Name: ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: למד שיטת ניטור לא הורסת לעקוב אחרי התפתחות כלי דם מהונדסים ופירוק תומכי PGA באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית. השיטה מאפשרת דימוי בזמן אמת של מבנה כלי הדם לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו רוצים להכיר את המדע ואת הטכנולוגיה תכנון הפרוייקט של בפרובינצית גואנג-דונג של סין (2016B070701007) לתמיכה עבודה זו.

1. מתכלה PGA לגרדום המבוסס על תרבות כלי רקמות מהונדסים
<ol><li>ייצור PGA לגרדום<ol>
<li>לתפור רשת PGA (בקוטר 19 מ מ, עובי 1 מ"מ) סביב צינורות סיליקון מחוטא ע י אתילן אוקסיד (באורך 17 ס"מ 5.0 מ"מ קוטר, בעובי 0.3 מ מ) באמצעות 5-0 בתפר.</li>
		<li>לתפור טפלון (ePTFE, אורך 1 ס מ) 4-0 בתפר על גבי אחד מהקצוות של PGA רשת, החופף של 2 מ מ.</li>
		<li>טובלים PGA פיגומים עם יד 1 מול/ליטר NaOH במשך 1 דקה כדי להתאים את המבנה המרחבי של רשת השינוי ומשרים במים כיתה תרביות רקמה שלוש פעמים למשך 2 דקות כל אחד. בעדינות פאט יבש לגרדום בנייר טישו בכל פעם. ואז לייבש פיגומים בשכונה עם מפוח לשעה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכבה של ביוריאקטור ו- Y-הצומת עבור הדמיה OCT<ol>
<li>משרים את הזכוכית עצמית מפותחת ביוריאקטור גלילי (בקוטר 10 ס מ ו- 11.7 ס מ גובה עם שפתיים ארבע, ארבע צד-זרועות החוצה הכור כפי שמוצג באיור1), פיגומים PGA, צינור סיליקון (חיצוני בקוטר 5 מ"מ, עובי 0.3 מ מ), צינורות מסתיימים, מחברים, מערבבים בר, ציוד להרכבה בתוך מיכל אתנול 95% עבור 2 h...</li>
		<li>משוך PGA לגרדום דרך הצד-סמל ביוריאקטור מחוברת בצד אחד עם מחבר, כמו גם צד אחר עם Y-צומת נהגו לשלוח OCT guidewire. להרכיב עוד PGA לגרדום ב ביוריאקטור באותה דרך. נא עיין באיור 1.</li>
		<li>מתאים ePTFE על השפתיים ביוריאקטור על ידי הידוק בתפרים 4-0.</li>
		<li>לשים את ביוריאקטור במיכל אתנול שוב על 1 h, לייבש לילה בשכונה עם מפוח על.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זריעה של HUASMCs ומיזוג ביוריאקטור סטטי<ol>
<li>לבודד HUASMCs מן האדם עורקי הטבור בטכניקות explant רגיל.</li>
		<li>להרחיב ולתחזק בתאי השריר החלק תא מדיום הגידול מורכב DMEM בינוני, סרום שור עוברית 20%, 2.36 מ"ג/מ"ל HEPES, U/mL 100 פניצילין G, פרולין µg/mL 50, 20 אלנין µg/mL, גליצין µg/mL 50, 1.5 µg/mL CuSO4, חומצה אסקורבית µg 50/mL , 10 ננוגרם למ"ל בסיסי פיברובלסט גורם גידול ו ng/mL 10 נגזר טסית פקטורי גדילה.</li>
		<li>HUASMCs זרע-ריכוז של 5 × 106 תאים למ"ל במדיום תרבות לעיל על גבי פיגומים PGA.</li>
		<li>הכניסו למהומה בר (1.5 ס מ אורך) ביוריאקטור. הכנס אחד צינורית (בקוטר 5 מ מ, אורך 15 ס מ), שלושה מקטעי צינורות קצרים (5 מ מ קוטר, 7 ס מ אורך) לחילופי גזים דרך המכסה פקק סיליקון.</li>
		<li>לצרף PTFE מיקרומטר 0.22 מסננים כל שינוי צינורית אוויר והכובע הפארין אחד את הזונדה. להתאים את סרגל מערבבים עם מהירות מלהיב של 13 סיבובים לדקה. להרכיב ביוריאקטור זכוכית, המכסה פקק סיליקון, לגרדום PGA לתוך מערכת תרבות.</li>
		<li>לאפשר HUASMCs לדבוק למשך 45 דקות על-ידי הישענות על ביוריאקטור כל 15 דקות עם מעמד ימין ועל שמאל. הכור יציאות והמפרקים חתומים עם סרט פרפין.</li>
		<li>לחבר את לואו-Ye משאבה, PBS התיק, הנהג עם צינורות מסתיימים כמערכת זלוף. פתח את הכונן כדי למלא את הצינורות PBS.</li>
		<li>למקם את ביוריאקטור הכוללת חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C. למלא את התא תרבות 450 מ של המדיום תרבות HUASMCs.</li>
