בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא
29 ביולי 2018
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה micropipette ישירות להחיל כוח מבוקר את הגרעין בתא החי. Assay הזה מאפשר חקירת תכונות מכניות הגרעין בתא חי, חסיד.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המכניקה הגרעינית. לדוגמה, מהו הכוח הנדרש כדי לעוות את הגרעין בתא? מהן התרומות של רכיבים סלולריים וגרעיניים לעמידות גרעינית לעיוותים?
או, האם צימוד גרעיני עם מבנים תאיים משתנה בהתאם לסוג התא? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לנו להפעיל כוח בדיקה כדי לעוות את הגרעין הציטו-שלד המשולב בתא דבק חי. למרות ששיטה זו שימשה כדי לספק תובנה לגבי התכונות המכניות הגרעיניות בתאי NIH-3T3, ניתן ליישם אותה גם על כל סוג תא דבק, כגון בדיקת תכונות מכניות גרעיניות בתאים פרוגריאליים של האצ'ינסון-גילפורד.
כדי להתחיל בהליך זה, מצפים צלחת תחתית זכוכית 35 מילימטר ב -5 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין. לאחר מכן, תרבית את תאי הפיברובלסטים NIH 3T3 ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר תורם ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין על הצלחת המצופה ב-37 מעלות צלזיוס עד למפגש הרצוי. מיד לפני הניסוי יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן שטיפה אחת עם מצע גידול מלא.
לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום גידול שלם לכלי תחתית זכוכית. בהליך זה, הפעל את המיקרו-מזרק. בעזרת טפטפת שמן טבילה, מרחו טיפת שמן טבילה על עדשת האובייקטיב.
לאחר מכן, מהדקים את המנה בחוזקה למחזיק הכלים ומעמיסים את מחזיק הכלים על הבמה. שימו לב כי יש לשמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לאורך כל הניסוי. לאחר מכן, התאם את גובה המטרה כדי להביא את התאים למיקוד.
הזיזו את שלב המיקרוסקופ כדי למצוא תא מעניין. בעזרת המיקרומניפולטור, העבר את מחזיק הפיפטה למצב הגבוה ביותר. לאחר מכן, טען את המיקרופיפטה עם קצה בקוטר 0.5 מיקרומטר על מחזיק הפיפטה.
לאחר מכן הרם את מישור המוקד האובייקטיבי מעל מישור A ואת החלק העליון של התא למישור B על ידי התאמת הבקרה העדינה. לאחר מכן, הגדר את המיקרומניפולטור למצב בקרה גס. הורידו את המיקרופיפטה באיטיות למישור B על ידי התבוננות בצללית של המיקרופיפטה עד שהמיקרופיפטה תגיע למיקוד מלא.
ברגע שקצה המיקרופיפטה נמצא בפוקוס, הגדר את המיקרומניפולטור לשליטה עדינה. לאחר מכן, הורד את המטרה למישור המשווני של התא והורד את המיקרופיפטה לכ-15 מיקרומטר מעל זה. הגדר את לחץ הפיצוי על המיקרו-מזרק ללחץ הרצוי.
המתן מספר שניות עד שהלחץ יתייצב. חשוב לבדוק אם קצה הפיפטה שבור או סתום, אחרת מדידת הכוח לא תהיה מדויקת. ודא שהמיקרופיפטה אינה סתומה באמצעות ההגדרה הנקייה בלוח המיקרומניפולטור וודא שבועות האוויר יוצאות מקצה המיקרופיפטה.
לאחר מכן, הכנס את קצה המיקרופיפטה לתא עד שהוא נוגע קלות במשטח הגרעין. צור אטימה בין קצה המיקרופיפטה לממברנה הגרעינית על ידי ניתוק צינור אספקת הלחץ ממערכת המיקרו-הזרקה, ובכך לפתוח את קצה המיקרופיפטה לאטמוספירה. שלב זה יוצר לחץ שלילי השווה ללחץ הפיצוי על פני השטח הגרעיני.
