Name: בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: למד כיצד למדוד מכאניקה גרעינית בתאים חיים באמצעות שיטת המיקרופיפטה. טכניקה זו מאפשרת לחקור את תכונות הגרעין ואת האינטראקציה שלו עם מבני התא בזברה דגים ותאים דבקים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 EB014869.

1. מכינים את התאים עבור הדמיה
הערה: החללית כוח ישיר ( DFP) יכול לשמש עבור כל סוג התא חסיד. כאן, NIH 3T3 העכבר fibroblasts משמשים את שורת התאים מודל עבור פרוטוקול זה.
<ol><li>תאי פיברובלסט 3T3 תרבות NIH בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% התורם שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין על 35 מ מ זכוכית התחתונה מגישים עד confluency הרצוי. לשמור על תאים-CO 37 ° C ו-5%2.<ol>
<li>הקפד מעיל כל המנות התחתון 35 מ מ זכוכית עם 5 µg/mL fibronectin (או חלבון ה-ECM דומה), לפני זריעה NIH 3T3 תאים עבור הדמיה. הערה: התאים יש מלא למרוח, חסיד על המנה לניסוי. אין אילוצי במונחים של confluency עבור שיטת  DFP לעבודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיד לפני הניסוי, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולאחריה שטיפה אחת עם מדיום הגידול מלאה.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול מלאה המנה קרקעית זכוכית.</li>
</ol>2. מיקרוסקופ ורכישת תמונות
הערה: הפוכה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (או שווה ערך) עם micromanipulator מותקן לזרוע בצד, על פי ההמלצות של היצרן. המיקרוסקופ צריך להיות מאובזר גם עם חדר סביבתיים לשמירה על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס ורמת CO2 ב-5%. נדרש גם micromanipulator עם microinjector מחובר המיקרוסקופ. טבילה שמן x 40 / 1.3 נה או 60 x / 1.49 NA (או מטרות שוות ערך) מומלץ לקבל הניסויים. המיקרוסקופ צריך להיות מותקן על שולחן בידוד רטט.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> איור 1 . דפורמציה גרעיני ומיקוד מיקרוסקופ א דפורמציה מקסימלית גרעיני ורגיעה של דפורמציה גרעינית. לפני חישוב דפורמציה מקסימלית גרעינית, הקצוות האחורי של צורות גרעיני היו קודם בד בבד לתקן את התרגום של גרעין מעוותים. הצורה של הגרעין ברגע של ניתוק עצה micropipette ומצופה על-גבי צורת הגרעין הראשוני לפני שנעלם. ההבדל באזור בין שתי הצורות נמדדה כ Δ1. להרכב גרעיני מרבי מוגדר כδA1 מחולק באזור הגרעין המקורי. באופן דומה, פרמטר השני, ΔA2, עשויה להיות מוגדרת על-ידי השלכת צורת הגרעין מצב יציב הסופי לאחר ניתוק micropipette על-גבי צורת הגרעין המקורי. B. למקד את התא-A המטוס ולאחר מכן הזז את מטוס מוקד עד המטוס B כדי למצוא את הטיפ micropipette. במהלך דימות, micropipette היה לתרגם את הזכות (כיוון החץ הכתום). איור זה השתנה מ קיראן ואח. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>הפעל את microinjector לכל הפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>בעזרת טפטפת שמן של טבילה, להחיל טיפת שמן טבילה על גבי העדשה אובייקטיבי.</li>
	<li>תהדק את המנה בחוזקה לתוך בעל צלחת וטען בעל צלחת לבמה. הערה: התאים חייב להישמר-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>להתאים את גובה המטרה להביא את התאים אל המוקד (A המטוס, איור 1B).</li>
	<li>הזז את הבמה מיקרוסקופ כדי למצוא תא עניין.</li>
	<li>לסובב את מוט ההיגוי על micromanipulator כדי לעבור על בעל pipet המיקום העליון. טען את micropipette עצה בקוטר 0.5 מיקרומטר על בעל pipet.<ol>