		<li>לחצו על הלחצן ' עצור ', מכבה את החשמל של המכשיר נסיעה. לגדול פיגומים הזריעה תחת תרבות סטטי למשך שבוע.</li>
		<li>לשנות את המדיום תרבות כל 3-4 ימים על ידי כ רפה בעברית חצי של המדיום הישן באמצעות הזנה אנטרלית ו מילוי הכור עם כמות שווה של טרי בינוני תרבות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של מערכת זלוף OCT הדמיה<ol>
<li>משאבת נוזלים בתיק PBS לזרום דרך צינורות מסתיימים ובחזרה את התיק.</li>
		<li>פתח את הכוח של הנהג, לווסת את הגדרת משאבה עם תדירות של 60 פעימות דקה ופלט הלחץ הסיסטולי של 120 מ מ כספית. כוונן את הפרמטרים מכני לצרכים של תרבות וסקולרית הנדסת רקמות.</li>
		<li>לחץ על לחצן ההפעלה להפוך את המערכת זלוף לעבוד. לספק את לעיל קבוע פועמת גירוי בכלי הדם למשך 3 שבועות על ידי iteratively pressurizing10,צינורות מסתיימים12 לאחר שבוע של תרבות סטטי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ביצוע הדמיה אופטית עם OCT
<ol><li>השתמש מקור אור כדי להבטיח את הרזולוציה צירית של 10-20µm ואת העומק תמונה של 1-2 מ מ כדי לזהות את המבנה של TEBV מבוסס על התדר OCT קרישה תוך-כלית הדמיה מערכת9.</li>
	<li>הפעל את מתג ההפעלה ופתח את התוכנה לכידת התמונה.</li>
	<li>להתחבר הקטטר הדמיה אופטיים סיבים נסיעה-מנוע, אופטי הבקר (DOC) עם קטטר לסגת אוטומטית בתפקוד.</li>
	<li>הגדר פרמטרים של קצב רכישת התמונה 10 מסגרות לשנייה עם מהירות היי אוטומטית של 10 מ מ/s.</li>
	<li>לצרף צנתר ההדמיה Y-צומת דרך הפארין כובע עם מחט 18 גרם.</li>
	<li>להכניס את הצנתר בתוך צינור סיליקון ולזהות ההידוק בתפר של PGA רשת לפני טעינת PGA לגרדום על גבי ביוריאקטור.</li>
	<li>המקום הקטטר עצה מעל האזור של ריבית. התאם את הזז התקן ולבדוק איכות התמונה8.</li>
	<li>לרכוש תמונות ב 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 ימים בתרבות עבור כל TEBV בודדים ולשמור ברצף עם תצפית בזמן אמת של מיקרו TEBV, כולל משטח מורפולוגיה, המבנה הפנימי, קומפוזיציה.</li>
	<li>חזור על המדידה עבור 3 פעמים לקבל מדידה אמין של כלי הנדסה בכל פעם. לכידת סדרה של תמונות במהלך בדיקה באמצעות התוכנה ללכידת תמונות.</li>
</ol>3. הדמיה ניתוח
<ol><li>השתמש בתוכנת ניתוח התמונה כדי למדוד את עובי הקיר TEBV. בחר את התמונה כדי להיות מנותח. לחץ על הכלי מעקב כדי לזהות באופן אוטומטי בצד הפנימי של TEBV על ידי תוכנת באופן ידני לשרטט את הצד החיצוני. דיאגרמה של עובי יופיע על המסך.</li>
	<li>חזור על המדידה עבור 5 פעמים לקבל מדידה אמין של המבנה. הניתוח OCT בוצע על ידי שני חוקרים עצמאיים עיוור על המידע שהושג.</li>
</ol>4. הקציר של TEBV ועיבוד רקמה
<ol><li>פתח את המכסה פקק סיליקון הניח על ביוריאקטור התרבות תסתיים וזורקים המדיום תרבות. לשחרר ePTFE מהשפתיים ביוריאקטור וחותכים את צינורות סיליקון מהצד החיצוני של ePTFE עם מספריים. הקציר TEBVs מ ביוריאקטור וחותכים למקטעים לסריקה בדיקה מיקרוסקופיית אלקטרונים.</li>
	<li>קח את שאר TEBVs וחתוכים לקוביות 4 מיקרומטר סעיפים עבה. נוציא את הצינור סיליקון תמיכה ולתקן חלקים עם 4% paraformaldehyde. ביצוע שגרתי היסטולוגית כתמים של מאסון trichrome, סיריוס אדום לבחון את המורפולוגיה של קולגן ו PGA10,13,14.</li>
	<li>כדי להעריך PGA תוכן ומרכיב קולגן, לבחון דגימות היסטולוגית עם סיריוס אדום מכתים על ידי מיקרוסקופ מקוטב. מלון PGA שרידים קיבלו את התחום בבירור דרך שבירה כפולה, האזור שריד ניתן לכמת בהתבסס על שטח חתך הרוחב10.</li>
</ol>

