זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הרגולציה התמלולית, כגון תפקידן של אינטראקציות כרומטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת לכידה משוחדת יחסית של האינטראקציות עבור לוקוס של עניין. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך אינטראקציות משפר מקדם, זה יכול להיות מיושם גם כדי לזהות סוגים אחרים של אינטראקציות כרומטין.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שלוקח כמה ימים לפרוטוקול, ועיצוב פריימר דורש ניסוי וטעייה וכיוון פריימר לא טיפוסי. כדי לשמר אינטראקציות כרומטין בתאים של בחירה, לחצות לקשר אותם על ידי הוספת 9.5 מיליליטר של 1% מיקרוסקופ אלקטרונים כיתה פורמלדהיד ב PBS לכל 10 מיליון תאים. הדגירה את התאים תוך נדנדה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

מעבירים את צינורות התגובה לקרח כדי להתרוות את תגובת הקישור הצולבת ומוסיפים קרח קר גליצין טוחן אחד לריכוז סופי של 0.125 טוחן ומערבבים על ידי היפוך עדין. לאחר צנטריפוגה ושטיפת התאים על פי פרוטוקול הטקסט, להשעות את גלולה ב 125 microliters של EDTA מילימולרי עם 0.5% SDS ואחד X מעכבי פרוטאז. דגירה ההשעיה התא על קרח במשך 10 דקות.

כדי לוודא כי תריס התא הושלם, לערבב שישה microliters של התאים עם שישה microliters של כחול טריפאן על שקופית מיקרוסקופ לכסות עם להחליק כיסוי. הצג מתחת למיקרוסקופ כדי לראות את פנים התאים הכחולים, ותאים ללא מעצורים לבנים. לעיכול ההגבלה הראשון להוסיף 30 microliters של 10 X הגבלת מאגר אנזימים, ו 27 microliters של 20% טריטון X-100 כדי מתלה התא ולהתאים את הנפח הכולל ל 300 microliters עם מים.

הסר aliquot 15 microliter ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס כשליטה מעוכלת. לתערובת התגובה הנותרת מוסיפים 200 איחודים של אנזים הגבלה אחד. דגירה לילה בטמפרטורה המתאימה לאנזים בבלוק חימום רועד עם תסיסה של 900 סל"ד.

למחרת, להוסיף 200 יחידות נוספות של האנזים ולהמשיך את הדגירה לילה. הסר aliquot 15 microliter ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס כשליטה מתעכלת. כדי לקבוע את יעילות העיכול להוסיף 82.5 microliters של 10 מילימולרים טריס-HCl, pH 7.5, לכל פקד מעוכל ומתעכל.

מוסיפים 2.5 מיקרוליטרים של פרוטאינאז K ודגירה במשך שעה אחת ב 65 מעלות צלזיוס כדי להפוך את הקישור צלב פורמלדהיד. כדי לבודד את הדנ"א המתעכל, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פנול כלורופורם לצינור. מערבבים על ידי מספר היפוכים מהירים כדי להסיר זיהום חלבון שיורית.

צנטריפוגה ב 16, 100 G של בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, להעביר את השלב המים לצינור חדש. מוסיפים נתרן אצטט, גליקוגן ו-100% אתנול לצינור ומערבבים בעדינות על ידי היפוך.

דגירה במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה כדי לזרז את ה-DNA. צנטריפוגה הצינור ב 16, 100 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 500 microliters של 70% אתנול לשטוף את גלולת ה-DNA.

צנטריפוגה ב 16, 100 G של בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הסרת האוויר העל טבעי לייבש את גלולה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות כדי להסיר אתנול שיורית. להשעות מחדש את גלולה מיובשת 50 microliters גרעין מים חופשיים ולהמשיך לקבוע יעילות העיכול על ידי QPCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי להתכונן קשירה, לחמם ולהפעיל את האנזים הגבלה על ידי דגירה של הצינור במשך 20 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להעביר את התוכן של הצינור לצינור חרוט 50 מיליליטר, ולהוסיף מים ללא גרעין, 10 X חיץ ligase, ו T4 DNA ligase. מערבבים בעדינות על ידי מערבולת, ודגירה לילה ב 16 מעלות צלזיוס ולהמשיך כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי להפוך את הקישור הצלב להוסיף 15 microliters של proteinase K ודגירה לילה ב 65 מעלות צלזיוס. למחרת מוסיפים 30 מיקרוליטרים של RNase A, ו דגירה ב 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להמשיך עם בידוד כרומטין, להוסיף שבעה מיליליטר של פנול כלורופורם ומערבבים על ידי מספר היפוכים מהירים.

צנטריפוגה הצינור ב 3, 300 G של בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את השלב הממימי לצינור חדש של 50 מיליליטר ומוסיפים מים נטולי גרעין, שלושה נתרן אצטט טוחנת, גליקוגן ו-100% אתנול. מערבבים את התוכן ואת הדגירה ב 80 מעלות צלזיוס שלילי במשך שעה אחת.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה הצינור ב 3, 900 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר את supernatant, ולאחר מכן לשטוף את גלולה עם 10 מיליליטר של קרח קר 70% אתנול. צנטריפוגה ב3, 300 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.

מוציאים את העל-טבעי, ומייבשים לזמן קצר את גלולת הכדור בטמפרטורת החדר. ממיסים את גלולה ב 150 microliters של 10 מילימולרים טריס-HCl pH 7.5 ב 37 מעלות צלזיוס. יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס שליליות או להמשיך בעיכול הגבלה שני, קשירה וטיהור דנ"א כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר טיהור DNA, לבצע QPCR באמצעות פריימרים PCR הפוכים וצבעי סייבר ו ROX כדי לקבוע את מספר מחזורי הגברה עבור הגברה PCR הפוכה של רצפי אינטראקציה לא ידוע כמתואר בטקסט. כדי להכין דנ"א לרצף, חתוך את רצפי הפיתיון עם עיכול הגבלה שלישי על ידי עיכול מיקרוגרם אחד של מוצר מטוהר של PCR הפוך, כמו גם צג אנזים הגבלה. הפעל את אנזים ההגבלה המתעכל, או צג RE, על ג'ל אגרוז של ריכוז המתאים לרסיסים הצפויים.

לאחר יעילות העיכול נקבע על ידי אלקטרופורזה ג'ל, להמשיך עם טיהור מוצר PCR הפוכה והכנת ספריית רצף, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עיכול הגבלה שלישי חשוב בפרוטוקול זה עבור רצף הדור הבא של לכידת אישור כרומוזום מעגלי. עיכול זה חותך את רצפי פיתיון אשר יכול להקל על זיהוי של אטרקציות כרומטין.

אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של צג RE מתעכל הצביעה על עיכול מספיק של מוצר PCR ההופכי מתעכל במקביל. לאחר סיום ארבע קריאות רצף C נחתכו ומופו גנום התייחסות אנושי hg38, באמצעות חבילת תוכנה BWA. רוב קריאות ליישר באתרי הגבלה HindiIII או CviQ1I סמוך לאתרים HindiIII כצפוי.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לוודא התאים שלך הם lysed ואת הכרומטין מתעכל מספיק. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו משקעים חיסוניים כרומטין או CHIP, ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כגון זיהוי גורמי שעתוק המעורבים באינטראקציות כרומטין. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הכרומטין לחקור רשתות רגולטוריות פיזיות.