Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח לגבי האופן שבו תקשורת בין-תאית בין סוגי תאים עצביים אנושיים מרובים תורמת להיווצרות ותפקוד מעגלים סינפטיים. טכניקה זו מייצרת במהירות ובשיטתיות ספירות קוקולטורה תלת מימדיות של אסטרוציטים ונוירונים בוגרים מבחינה תפקודית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. ניתן להשתמש בהם לחקירה ניסויית קפדנית.

יכולת השחזור והמדרגיות של פרוטוקול זה היא אלטרנטיבה מוגדרת לטכנולוגיות האורגנואידים המתפתחות. אלה מראים הבטחה לפיתוח תרופות חדשות וטיפול בהשתלת תאים כדי לקדם התחדשות עצבית לאחר פציעה או מחלה. התחל בהכנסת אשכולות של HPSCs בשני מיליליטר של מדיום HPSC המכיל את מעכב הרו-קינאז Y-27632 בכל באר של צלחת שש בארות מצופה ECM.

שמור על תאי הגזע עד שהם מתכנסים בכ-50%, ואז שנה את המדיום למדיום עצבי המכיל SB431542 ו-DMH1 כדי לקדם אינדוקציה עצבית. כאשר התאים הם בערך 95% מתלכדים, חלקו כל באר אחת עד שש לבארות חדשות מצופות ECM. ביום ה-14 יש לנתק את התאים עם תמיסת ניתוק, ולהעביר את תכולת כל באר לבקבוק T25 לא מצופה עם מדיום המכיל Y-27632 כדי לקדם את היווצרות האגרגטים.

כדי ליצור אבות אסטרוציטים ואסטרוציטים באגרגטים תלת-ממדיים שנוצרו באופן ספונטני, עברו לתווך עצבי המכיל EGF ו-FGF2, והזינו כל שלושה עד ארבעה ימים עד שזהות האסטרוציטים תאושר לאחר ארבעה עד שישה חודשים. כברירת מחדל, פרוטוקול זה מייצר אסטרוציטים בקליפת המוח הגבית. עם זאת, ניתן לציין תת-סוגים של אסטרוציטים באופן אזורי על ידי הוספת מורפוגנים דפוסיים, אם רוצים.

פעם בשבוע, כאשר מופיעים מרכזים כהים, אספו את הכדורים על ידי צנטריפוגה, ואז נתקו בעדינות את אגרגטי ה-H-astro עם תמיסת ניתוק. צבעו מחדש רק את הכדורים שאינם מתחברים באופן ספונטני כדי למנוע מעבר של תאים שאינם CNS ולא עצביים. לאחר ארבעה עד שישה חודשים של התרחבות, אשר את זהות התא בהקפאה ובמדיום שימור בהקפאה לפי הוראות היצרן, או השתמש מיד לניסויים.

ליצירת אבות עצביים לא טרנסגניים בנוירונים, או נוירוני H, זרעו אבות עצביים שמקורם ב-HPSC ביום 14 לתוך צלחות שש בארות מצופות ECM עם שני מיליליטר של מדיום עצבי ו-Y-27632 לבאר. אם עובדים עם iNeurons המושרים על ידי דוקסיציקלין, הוסף מדיום עצבי המכיל דוקסיציקלין כאשר התאים מתכנסים בכ-35% כדי לגרום להתמיינות ולהפעיל ביטוי גנים. לאחר יומיים, האכילו קווים טרנסגניים ולא טרנסגניים בשני מיליליטר של מדיה עצבית לבאר ביום.

המשך עד שהתאים מוכנים להתרומם במפגש של 70%. עבור תרבויות משותפות, ראשית נתק בעדינות H-astros מאגרגטים תלת מימדיים עם פתרון ניתוק. לאחר מכן המשך לנתק נוירוני H, או iNeurons, משכבה חד-ממדית דו-ממדית.

ראשית, הסר את המדיום מצלחת שש הבארות, והוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק לכל באר המכילה תרבויות חד שכבתיות. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, הוסף בעדינות שניים עד שלושה מיליליטר של מדיום DMEM-F12 כדי להסיר את התאים המחוברים.

לאחר מכן, אספו את התאים במדיום בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב-300 פעמים G למשך דקה אחת. שאפו את הסופרנטנט, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום טרי, ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות עם מיקרו פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להשיג תרחיף חד-תאי. ספרו כל סוג תא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.