<ol><li>Chan-Park, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+control+of+vascular+smooth+muscle+cell+morphology+and+phenotype+for+functional+tissue-engineered+small-diameter+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).</li>
<li>Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2935622/">Image-guided tissue engineering.</a> Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+methodologies+for+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+%26+Technique%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering.</a> Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).</li>
<li>Chang, W. G., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+discourse+on+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A short discourse on vascular tissue engineering.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).</li>
<li>Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+challenges+in+biomaterials+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering.</a> Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).</li>
<li>Rice, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li>
<li>Niklason, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+tools+for+engineering+collagenous+tissues+integrating+bioreactors%2C+intravital+imaging%2C+and+biomechanical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).</li>
<li>Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+OCT+in+the+Engineering+of+Tissue+Constructs%3A+A+Potentially+Powerful+Tool+for+Assessing+Optimal+Scaffold+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Tissue+Engineering+%26+Regenerative+Medicine+Journal%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure.</a> Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).</li>
<li>Gurjarpadhye, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterization+of+bioengineered+blood+vessels+within+a+bioreactor+using+free-space+and+catheter-based+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+remodeling+and+structural+characterization+of+degradable+polymer+scaffold-based+tissue-engineered+vascular+grafts+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography.</a> Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+natural+history+of+extracellular+matrix+production+in+tissue-engineered+vascular+grafts+during+neovessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation.</a> Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=The+design+conception+and+realization+of+pulsatile+ventricular+assist+devices-from+Spiral-Vortex+pump+to+Luo-Ye+pump+&btnG=">The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=Application+of+optical+coherence+tomography+in+tissue+engineered+blood+vessel+culture+based+on+Luo-Ye+pump&btnG=">Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).</li>
<li>Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+the+age+of+fibrotic+lesions+using+polarized+light+microscopy+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis.</a> American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).</li>
<li>Martinho, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+optical+attenuation+coefficient+and+mechanical+tension+of+irradiated+human+cartilage+measured+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography.</a> Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).</li>
<li>Poirierquinot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+1.5-Tesla+magnetic+resonance+imaging+for+tissue-engineered+constructs%3A+a+noninvasive+tool+to+assess+three-dimensional+scaffold+architecture+and+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+burst+pressure%3A+initial+evaluation+of+the+natural+history+of+the+biaxial+mechanical+properties+of+tissue-engineered+vascular+grafts+in+the+venous+circulation+using+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).</li>
<li>Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+vessel+development+and+insight+towards+neovascular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שיש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כדי ליצור מהונדסים כלי עם מבנה, תכונות מכניות דומים לאלה של כלי הדם יליד יכול להוביל לקצר את הזמן לשימוש קליני הוא המטרה הסופית של הנדסת כלי הדם. טכניקות דימות אופטי היתר הפריט החזותי של רקמות מהונדסים וסקולרית רכיבים ספציפיים, אשר לא יכול לפקח על מבנים בודדים ברחבי תרבות וחשיפה בשתלי סביבה תרבות מבלי להתפשר על עקרות7. במאמר זה, תא תרבות מופרד ממערכת זלוף. מערכת עצמאית יחסית זלוף מבטיח הקטנת הסיכון של זיהום במהלך התרבות והמיקום של OCT guidewire. בינתיים זה intraluminal הדמיה אימצו בקלות, בטיחות מה...

