מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-רפואי. כמו השימוש בדג זברה ליצירת מודלים גנטיים של מחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת זיהוי מוקדם של גנוטיפים בשיטה פשוטה בעלת תפוקה גבוהה.

למרות ששיטה זו יכולה לאפשר מחקר מקיף באמצעות מודלים של דג זברה של אפילפסיה גנטית, ניתן ליישם אותה גם על מודלים אחרים של מחלות גנטיות וכל סוג של מחקר מוטציות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיתקל בקשיים מכיוון שחתך סנפיר הזחל חייב להתבצע במדויק בתוך מרווח הפיגמנט של הזנב. לפני תחילת גזירת הסנפיר של זחלי דג הזברה, הכינו את משטח החיתוך.

הדביקו פיסת סרט חיטוי על פני המשטח הפנימי של מכסה צלחת פטרי בגודל תשעה סנטימטרים ומקמו את המכסה מתחת למיקרוסקופ סטריאו. הכן קצה פיפטה P1000 לאירוח זחל של שלושה dpf במתח מינימלי, על ידי חיתוך קצה קצה הפיפטה לקוטר של שני מילימטרים. מניחים שלושה עד חמישה ימים לאחר ההפריה, או dpf, זחלי דג הזברה בצלחת פטרי ומרדימים בטריקאין של 1.5 מילי-מולרית במדיום עוברי 1x E3.

בעזרת המיקרו פיפטה P1000 ששונה, הרם והרדים את זחל דג הזברה והנח אותו על סרט החיטוי הממוקם על מכסה צלחת הפטרי. הסר תמיסת טריקאין עודפת המקיפה את הזחל. האזור צריך להיות יבש ככל האפשר כדי לחתוך ולהרים את הסנפיר בהצלחה, אך עדיין רטוב כדי להבטיח הישרדות.

כדי למנוע דימום ולהבטיח את הישרדות הזחל במהלך גזירת הסנפיר, החתך חייב להתרחש בתוך פער הפיגמנט. דיסטלי לגבול זרימת הדם, כפי שמצוין בתמונה זו. בעבודה תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש באזמל מיקרו כדי לחתוך את סנפיר הזנב.

במהלך החתך, הפעל לחץ יציב אך עדין כלפי מטה כדי למנוע נזק לנוטוכורד. דמיין את הסנפיר החתוך מתחת למיקרוסקופ, ומקם את היצירה על גבי קצה להב המיקרו אזמל. הנח את אזמל המיקרו המכיל את הסנפיר על פני פיסת נייר פילטר קטנה.

בשל נוכחותם של מלנוציטים ברקמה המועברת, הסנפיר מופיע כנקודה שחורה קטנה. כדי להבטיח מיצוי DNA מוצלח, חשוב להבחין בנקודה שחורה המסמנת את מיקום הסנפיר על נייר הסינון לפני שתמשיך בפרוטוקול. בעזרת מספריים ופינצטה, העבירו את נייר הסינון המכיל את הסנפיר לבאר של צלחת PCR של 96 בארות המכילה 25 מיקרוליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד של 50 מילי-מולרי.

לאחר מכן, הכינו צלחת תרבית רקמות תחתונה שטוחה של 96 בארות, ומספור הבארות לפי התווית של לוחית ה-PCR. בעזרת פיפטת P1000 שונה, מלאה ב-200 מיקרוליטר של מדיום עוברי e3 טרי, אוספים בזהירות את זחל דג הזברה בלחץ עדין. חלק את הזחל בצלחת 96 בארות באותו מספר באר כמו לוחית ה-PCR.

ודא שנייר הסינון המכיל את הסנפיר שקוע היטב בתמיסה. כדי למנוע זיהום צולב בין כל חתך, נקו את להב המיקרו אזמל והפינצטה על ידי טבילה בתמיסת אתנול של 70%. נגב את הלהב עם נייר נקי או מגבון.

לאחר שכל הזחלים נחתכו, אחסן את הזחלים בצלחת של 96 בארות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד לזיהוי הגנוטיפים שלהם. התחל הליך זה על ידי איטום לוחית ה-PCR בת 96 הבארות המכילה את חתיכות הסנפיר וצנטריפוגה של הדגימות ב-1000 פעמים G למשך דקה אחת. כדי לוודא שכל ניירות הסינון שקועים בתמיסת הנתרן הידרוקסיד.

לליזה של רקמות, מחממים את הדגימות במחזור תרמי בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן מצננים לארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף שישה מיקרוליטרים של 500 מילי-מולרי tris-HCL pH8.0 לכל דגימה.