לאחר מכן, פתח את תוכנת איסוף התמונות. הגדר רכישת AVI עבור וידאו או רכישת ND עבור תמונות בתוכנת איסוף התמונות. לאחר מכן, עבור לערוץ ההדמיה הפלואורסצנטי המתאים והתחל בהדמיה.
הרחיקו את קצה המיקרופיפטה מגוף התא עד שהגרעין מתנתק מהמיקרופיפטה. איור זה מראה את הכפייה של גרעין פיברובלסטים של עכבר NIH 3T3. כאשר קצה המיקרופיפטה נע ימינה, הגרעין מתעוות ובסופו של דבר מתנתק מקצה המיקרופיפטה.
נראה כי אורך המתח של הגרעין גדל עם הגדלת כוח היניקה. הקצה הקדמי של הגרעין יוצר בליטה גרעינית והקצה האחורי נעקר ממקומו המקורי. אורך הבליטה גדול בהרבה מתזוזה של הקצה הנגרר, מה שמרמז על אינטגרציה הדוקה בין הגרעין לציטופלזמה שמסביב.
טווחי הזמן קצרים להרפיה של הקצה הקדמי הגרעיני והקצה האחורי הגרעיני. בדיקת כוח ישיר שימשה לקביעת תרומתם של מבנים תוך-גרעיניים ושלד ציטו-גרעיני לעמידות הגרעין בפני דפורמציה. תמונות פלואורסצנטיות הראו את שכבת העל של הגרעין לפני ואחרי במצב שצוין.
אמנם לא נמצאו הבדלים משמעותיים בעיוות או בתרגום גרעיני לאחר שיבוש F-actin או שיבוש מיקרו-צינוריות, אך הפחתת ביטוי המנטן באמצעות נוקדאון מבוסס siRNA הביאה לתרגום ועיוות גרעיניים גדולים יותר באופן משמעותי. זה מצביע על כך שחוטי הביניים של מנטן בפיברובלסטים הם האלמנט הציטו-שלד העיקרי שעזר לגרעין להתנגד לכוח מקומי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל כוח מבוקר וידוע על הגרעין בתא דבק חי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת במיקרופיפט להפעלת כוח מבוקר על הגרעין בתאים חיים, המאפשרת לבחון תכונות מכניות של הגרעין בתאים דבקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מכניקה תאית
- מכניקה גרעינית
- ביופיזיקה
רקע
- הבנת המכניקה הגרעינית היא קריטית לתהליכים ביולוגיים שונים.
- הכוח הנדרש לעיוות הגרעין יכול לספק תובנות לגבי התנהגות תאית.
- סוגי תאים שונים עשויים להפגין תגובות גרעיניות משתנות לעיוות.
- שיטה זו יושמה בעבר בתאי NIH-3T3.
מטרת המחקר
- לקביעת הכוח הדרוש לעיוות הגרעין בתאים חיים.
- לבחינת התרומות של רכיבים תאיים וגרעיניים לעמידות הגרעין.
- להערכת האופן שבו הצימוד הגרעיני למבנים תאיים משתנה בין סוגי תאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת מיקרופיפט להפעלת כוח על הגרעין.
- דימיג של תאים חיים לצפייה בעיוות גרעיני.
- ניתוח של תכונות מכניות של הגרעין בסוגים שונים של תאים נצמדים.
- מחקרים השוואתיים על קווי תאים שונים, כולל תאי Hutchinson-Gilford progerial.
תוצאות עיקריות
- השיטה מודדת בהצלחה עיוות גרעיני בתאים חיים.
- השגת תובנות לגבי התכונות המכניות של הגרעין.
- הדגמת שונות בתגובה הגרעינית בין סוגי תאים שונים.
- אספקת מסגרת למחקרים עתידיים במכניקה של הגרעין.
מסקנות
- שיטה זו של מיקרופיפטה היא כלי בעל ערך לחקר המכניקה הגרעינית.