הוסף את היחס הרצוי של נוירוני H ו-H מנותקים, או iNeurons, בנפח כולל של שני מיליליטר לכל באר של מיקרו-לוחית. צנטריפוגה את הצלחת ב 100 פעמים G למשך שלוש דקות, והחזירו לחממה למשך יומיים. לאחר יום אחד, מיקרוספירות צפופות היו אמורות להיווצר בצלחת.

השתמש במיקרו פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להסיר בעדינות כדורים מבארות המיקרו. הפעל קלות כוח על תחתית בארות מיקרו עם מדיום כדי להסיר כדורים דבוקים נוספים. לאחר איסוף כל הכדורים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, אפשר להתיישב.

לאחר מכן שטפו את הכדורים על ידי שאיבת המדיום הישן, ואז הוסיפו לפחות שני מיליליטר של מדיום טרי. הוסף את הכדורים לבקבוק ספינר המכיל 50 עד 60 מיליליטר של מדיום. מניחים את הבקבוק בחממה על צלחת ערבוב מגנטית המכוונת ל-60 סל"ד.

יש צורך במינימום שלושה שבועות בתרבית להיווצרות סינפסות. התחל בציפוי פני השטח של כל מערך רב-אלקטרודות, או MEA, במיליליטר אחד של פוליאורניתין כדי להפוך את פני השטח להידרופיליים, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. לאחר הדגירה, הסר את הפוליאורניתין ושטוף את פני השטח של כל MEA במים נטולי יונים.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מטריצה חוץ-תאית, וחזור לחממה למשך ארבע שעות לפחות. כשהוא מוכן, הסר את המטריצה החוץ-תאית, ולאחר מכן החל את הכדורים ב-1.5 מיליליטר של מדיום על פני השטח של MEA, וודא שהכדורים ממוקמים על גבי מערך האלקטרודות. מניחים להיצמד למשך יומיים.

כדי למדוד את הפעילות החשמלית של כדורים עצביים, מקם את ה-MEA על במת ראש מבוקרת טמפרטורה. השתמש במסנן מעביר גבוה של חמישה הרץ, ובמסנן מעביר נמוך של 200 הרץ, וסף ספייק של פי חמישה סטיית תקן, כדי לתעד פעילות חשמלית ספונטנית. שמור נתונים גולמיים, כולל תדירות ספייק ומשרעת לניתוח סטטיסטי.

סמני חלבון מוגבלים מסוג תאים עצביים, כגון MAP2 לנוירונים ו-GFAP לאסטרוציטים, מדגימים חזותית את הסידור והבשלות המפוזרים באופן שווה של אסטרוציטים בתאי עצב בתוך כדורים תלת מימדיים. הקרנה מקסימלית של מורפולוגיה והסתעפות של אסטרוציטים מוצגת בכדור תלת מימדי מייצג עם H-astros המסומן בדלילות עם GFP קשור לממברנה. סמני H-astros בוגרים מבטאים כולל GFAP.

למרות ש-iNeurons מבטאים חלבונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, כפי שמוצג בתמונה משמאל, הצפיפות הסינפטית מוגברת משמעותית על ידי נוכחות H-astros וקוקולטורה. במהלך ההקלטות, כדורים בריאים של iNeurons המונחים על MEAs יעוררו באופן ספונטני קפיצות מתח גדולות מ-40 מיקרו-וולט עם תדרי ירי עקביים. ספירות קוקולטורה מציגות קישוריות רשת גדולה יותר עם נוכחות H-astros, וכתוצאה מכך עלייה בפרצי רשת סינכרוניים של קוצים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הדמיית סידן על מנת למדוד את התגובה הפיזיולוגית של אסטרוציטים לפעילות סינפטית. בנוסף, ניתן לבצע השתלה במודלים של בעלי חיים כדי לחקור קישוריות עם מעגלים סינפטיים קיימים. על ידי ביצוע גישה ביו-הנדסית זו, ניתן לשלב ביו-חומרים חוץ-תאיים וסוגי תאים נוספים כגון אוליגודנדרוציטים, מיקרוגליאן ותאי אתל ביחסים ספציפיים על מנת למדל את האיתות המורכב המתרחש במוח.