<li>כדי למנוע הידבקות תאים כדי micropipette, מראש לפנק את הטיפ micropipette עם 0.3 מ"ג/מ"ל PLL-g-יתד פתרון עבור 1 h בטמפרטורת החדר. מבחן הדבקה על ידי נגיעה את micropipette את הגרעין וללא לחץ היניקה, ולאחר מכן תרגום של micropipette הרחק מהגרעין. העדר אדהזיה וריחו מורגש חוסר מוחלט דפורמציה גרעיני ותרגום. הערה: אנא עקוב אחר ייצור הצעות כדי לפתוח את החבילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעלות את המטוס מוקד אובייקטיבית מעל המטוס A והעליונה של התא על מטוס B על ידי התאמת הפקד בסדר (איור 1B, ראה שלב 2.4).</li>
	<li>הגדר את micromanipulator מחוספס בפקד. לאט לאט להביא את micropipette אל המטוס B על ידי צופה על הצללית של micropipette, עד micropipette מגיע באופן מלא אל המוקד.</li>
	<li>לאחר קצה micropipette בפוקוס, הגדר את micromanipulator שליטה טובה .</li>
	<li>להוריד את המטרה קו המשווה של התא (א המטוס, איור 1B) ולהוריד את micropipette בסביבות 15 מיקרומטר מעל המטוס א (איור 1B, micropipette מקווקו).</li>
	<li>להגדיר את הלחץ פיצוי (P.c) microinjector ללחץ הרצוי; המתן מספר שניות עד הלחץ עד שהוא יתייצב. הערה: שנקבעה מראש הלחץ האופטימלי תלוי סוג התא והן את מטרותיה של הניסוי. ברוב המקרים, 300 hPa יהיה נקודת התחלה טובה.</li>
	<li>ודא כי micropipette זה לא סתם באמצעות ההגדרה נקיים בלוח micromanipulator ו בודק כדי לוודא בועות אוויר מגיחים הטיפ micropipette.</li>
	<li>הכנס את הטיפ לתוך התא על-ידי הנמכת בהדרגה את micropipette עד הטיפ נוגעת בקלילות על פני הגרעין. הערה: כאשר מורידים את micropipette, הצללית של קצה micropipette יתבהר כפי שהוא מגיע אל המוקד. לפני micropipette נוגע הגרעין, להעלות את המוקד אובייקטיבית, ליישר את הטיפ micropipette עם גרעין (באותו x-y רביע, z-מישור גבוה יותר). להחזיר את הפוקוס בחזרה קו המשווה של הגרעין (A המטוס, איור 1B) ולהוריד בהדרגה את הטיפ micropipette.</li>
	<li>ליצור חותם בין קצה micropipette את קרום גרעיני על ידי ניתוק הצינור אספקת לחץ מן המערכת microinjection, ובכך פותח בסוף הצינור micropipette לאווירה. שלב זה יוצר לחץ שלילי שווה ל- Pc על פני הגרעין.</li>
	<li>לרכוש תמונות עם התוכנה אוסף תמונות מיקרוסקופ. הגדר של אבי-רכישה (וידאו) או nd-רכישה (תמונות) בתוכנה אוסף תמונות. הערה: עבור כל רכישת תוכנת הדמיה, להגדיר הדמיה וידאו בזמן אמת או רכישות תמונות בצילום מואץ עם מרווח זמן קצר.</li>
	<li>לעבור כדי פלורסנט התואם הדמיה ערוץ (קרי, ה-GFP, RFP, וכו) ולהתחיל הדמיה.</li>
	<li>לתרגם את הטיפ micropipette, והגוף של התא (מימין, איור 1B) עד לגרעין לניתוק מן micropipette. הערה: משוך את הקצה לאורך הכיוון-x חיובי (מימין עם שדה הראייה). הקצב מושך יכול להיות מתוכנת, נשלט על-ידי מחשב או הג'ויסטיק ניתן להעביר באופן ידני. לא נמצא כל מתאם בין הוצאת גרעיני דפורמציה15 מציע מענה בעיקר אלסטי לכפות וקצב.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>לבצע ניתוח תמונות עם תוכנות עיבוד תמונה בסיסי זמינים. ניתן לכמת את מידת דפורמציה גרעיני על ידי המתח אורך (Ɛ) או המתח באזור (איור 1 א'). לכמת אורך המתח באמצעות משוואה 1, איפה L ו- L0 מייצג את המרחק של הגרעין-דפורמציה מקסימלית ואת המיקום הראשוני, בהתאמה. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(משוואת 1)</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מדידת השילוב מכני של הגרעין עם שלד התא היא אתגר עבור שיטות העדכנית ביותר, כמו השאיפה micropipette16, כי הם דורשים גם גרעינים בודדים (הגרעין איפה decoupled מ שלד התא) או הגרעינים מושעה תאים (היכן כוחות חוץ-תאית, כמו כוחות המתיחה, נעדרים). כוח הוחל את הגרעין על-ידי החלת זן biaxial תאים ו"היסטוריון17,ממברנה18; עם זאת, טכניקה זו מוגבל על ידי העובדה כי הכוח על הגרעין אינו ידוע. כוח אטומי (AFM) מיקרוסקופיה הגששים שימשו כדי להסיט פנימה את הגרעין ...