רקמות מהונדסים כלי הדם (TEBVs) הוא חומר המבטיחים ביותר שתל וסקולרית אידיאלי1. כדי לפתח שתלי להיות שימושי קלינית עם מאפיינים מבניים ופונקציונליים דומים ככלים מקורית, לטכניקות שונות עוצבו כדי לשמור על תפקוד כלי הדם2,3. אמנם היו כלי הנדסה במחירים patency קביל במהלך ההשתלה, מחקר קליני שלב III4, עלות גבוהה ותרבות ארוכת טווח להציג גם את הצורך בפיקוח על התפתחות TEBVs. הבנה matrix(ECM) חוץ-תאית צמיחה שיפוץ, עיבוד תהליכי TEBVs בסביבת כימותרפיה-מכניים ביונים יכול לספק מידע חיוני להתפתחות של הנדסת רקמות עילאיים.
האסטרטגיה אידיאלי כדי לעקוב אחר התפתחות כלי הנדסה בקוטר קטן5 צריכה להיות גמישה, סטרילי, האורך, תלת מימדי, כמותית. TEBVs בתנאים תרבות אחרת יכול להיות מוערך על ידי מודאליות הדמיה זו, כולל שינויים לפני ואחרי השתלת כלי הדם. אסטרטגיות כדי לתאר תכונות של חיים מהונדסים כלי נחוצים. טכניקות דימות אופטי אפשר ויזואליזציה של כימות של רקמות התצהיר, biomaterials. יתרונות נוספים הם האפשרות לאפשר לדימות רקמות עמוק, ללא תווית עם רזולוציה גבוהה6,7. אולם מולקולות ספציפיות התמונה וציוד אופטי פחות נגיש עבור ניטור בזמן אמת הוא מכשול משמעותי מעשיים, אשר הגביל יישום נרחב של מיקרוסקופ אופטי לא-ליניאריות. טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) היא גישה אופטי עם קרישה תוך-כלית מודאליות הדמיה ככלי בשימוש נרחב קליניים כדי להנחות טיפול התערבותית לב8. בספרות דווח השיטה של OCT כדי להעריך את עובי הקיר של TEBVs9,10, בשילוב עם שיטות הדמיה חיובית לחקר הנדסת רקמות עילאיים. ואילו, הדינמיקה של הנדסה לאחור כלי הדם צמיחה ובניה נצפתה לא.
כתב יד זה, אנחנו מפרטים את הכנת TEBVs מבוססי לגרדום פולימריים מתכלים לתרבות ארבעה שבועות. תאי השריר החלק בכלי הדם האנושי עורקי הטבור (HUASMCs) מורחבת, נזרע לתוך פיגומים חומצה (PGA) נקבובי polyglycolic מתכלה ב ביוריאקטור. פולימרים מתכלים לשחק את התפקיד של מצע זמני עבור הנדסת רקמות, יש מסוים השפלה שיעור11. על מנת להבטיח התאמה המתאימה בין השפלה לגרדום ויצירת ניאו-רקמות, פיגומים ECM ו- PGA הם גורמים קריטיים עבור שיפוץ כלי דם יעיל. מערכת זלוף מדמה את microenvironment ביו-מכני של כלי יליד ושומר על עיוות עקבי תחת לחץ גירוי.
המטרה של פרוטוקול הציג היא לתאר את אסטרטגיה פשוטה יחסית, גמישה TEBVs הדמיה וניטור לטווח ארוך של תרבות. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל עבור ויזואליזציה של שינויים מורפולוגיים ומדידות עובי של כלי מהונדסים בתנאים תרבות אחרת. בנוסף, ניתן לבצע הבדיקות של השפלה מבוסס פולימר חומרים ברקמת הנדסה פיגומים לצורך הזיהוי. על ידי שילוב של שיטות של סריקת אלקטרונים microscopic(SEM) ו מקוטב מיקרוסקופ בשימוש פרוטוקול זה, המתאם, כימות של מטריצה חוץ-תאית הפצה והשפלה PGA יכול להתבצע, אשר יכול להקל להערכת לגרדום השפלה בשילוב הדמיה OCT.