מערבולת הדגימות. צנטריפוגה קצרה של הצלחת ב -1500 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כדי לחלץ DNA גנומי בשיטה זו, מהדקים את הסנפיר כפי שהודגם קודם לכן, אך מוסיפים את נייר הסינון עם הסנפיר הקצוץ לבאר של צלחת PCR של 96 בארות המכילה 30 מיקרוליטר של שרף כלאט 5%.

לאחר שכל חלקי הסנפיר נחתכו, אטמו את לוחית ה-PCR בת 96 הבארות וצנטריפוגה קצרה את הדגימות כדי לוודא שכל ניירות הסינון שקועים בשרף הכלאט. מחממים את הדגימות במחזור תרמי בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן מקררים לארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה קצרה של הדגימות כדי לגלול את חרוזי השרף ולהשיג את ה-DNA בתרחיף.

בדיקת PCR מרובה תאפשר הבחנה בין מוטציות הומוזיגוטיות, הטרוזיגוט וזחלים מסוג בר. הגדר את תגובת ה-PCR כמפורט בפרוטוקול הטקסט. בצע את תגובות ה-PCR במחזור תרמי של 96 בארות.

הכן ג'ל אגרוז 1% במאגר נתרן בוראט, מוכתם באדום ג'ל 1x. כדי להקל על התהליך, במידת האפשר, השתמש במערכת ג'ל התואמת לפיפטות רב-ערוציות כדי לאפשר יכולות תפוקה גבוהות יותר על ידי הפחתת זמן טעינת הדגימות. הפעל את הג'ל במאגר נתרן בוראט 1x ב-250 וולט למשך 15 דקות.

דמיינו את הג'ל באור אולטרה סגול כדי לאפשר הבחנה בין הגנוטיפים השונים. התחל בדיקה זו על ידי הכנת שני ג'לים של 12% פוליאקרילאמיד באמצעות לוחית המרווח של 1.5 מילימטר ו-15 מסרקי הדגימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש במערכת אלקטרופורזה אנכית ובמאגר TBE 1x כמאגר הפועל.

לאחר ביצוע PCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש לחמם את מוצרי ה-PCR ב-94 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן לקרר ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. טען 10 מיקרוליטר לכל דגימת PCR, ושמונה מיקרוליטר של סמן משקל מולקולרי. הפעל את הג'ל ב -150 וולט למשך שעה, או עד שסמן המשקל המולקולרי כמעט מגיע לקו הרגל של לוחית הזכוכית.

דמיינו את הג'ל באור אולטרה סגול כדי לאפשר הבחנה בין הגנוטיפים השונים. פרוטוקול זה שימש לגנוטיפ של צאצאים של צלב הטרוזיגוט, שבו לאילאל המוטנטי יש החדרה של 5 זוגות בסיסים באקסון הציפוי הראשון של הגן aldh7a1. התוצאה הצפויה מהגברת PCR הן מסוג בר והן של איללים מוטנטיים היא מגבר 434 BP.

פס של 293 BP נובע מהגברה של האיליאל המוטנטי, ופס של 195 BP מתקבל עבור איליאל מסוג פראי. ניתוח תגובות PCR על ג'ל נתרן בוראט 1% אגרוז זיהה גנוטיפים מסוג בר בנתיבים 2 ו-6, גנוטיפים הטרוזיגוטיים בנתיבים 3, 4 ו-5, וגנוטיפ מוטנטי הומוזיגוטי בנתיב 1. מוטציות שונות שבהן גנוטיפ על ידי מבחן התכה הטרודופלקס

האיללים המוטנטיים plpbpot101 ו-plpbpot102 של הגן plpbp מאפשרים כל אחד להזזת מסגרת ולקודון עצירה מוקדמת. לאחר דנטורציה וחישול, שברי ה-PCR עבור בעלי חיים הטרוזיגוטיים יכילו DNA הטרודופלקס והומודופלקס המופרדים בקלות ומומחשים באמצעות אלקטרופורזות ג'ל פוליאקרילאמיד. גנוטיפים מוטנטיים הטרוזיגוטיים מורכבים זוהו בנתיבים 2, 4 ו-8, גנוטיפים הטרוזיגוטיים בנתיבים 3, 6, 7, 9 ו-10, וגנוטיפ מסוג בר בנתיב חמש.

לאחר השליטה, חיתוך סנפיר 96 זחלים בטכניקה זו יכול להיעשות תוך פחות משעה, אם מבוצע כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו איגום של זחלי דג זברה מאותו גנוטיפ למיצוי רקמות, ולהזמין לענות על שאלות נוספות, כגון חקירת סמנים ביולוגיים ומודלים של מחלות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום המודלים של אפילפסיה מטבולית כדי לחקור את הפיזיולוגיה של נתיב המחלה בדג הזברה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע גנוטיפ נכון של זחלי דג זברה בני שלושה ימים על ידי מיקרו-דיסקציה של סנפיר זנב.