פתולוגיות כגון סרטן כרוך שינויים גרעיני צורה, מבנה1,2, אשר באופן כללי מלוות של "ריכוך" של גרעין3,4. התנגדות גרעיני דפורמציה מכאנית בדרך כלל התאפיין החלת כוח מבודדים גרעינים5.
הגרעין בתאים מחובר מולקולרי שלד התא על ידי מקשר של Nucleoskeleton שלד התא (לינק) מורכב6,7,8,9. כתוצאה מכך, הגרעין מכנית משולב עם שלד התא ודרכו תא-תשתית הדבקויות, מטריצות. מכנית חיטוט הגרעין בתוך תאים חסיד יכול לספק תובנה זו אינטגרציה מכנית. שיטות לטפל גרעין תאים חיים כוללים micropipette שאיפה10,11,13,12,מיקרוסקופ כוח אטומי14. אנחנו לאחרונה תיאר בדיקה ישירה כוח ( DFP) שחל כוחות מכני ישירות על גרעין תא חסיד חי15.
כאן, אנחנו חלוקה לרמות נוהל באמצעות מערכת microinjection זמין בדרך כלל במתקנים מיקרוסקופ כדי להחיל כוח מכני ידוע, בקנה מידה ננו ישירות על גרעין תא חסיד. Femtotip (0.5 מיקרומטר קוטר micropipette tip) רכוב, המחוברים למערכת microinjection באמצעות צינור. הטיפ, מוצבים בזווית של 45 מעלות ביחס השטח של המנה תרבות, היא יורדת עד סמוך אל פני השטח גרעינית. הצינור ואז מנותק ולאחר שנפתח לאווירה, אשר יוצרת לחץ שאיבה שלילי על פני הגרעין, חותמות את הטיפ micropipette נגד פני השטח גרעינית. באמצעות תרגום של קצה micropipette, הגרעין מעוותים, בסופו של דבר (בהתאם לגודל הכוח חלה), מנותקת את micropipette. בחבורה הזאת מתרחשת כאשר הכוחות (התנגדות) שחזור, המופעל על ידי גרעין התא, שווה את כוח היניקה שהחיל את micropipette. הניתוח יכול להתבצע על ידי מדידת הפיזור של הגרעין, המתח אורך (משוואה 1), או המתח באזור (איור 1 א').

<table><tbody><tr><td>FluoroDish</td><td>WPI</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>הופסק, דגם מקביל נוכחי: InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>דגם נוכחי FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan טבילת שמן פלואור 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF טבילת שמן 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Donor Bovine Serum (DBS)</td><td>ThermoFisher 16030074 מדעי</td><td></td><td>NIH 3T3 סרום</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)</td> <td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3</td></tr><tr><td>בינוני פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 תוסף בינוני</td></tr><tr><td>שמן טבילה מסוג LDF ללא פלואורסצינג</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>שמן טבילה לעדשה אובייקטיבית&nbsp;</td></tr></tbody></table>

בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

התכונות המכאניות של הגרעין לקבוע את תגובתה מכני הכוחות שנוצר בתאים. מכיוון הגרעין מולקולרי רציפה עם שלד התא, שיטות נחוצים כדי לחקור את התנהגותו מכני בתאים חסיד. כאן, אנו נדון החללית כוח ישיר ( DFP) ככלי להפעיל כוח באופן ישיר הגרעין בתא חסיד חי. אנחנו לצרף micropipette צרים על פני השטח גרעיני עם השאיבה. Micropipette מתורגמת הרחק מהגרעין, הגורמת הגרעין לעוות ולתרגם. כאשר הכוח שחזור שווה כוח יניקה, הגרעין לניתוק ונרגע elastically. בגלל הלחץ היניקה הוא ידוע במדויק, הכוח על פני הגרעין ידוע. שיטה זו חשפה כי בקנה מידה ננו כוחות מספיקים לעוות ולתרגם את הגרעין בתאים חסיד, זיהה רכיבים cytoskeletal המאפשרים את הגרעין להתנגד כוחות.  DFP ניתן לנתח התרומות של רכיבים הסלולר וגרעיני תכונות מכניות הגרעין בתאים חיים.