<table><tbody><tr><td>רשת PGA</td><td>צינור סיליקון Synthecon</td><td></td><td></td></tr> מחבר <tr><td></td><td>קול פארמר</td><td></td><td></td></tr> מערכת OCT תוך-וסקולרית <tr><td></td><td>Cole Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td>ILUMIEN&trade; אופטיקה וסחר; מערכת</td><td></td></tr><tr><td>סריקת אלקטרונים מיקרוסקופית</td><td>פיליפס</td><td>FEI פיליפס XL-30</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מקוטב</td><td>אולימפוס</td><td>אולימפוס BX51</td><td></td></tr><tr><td>תפרים</td><td>ג'ונסון & משאבת פעימות ג'ונסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> מכון <td></td><td></td><td>הלב וכלי הדם גואנגדונג</td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה LightLab</td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

שתלי כלי הדם מהונדסים בעלת מאפיינים מבניים מכניים דומים לכלי הדם טבעי צפויים לפגוש את הדרישה הגוברת מעקף עורקים. אפיון של הדינמיקות צמיחה ואת תהליך שיפוץ של פולימר מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם (TEBVs) עם גירוי פועמת חיונית הנדסת רקמות עילאיים. טכניקות דימות אופטי להתבלט בתור כלים רבי-עוצמה עבור ניטור אמוניה רקמות מהונדסים מאפשר דימות ברזולוציה בתרבות בזמן אמת. מאמר זה מדגים גמישה, מהר בזמן אמת הדמיה אסטרטגיה כדי לפקח על הגידול ובניה של TEBVs בתרבות לטווח ארוך באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר). מורפולוגיה גיאומטריות מחושבת, כולל תהליך שיפוץ כלי הדם, עובי הקיר של השוואה של עובי TEBV נקודות זמן תרבות אחרת, נוכחות של גירוי פועמת. לבסוף, OCT מספק אפשרויות מעשיות להשגחה בזמן אמת השפלה של פולימר ברקמות בשחזור תחת גירוי פועמת או לא, כל קטע כלי השיט, על ידי לעומת הערכת השימוש השפלה פולימרי סריקה microscopic(SEM) אלקטרון, מיקרוסקופ מקוטב.

מערכת תלת מימדי התרבות כללה תא תרבות את ביוריאקטור ובמערכת זלוף עם מחזור נוזל סגור10,13 (איור 1). הקטטר הדמיה OCT היה מוכנס לתוך בקצה הדיסטלי של Y-הצומת, התרחקה בצינור סיליקון עבור הדמיה. הדמיה OCT שימשה תחילה ניסחו אפיון מבניים TEBVs מבוססי לגרדום פולימריים מתכלים במהלך הטיפוח-תרגול ביוריאקטור.
איור 2 הראו בתהל...

פרוטוקול צעד אחר צעד גמישה, תקופה ארוכה ניטור התהליך של שיפוץ כלי הדם והשפלה לגרדום בתרבות בזמן אמת של מתכלה פולימריים מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם עם גירוי פועמת באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית מתואר כאן.

