ערכת השעתוק ההפוך בהתאם להוראות היצרן. השתמש ב-10 מיקרוליטר RNA עבור כל אחת מהדגימות בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר.

משוך mRNA מכמה דגימות בקרה לתוך צינור של 0.5 מיליליטר כדי להכין את ה-cDNA שישמש לעקומה הסטנדרטית בעת ביצוע PCR כמותי. הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר טרנסקריפטאז הפוכה פי 2. בסיום השעתוק ההפוך, הוסף 10 מיקרוליטר מים לצינור התגובה, המשמש כריכוז ההתחלה בסדרת הדילול לעקומה הסטנדרטית.

בצע סדרת דילול פי עשרה על ידי הוספת 45 מיקרוליטר מים לארבעה צינורות של 0.5 מיליליטר המיועדים 10 למינוס 1, 10 למינוס שתיים, 10 למינוס שלוש ו-10 למינוס ארבע. הוסף חמישה מיקרוליטר מריכוז ההתחלה אחד לצינור השני, 10 למינוס אחד, באמצעות מיקרו-פיפטר P20. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים ואז מעבירים חמישה מיקרוליטר מהצינור 10 למינוס אחד לצינור המיועד 10 לצינור מינוס שתיים ומערבבים.

מעבירים חמישה מיקרוליטר באמצעות מיקרופיפטה P20 מהצינור 10 למינוס שתיים לתוך הצינור המיועד 10 למינוס שלוש ומערבבים. לבסוף, העבירו חמישה מיקרוליטר באמצעות מיקרו-פיפטר P20 מהצינור 10 למינוס שלוש לתוך הצינור המיועד 10 למינוס ארבע וערבבו. הכן את התגובה כך שתכיל 0.5 מיקרוליטר של בדיקת הפריימר, חמישה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר לביטוי גנים, שני מיקרוליטרים של מים ו-2.5 מיקרוליטר של cDNA.

פיפטה דגימות ה-RNA לתוך צלחת qPCR של 96 בארות. דגרו מבחני בדיקת פריימר עבור גנים שונים של שעון מולקולרי וכללו בדיקה לבקרה אנדוגנית, וטענו אותה למכונת qPCR כדי לקבוע את הכימות היחסי של רמות ה-mRNA. בתוך מערך הניסוי, בחר כמות, עקומה סטנדרטית יחסית וכימיה של TaqMan.

לאחר מכן, שנה את נפח התגובה ל -10 מיקרוליטר. הזן את המידע הרלוונטי בפריסת הצלחת. qPCR בוצע על RNA מבודד כדי להעריך את רמות הביטוי היחסיות של גני השעון המולקולרי, שעון, Per2, Dbp ו-Rev-erb אלפא.

לאחר אתגר PAMP, רמות ביטוי השעון לא היו שונות באופן משמעותי בהשוואה לתאי הביקורת. רמות הביטוי של Per2 היו גבוהות משמעותית בתאים מאותגרים עם LPS ו-ODN1826 בהשוואה לבקרות ללא עוררין. LPS היה ה-PAMP היחיד ששינה את ביטוי האלפא של Rev-erb מכיוון שרמות ה-mRNA היו נמוכות משמעותית מאשר בבקרות הבלתי מעורערות.

רמות mRNA נמוכות משמעותית נצפו עבור Dbp לאחר אתגר עם כל אחד מה-PAMPs בהשוואה לביקורת. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש במולקולות שאינן PAMPs כדי להעריך את השפעתן על השעון המולקולרי בטחול.