- ניתן להחיל אותה על סוגים שונים של תאים דבקים מעבר ל-NIH-3T3.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לבחון את התנהגות הגרעין בהקשרים של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת התכונות המכניות של הגרעין היא קריטית להערכת תגובות תאיות למאמץ מכני במודלים של מחלות ובסריקת תרופות. גשש הכוח הישיר מאפשר מדידה כמותית של האינטגרציה בין הגרעין לשלד התא, ומספק תובנות מכניסטיות התומכות בתיקוף מטרות בפיברוזיס, סרטן ולמינופתיות. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי על ידי קישור מכניקה תת-תאית לתוצאות פנוטיפיות במערכות של תאים נצמדים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מודד את הכוח הדרוש לעיוות הגרעין, ומאפשר בחינה של תרומת השלד התאי לעמידות הגרעינית.
- ערך תפעולי: מזהה מרכיבי שלד תאי ספציפיים, כגון filaments ביניים מסוג menten, המודולים את היציבות המכנית של הגרעין.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת היפותזות על צימוד גרעין-שלד תאי במערכות רלוונטיות למחלות, כגון תאי Hutchinson-Gilford progerial.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר קריאות כמותיות של מאמץ אורך והעתקה המתואמות עם כוח השאיבה המופעל.
- שחזוריות: משתמש בלחץ מיקרופיפטה מבוקר בדיוק כדי להבטיח הפעלת כוח עקבית בין ניסויים שונים.
- יכולת התרחבות: תואם לדימות תאים חיים וניתן להסתגל לניתוח תוכן גבוה של דפורמציה גרעינית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי למודלים של פרוגריה ולמינופתיים אחרים להערכת שבירות גרעינית תחת עומס מכני.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מנתח את התרומות של F-actin, מיקרוטובוליים וסיבים בינוניים לעמידות הגרעין, ובכך מבהיר השפעות ספציפיות למסלול.
- המשכיות תרגומית: מאפשר השוואה של פנוטיפים מכניים של הגרעין בין סוגי תאים שונים כדי לסייע בבחירת מטרות פרה-קליניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
גשש הכוח הישיר משתלב בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת נתונים ביומכניים המנחים את תיקוף המטרה ופיתוח הבדיקה לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת היפותזות על אינטגרציה של השלד התאי הגרעיני באמצעות כימות עיוות גרעיני תחת כוח ידוע.
- סריקה: מפיקה מדידות כמותיות וסטנדרטיות של מאמץ גרעיני המתאימות להשוואת הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- אנליזה: מספקת נתוני כוח-העתקה המאפשרים השוואה סטטיסטית של פנוטיפים מכניים גרעיניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מכניקה גרעינית למודלים של מחלות, ובכך תומכת בהתאמת סמנים ביולוגיים במכנופתיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכת תכונות מכניות גרעיניות במגוון של קווי תאים דבקים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במכנوبيולוגיה גרעינית על ידי בידוד תרומות השלד התאי לנוקשות הגרעין.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הפעלת כוח באמצעות לחץ שאיבה של מיקרופיפט, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי חשיפת מטרות בשלד התאי ששינוי שלהן משפיע על העמידות המכנית של הגרעין.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מטרות המעורבות בהעברה מכנית (mechanotransduction) בין הגרעין לשלד התאי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתפעול מיקרופיפט ודימות תאים חיים תחת תנאים סביבתיים מבוקרים.
- תלוי במערכות מיקרו-הזרקה מכויילות ובצלחות בעגב דק מזכוכית המצופות ב-fibronectin להצמדת תאים.
- מחייב סטנדרטיזציה של הגדרות לחץ השאיבה והכנת קצות המיקרופיפט כדי להבטיח דיוק במדידת הכוח.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת השיטה לסוגי תאים שונים עם גודל גרעין והרכב ציטושלט משתנים.
- מוגבל על ידי הצורך בניטור חזותי ישיר של ניתוק הגרעין כדי לקבוע שיווי משקל של הכוח.