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת רקמות כלי הדם כגון ניטור הדינמיקה של צמיחת כלי הדם מהנדס שיפוץ במהלך התרבות לטווח ארוך. היתרון העיקרי של שימוש טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית, או OCT, היא כי היא זמינה, אסטרטגיה הדמיה בזמן אמת ולא הרסנית כדי לאפיין את התכונות המבניות ואת תהליך שיפוץ של כלי מהונדסים. הדגמת ההליך תהיה גם שאנגמין ליו, וונטאו מא, טכנאים מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, לפברק את פיגום PGA כמתואר בפרוטוקול הטקסט לטבול פיגומים PGA בנתרן הידרוקסיד מול לליטר אחד במשך דקה אחת, כדי להתאים את המבנה spacial של הרשת. לאחר מכן, להשרות את הפיגומים במים ברמת תרבות רקמות שלוש פעמים במשך שתי דקות כל אחד. בכל פעם, בעדינות לטפוח לייבש את הפיגום עם נייר טישו.לאחר מכן, לייבש את הפיגומים ברדס עם מפוח במשך שעה אחת. כדי להרכיב את bioreactor ואת y-צומת עבור הדמיה OCT, הראשון, להשרות את bioreactor גלילי זכוכית שפותחה עצמית, פיגומים PGA, צינור סיליקון, צינורות תואמי ביו, מחברים, בר ערבוב, וציוד להרכבה במיכל אתנול 95 אחוז במשך שעתיים. משוך את פיגום PGA דרך הזרועות הצדדיות של bioreactor מחובר לצד אחד עם מחבר, כמו גם לצד אחר עם צומת y המשמש כדי לספק את חוט מדריך OCT.להרכיב פיגום PGA אחר בביורייקטור באותו אופן. התאימו את הפוליטטרה-שפעת לשפתיים הביו-ריאוקטוריות על ידי הידוקו בתפרים 4-0. שים את bioreactor במיכל האתנול שוב במשך שעה אחת לפני ייבוש אותו לילה במכסה המנוע עם מפוח על.עכשיו, לבודד את עורק הטבור האנושי תאי שריר חלקים מעורקי טבור אנושיים על ידי טכניקות explant סטנדרטיות הגורם להצלת התאים לתוך פיגומים PGA, למנוע כל טפטוף של השעיית תא על החלק התחתון של bioreactor. כמו כן, לכסות את bioreactor עם מכסה פקק סיליקון בהקדם האפשרי לאחר ישיבה בתא כדי למנוע זיהום. הרחב ושמור על התאים במדיום צמיחת שרירים חלקה.זרע את עורק הטבור האנושי חלק תאי שריר בריכוז של 5 מיליון תאים למיליליטר במדיום התרבות לעיל על פיגומים PGA. לאחר הצבת בר אדוני בביו-ריירקטור, כסו אותו במכסה פקק הסיליקון שיש לו צינור הזנה אחד ושלושה מקטעי צינורות קצרים שהוכנסו לחילופי גזים. חבר מסנני מיקרון PTFE 0.22 לכל צינור שינוי אוויר, והצמד כובע הפרין אחד לצינור ההזנה.כווננו את בר הערבב במהירות ערבוב של 13 סיבובים לדקה. לאחר מכן, להרכיב את bioreactor זכוכית, מכסה פקק סיליקון, פיגום PGA לתוך מערכת התרבות. אפשר לתאים לדבוק במשך 45 דקות על ידי נטייה bioreactor כל 15 דקות עם עמדה שמאלה וי ימינה.עכשיו, חבר את משאבת LOO-OH-YEE, שקית מלוחים עם אגירת פוספט, ונהג עם הצינורות תואמי הביולוגיה על מנת ליצור את מערכת שפע. פתח את הנהג כדי למלא את הצינורות עם PBS. מניחים את הביו-ריאקטור הכולל באינקובטור לח עם 5 אחוז CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.מלאו את תא התרבות ב-450 מיליליטר של מדיום התרבות. לגדל את פיגומים זרעים תחת תרבות סטטית במשך שבוע אחד, שינוי מדיום התרבות כל שלושה עד ארבעה ימים על ידי שאפת מחצית המדיום הישן דרך צינור ההזנה ומילוי הכור עם כמות שוות ערך של מדיום תרבות טרי. כדי להכין את מערכת שפע עבור הדמיה OCT, משאבת נוזלים בשקית PBS להפיץ אותם דרך צינורות biocompatible ובחזרה לשקית.פתח את כוחו של הנהג לווסת את הגדרת המשאבה עם תדירות של 60 פעימות לדקה ולחץ סיסטולי פלט של 120 מילימטרים של כספית. התאימו את הפרמטרים המכניים בהתאם לצרכים של תרבות כלי הדם להנדסת רקמות. לחץ על לחצן ההפעלה כדי לגרום למערכת שפע לפעול.