איור 2A מראה שהאילוץ של גרעין פיברובלסט העכבר NIH 3T3. הטיפ micropipette מתורגם מימין, הגרעין מתעוות, בסופו של דבר לניתוק מהקצה micropipette. המתח אורך של הגרעין נתפסת להגדיל עם הגדלת כוח יניקה (איור 2B). הקצה הקדמי של הגרעין (micropipette משיכת הקצה) יוצר בליטה גרעינית, הקצה נגרר מעקורי ממיקומה המקורי. האורך של בליטה היא הרבה יותר גדולה מאשר העקירה בקצה (איור 2C), מציע שילוב הדוק בין הגרעין לבין הצי...

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה micropipette ישירות להחיל כוח מבוקר את הגרעין בתא החי. Assay הזה מאפשר חקירת תכונות מכניות הגרעין בתא חי, חסיד.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המכניקה הגרעינית. לדוגמה, מהו הכוח הנדרש כדי לעוות את הגרעין בתא? מהן התרומות של רכיבים סלולריים וגרעיניים לעמידות גרעינית לעיוותים?או, האם צימוד גרעיני עם מבנים תאיים משתנה בהתאם לסוג התא? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לנו להפעיל כוח בדיקה כדי לעוות את הגרעין הציטו-שלד המשולב בתא דבק חי. למרות ששיטה זו שימשה כדי לספק תובנה לגבי התכונות המכניות הגרעיניות בתאי NIH-3T3, ניתן ליישם אותה גם על כל סוג תא דבק, כגון בדיקת תכונות מכניות גרעיניות בתאים פרוגריאליים של האצ'ינסון-גילפורד.כדי להתחיל בהליך זה, מצפים צלחת תחתית זכוכית 35 מילימטר ב -5 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין. לאחר מכן, תרבית את תאי הפיברובלסטים NIH 3T3 ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר תורם ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין על הצלחת המצופה ב-37 מעלות צלזיוס עד למפגש הרצוי. מיד לפני הניסוי יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן שטיפה אחת עם מצע גידול מלא.לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום גידול שלם לכלי תחתית זכוכית. בהליך זה, הפעל את המיקרו-מזרק. בעזרת טפטפת שמן טבילה, מרחו טיפת שמן טבילה על עדשת האובייקטיב.לאחר מכן, מהדקים את המנה בחוזקה למחזיק הכלים ומעמיסים את מחזיק הכלים על הבמה. שימו לב כי יש לשמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לאורך כל הניסוי. לאחר מכן, התאם את גובה המטרה כדי להביא את התאים למיקוד.הזיזו את שלב המיקרוסקופ כדי למצוא תא מעניין. בעזרת המיקרומניפולטור, העבר את מחזיק הפיפטה למצב הגבוה ביותר. לאחר מכן, טען את המיקרופיפטה עם קצה בקוטר 0.5 מיקרומטר על מחזיק הפיפטה.לאחר מכן הרם את מישור המוקד האובייקטיבי מעל מישור A ואת החלק העליון של התא למישור B על ידי התאמת הבקרה העדינה. לאחר מכן, הגדר את המיקרומניפולטור למצב בקרה גס. הורידו את המיקרופיפטה באיטיות למישור B על ידי התבוננות בצללית של המיקרופיפטה עד שהמיקרופיפטה תגיע למיקוד מלא.ברגע שקצה המיקרופיפטה נמצא בפוקוס, הגדר את המיקרומניפולטור לשליטה עדינה. לאחר מכן, הורד את המטרה למישור המשווני של התא והורד את המיקרופיפטה לכ-15 מיקרומטר מעל זה. הגדר את לחץ הפיצוי על המיקרו-מזרק ללחץ הרצוי.המתן מספר שניות עד שהלחץ יתייצב. חשוב לבדוק אם קצה הפיפטה שבור או סתום, אחרת מדידת הכוח לא תהיה מדויקת. ודא שהמיקרופיפטה אינה סתומה באמצעות ההגדרה הנקייה בלוח המיקרומניפולטור וודא שבועות האוויר יוצאות מקצה המיקרופיפטה.לאחר מכן, הכנס את קצה המיקרופיפטה לתא עד שהוא נוגע קלות במשטח הגרעין. צור אטימה בין קצה המיקרופיפטה לממברנה הגרעינית על ידי ניתוק צינור אספקת הלחץ ממערכת המיקרו-הזרקה, ובכך לפתוח את קצה המיקרופיפטה לאטמוספירה. שלב זה יוצר לחץ שלילי השווה ללחץ הפיצוי על פני השטח הגרעיני.לאחר מכן, פתח את תוכנת איסוף התמונות. הגדר רכישת AVI עבור וידאו או רכישת ND עבור תמונות בתוכנת איסוף התמונות. לאחר מכן, עבור לערוץ ההדמיה הפלואורסצנטי המתאים והתחל בהדמיה.הרחיקו את קצה המיקרופיפטה מגוף התא עד שהגרעין מתנתק מהמיקרופיפטה. איור זה מראה את הכפייה של גרעין פיברובלסטים של עכבר NIH 3T3. כאשר קצה המיקרופיפטה נע ימינה, הגרעין מתעוות ובסופו של דבר מתנתק מקצה המיקרופיפטה.נראה כי אורך המתח של הגרעין גדל עם הגדלת כוח היניקה. הקצה הקדמי של הגרעין יוצר בליטה גרעינית והקצה האחורי נעקר ממקומו המקורי. אורך הבליטה גדול בהרבה מתזוזה של הקצה הנגרר, מה שמרמז על אינטגרציה הדוקה בין הגרעין לציטופלזמה שמסביב.טווחי הזמן קצרים להרפיה של הקצה הקדמי הגרעיני והקצה האחורי הגרעיני. בדיקת כוח ישיר שימשה לקביעת תרומתם של מבנים תוך-גרעיניים ושלד ציטו-גרעיני לעמידות הגרעין בפני דפורמציה. תמונות פלואורסצנטיות הראו את שכבת העל של הגרעין לפני ואחרי במצב שצוין.אמנם לא נמצאו הבדלים משמעותיים בעיוות או בתרגום גרעיני לאחר שיבוש F-actin או שיבוש מיקרו-צינוריות, אך הפחתת ביטוי המנטן באמצעות נוקדאון מבוסס siRNA הביאה לתרגום ועיוות גרעיניים גדולים יותר באופן משמעותי. זה מצביע על כך שחוטי הביניים של מנטן בפיברובלסטים הם האלמנט הציטו-שלד העיקרי שעזר לגרעין להתנגד לכוח מקומי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל כוח מבוקר וידוע על הגרעין בתא דבק חי.