ספק את הסימולציה pulsatile לתקן לכלי הדם במשך שלושה שבועות על ידי לחיצה איטרטיבית על צינורות biocompatible לאחר שבוע של תרבות סטטית. השתמש במקור אור כדי להבטיח את הרזולוציה צירית של עשרה עד עשרים מיקרון ואת עומק התמונה של אחד עד שני מילימטרים כדי לזהות את המבנה של כלי הדם מהונדסים רקמות, או TEVBs, בהתבסס על תחום התדירות OCT מערכת הדמיה תוך וסקולרית. הפעל את מתג ההפעלה ופתח את תוכנת לכידת התמונה חבר את קטטר ההדמיה הסיבי האופטי למנוע הכונן ולבקר האופטי, עם פונקציית הנסיגה האוטומטית של הקטטר.הגדר את הפרמטרים של קצב רכישת התמונה לעשר מסגרות לשנייה, עם מהירות נסיגה אוטומטית של עשרה מילימטרים לשנייה. עכשיו, חבר את קטטר ההדמיה לצומת y דרך כובע הפרין עם מחט 18 מד. מניחים את הקטטר לתוך צינור הסיליקון ולזהות את הידוק המבנה של רשת PGA לפני טעינת פיגום PGA על bioreactor.עכשיו, שים את קצה הקטטר מעל אזור העניין. כוונן את התקן ההמשך ובדוק את איכות התמונה. לרכוש תמונות באחת, ארבע, שבע, עשר, 14, 17, 21, ו 28 ימים בתרבות עבור כל TEBV בודדים.שמור תמונות אלה ברצף עם תצפית בזמן אמת של מיקרו-מבנה TEBV כולל מורפולוגיה של פני השטח, מבנה פנימי והרכב. חזור על המדידה שלוש פעמים כדי לקבל מדידה אמינה של כלי השיט המהונדסים בכל פעם. לכוד סדרה של תמונות לאורך כל הבדיקה באמצעות תוכנת לכידת התמונה.כדי להשתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי למדוד את עובי הקיר של כלי הדם מהונדסים על ידי רקמות, בחר תחילה את התמונה שיש לנתח. לאחר מכן, לחץ על כלי המעקב כדי לזהות באופן אוטומטי את הצד הפנימי של כלי הדם מהונדס רקמות עם התוכנה ולשרטט באופן ידני את הצד החיצוני. דיאגרמה של עובי תופיע על המסך.חזור על המדידה במשך חמש פעמים כדי לקבל מדידה אמינה של המבנים. שקול להשתמש בשני חוקרים עצמאיים המחויבים לקבלת מידע. פתח את מכסה פקק הסיליקון ממוקם מעל bioreactor כאשר התרבות היא סיימה, ולהשליך את מדיום התרבות.שחררו את הפוליטטרה-שפעת מהשפתיים הביו-ריאה וחתכו את צינורות הסיליקון מהצד החיצוני של הפוליטטרה-שפעת עם מספריים. לקצור את TEBVs מן bioreactor, לחתוך אותם לחלקים לבדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה. משוך את צינור הסיליקון התומך, ותקן את החלקים עם פורמלדהיד כוח 4 אחוז.בצע כתמים היסטולוגיים שגרתיים עם טריכרום של מעסה ואדום אדוני כדי לבחון את המורפולוגיה של קולגן ו PGA. כדי להעריך את התוכן PGA ורכיב קולגן, להתבונן דגימות היסטולוגיות עם כתמים אדומים אדוניים דרך מיקרוסקופ מקוטב. תמונות OCT מושווים עם ממצאים היסטופתולוגיים של טלוויזיות לאחר ארבעה שבועות של תרבות.תמונת OCT מציגה מיקרו-מבנה קומפקטי ורכיבים ספציפיים בהשוואה להערכה היסטולוגית. מדיום התרבות, צינור הסיליקון, ה- TEBV ושבר ה- PGA נראים לעין. כתמי טריכרום של מאסון מדגימים סיבי קולגן המופצים בכיוון מסוים, יחד עם שרידי PGA בשכבת המדיה של כלי השיט המהונדסים.כתמים אדומים של סיריוס חושפים שרידי PGA ורכיב קולגן באמצעות מיקרוסקופ מקוטב. מיקרוגרפים סריקה-אלקטרונים של כלי מהונדסים מדגימים מיקרו-מבנה קומפקטי. בינתיים, מודאליות הדמיה פנים-לשונית זו מאמצת ניטור לא הרסני וקל של טלוויזיות, כולל תהליך השיפוץ והמורפולוגיה החזותית בתרבות ארוכת שנים.כפי שמוצג כאן, השיפוץ מתרחש מוקדם יותר והשינויים המורפולוגיים באים לידי ביטוי בצורה ברורה יותר בקבוצה הדינמית באמצעות השוואה של עובי TEBV. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת רקמת כלי הדם לחקור את תכונות המבנה ואת תהליך השיפוץ ארוך הטווח של כלי שיט מהונדסים. תצוגה ברורה של שרידים פולימריים על ידי מיקרוסקופיה מקוטבת בשילוב עם הדמיית OCT עשויה להיות שימושית להערכת השפלת פיגומים.

nondestructive-monitoring-degradable-scaffold-based-tissue-engineered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

מקור: }Huang, Y. et. al.,, ניטור מורפולוגי ופיזיולוגי אורכי של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. J. Exp. (2019)}{{}}} סרטון זה מדגים את השימוש בקוהרנטיות אופטית טומוגרפיה (OCT) לניטור ספרואידים של גידול בצלחת מרובת בארות על ידי לכידת תמונות חתך ברזולוציה גבוהה. על ידי ניתוח השתקפויות אור ממבנים תאיים, OCT בונה מודלים תלת מימדיים כדי להעריך תכונות מורפולוגיות כמו גודל וצורה תוך הבחנה בין תאים ברי קיימא לתאים שאינם ברי קיימא על סמך שינויים בפיזור האור לאורך זמן.

ניטור מורפולוגי ופיזיולוגי של ספרואידים גידוליים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית 

כלי דם הוא מפתח לגישות בהנדסת רקמות מוצלחת. לכן, טכנולוגיות אמינות נדרשות כדי להעריך את ההתפתחות של רשתות כלי דם ברקמות מבנים. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, יעיל וחסכונית כדי לחזות ולכמת כלי דם בגוף חי.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

השרשה של שתלי עצם אוטולוגית ואלוגנאית מהווה קיבלה גישות לטיפול באובדן עצם craniofacial גדול. עם זאת, ההשפעה של הרכב שתל על יחסי הגומלין בין neovascularization, התמיינות תאים והיווצרות עצם לא ברורה. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה multimodal נועד על מנת להבהיר את התלות ההדדית אנגיוגנזה-Osteogenesis בקרבת השתל.

טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להמחיש כלי דם היווצרות ויוו ואת בזמן אמת ב- 3D פיגומים על ידי מיקרוסקופ multiphoton. אנגיוגנזה פיגומים מהונדסים נחקרה מודל פגם מאתר calvarial עצם קריטי. עוד כלי דם חדשים התגלו בקבוצה טיפול יותר שולטת.

אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ קוהרנטיות אופטית בשדה מלא כשיטה להערכת איכות גבוהה של סטרומה של תורם הקרנית. פרוטוקול זה יכול לשמש לזיהוי תכונות המעידות על בריאות או מחלה, והוא נועד לשפר את ההקרנה והבחירה של רקמות התורם, ומכאן את התוצאות של keratoplasty.

מיקרוסקופ קוהרנטיות אופטית בשדה מלא לניתוח דמוי היסטולוגיה של תכונות סטרומה בשתלי קרנית

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר), טכנולוגיה הדמיה תלת-ממדית, שימש כדי לפקח, לאפיין את קינטיקה גידול של הגידול multicellular spheroids. כימות הנפחי מדויק של גידול spheroids באמצעות voxel של סופרים ושל הרקמה המתה ללא תווית זיהוי spheroids מבוסס על ניגוד מהותי הנחתה אופטי, היו הדגים.

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

ביויודים מורכבים באופן מורכב מארכיטקטורות מורכבות ומתפתחות לדפוסי מרחבי מאוד תלויי קנה מידה. כאן, אנו מציגים מערכת ניסיונית (קשה ותוכנה) עבור רכישה אוטומטית של מערכות הנתונים של טומוגרפיה אופטית 3D קוהרנטית (OCT). ערכת כלים זו מאפשרת אפיון לא פולשני ורב-ממדי של הביוגנזה מורפוליולוגיה במרחב ובזמן.

אוטומטי 3D הטומוגרפיה האופטית קוהרנטית כדי להבהיר ביויובואר מורפוגנזה מעל סולמות מרחביים גדול

מאמר זה מתאר שיטה למדידת פעילות מחודשת ברשתית בvivo עם נושאים אנושיים באמצעות טכניקה לנשימה גז פרובוקציה לספק גירויים יום תוך רכישת תמונות ברשתית.

תגובתיות כלי דם רשתית המשוער על ידי קוהרנטיות אופטיות של טומוגרפיה ממוחשבת

רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

למד שיטת ניטור לא הורסת לעקוב אחרי התפתחות כלי דם מהונדסים ופירוק תומכי PGA באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית. השיטה מאפשרת דימוי בזמן אמת של מבנה כלי הדם לאורך זמן.

ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

גלה סרטונים נוספים