a-direct-force-probe-for-measuring-mechanical-integration-between

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מציגים שתי עצמאית, מיקרוסקופ מבוססי כלים למדידת דפורמציות גרעיני cytoskeletal המושרה, תאים בודדים חיים חסיד בתגובה לבקשה מאמץ עולמי או מקומי. טכניקות אלו משמשות כדי לקבוע קשיחות גרעיני (כלומר, deformability) וכן לחקור העברת כוח תאיים בין הגרעין לבין cytoskeleton.

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

לאחרונה פותחו מספר חיישני כוח מבוססי FRET, המאפשרים רזולוציה ספציפית לחלבון של כוח תוך-תאי. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש באחד מהחיישנים הללו, המיועד לקישור של החלבון הקומפלקס Nesprin-2G Nesprin-2G כדי למדוד את כוחות האקטומיוזין על קומפלקס ה-LINC הגרעיני.

פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיון חלקיקים נוקלאוזום ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי ו בצילום מואץ (AFM) טכניקות הדמיה. שיטת functionalization פני השטח המתואר מאפשרת לכידתו של המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים ב ברזולוציה גבוהה ב הננומטרי.

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקות מתח מבוססות דנ"א כדי לדמות את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון. גישה זו יכולה למפות כוחות קולטן &gt;4.7pN בזמן אמת ויכולה לשלב כוחות לאורך זמן.

בדיקות מתח DNA כדי למפות את כוחות קולטן פיקוניוטון חולפים על ידי תאים חיסוניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

מחקר זה מציג פרוטוקול חדש להפעלת כוח מכני ישירות על גרעין התא באמצעות מיקרובים מגנטיים המועברים לתוך הציטופלסמה ולביצוע הדמיה פלואורסצנטית בו-זמנית של תאים חיים.

שילוב של מפעיל כוח מגנטי תלת-ממדי והדמיה פלואורסצנטית רב-תפקודית לחקר גרעין המכנוביולוגיה

האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג'ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

למד כיצד למדוד מכאניקה גרעינית בתאים חיים באמצעות שיטת המיקרופיפטה. טכניקה זו מאפשרת לחקור את תכונות הגרעין ואת האינטראקציה שלו עם מבני התא בזברה דגים ותאים דבקים שונים.

בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא

גלה סרטונים נוספים