Name: וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: למד שיטה אופטית פשוטה לניתוח מיחזור שלפוחיות סינפטיות בנוירונים היפוקמפיים בתרבית. השיטה משתמשת בנוגדנים ספציפיים ובהעברת גנים כדי לזהות אתרים פרה-סינפטיים ולהעריך את השפעת חלבונים על תהליכי מיחזור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אירמגרד וייס לסיוע טכני מומחה. עבודה זו נתמכה על ידי DFG באמצעות האשכול המצוינות מיקרוסקופ במטווח ננומטר ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB, B1-7, סמטת).

אין מחקרים עם בעלי חיים נערכו. ניסויים המערבות בעלי חיים לאללה לקבל תא תרבויות אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת האישור למספר T10/30. הניסויים נערכו עם הפרוטוקולים המאושרים.
1. תרבית תאים בהיפוקמפוס ראשי
<ol><li>להכין את התרבות התא הפומבית של ההיפוקמפוס חולדה על16,1917יום עובריים. צלחת התאים על coverslips 12 מ"מ מצופה polyethyleneimine (פיי) במנות 24-ובכן-צפיפות של 50,000-60,000 תאים/טוב. בדוק את צפיפות באמצעות תא ספירת לשכת ושלב אופטיקה חדות.</li>
	<li>תרבות הנוירונים במשך 3 ימים (יום במבחנה (DIV) 3) של צלחת 24-ובכן בחממה ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>להעריך את coverslips עבור אינדיקטורים של תקינות התא באמצעות מיקרוסקופ אור המשודרת (למשל, שלב ניגודיות אופטיקה בהגדלה גדולה של 10-20 X). בדוק אם האינדיקטורים הבאים של בריאות טובה: הילה ניגודיות שלב ברור, neurites בלי חרוזים מבנים, ו אין סומא קיבוץ באשכולות או neurite bundling.</li>
</ol>2. תקנים
הערה: הפרוטוקול הבא מתייחס כפול-תרביות תאים עבור 3 בארות. עם זאת, הפרוטוקול פועלת בצורה הטובה ביותר כאשר כמויות מספיקות עבור 4 בארות מוכנים.
<ol><li>הכנת 500 מ"ל של תרביות תאים מאגר (274 מ"מ NaCl, 10 מ מ. אשלגן כלורי, 1.4 מ מ נה2HPO4, 15 מ מ גלוקוז, 42 מ"מ HEPES) בתוך הבקבוק Erlenmeyer.<ol>
<li>להמיס 8.0 גר' NaCl, 0.37 גרם אשלגן כלורי, g 0.095 של נה2HPO4, 1.35 גר' גלוקוז ו- g 5.0 של HEPES ב- 400 מ ל מים מזוקקים flask Erlenmeyer.</li>
		<li>להתאים את ה-pH עולה 6.95 עם NaOH M 1 באמצעות מד pH.</li>
		<li>לכוון את עוצמת הקול עם מים מזוקקים עד 500 מ"ל, לבדוק את ה-pH באמצעות מד pH.</li>
		<li>להפוך aliquots 20-30 מ של תרביות תאים מאגר עם ערכי pH הבאים על-ידי pipetting 1 NaOH M למאגר תרביות תאים: 6.96 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, הגנה 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11. הערה: ה-pH של המאגר תרביות תאים חיונית היעילות תרביות תאים.</li>
		<li>כדי לבדוק אילו תקנים מאגר מוביל המספר הגבוה ביותר של תאים transfected, לבדוק כל ערך ה-pH של 6.96 7.11. השתמש בשיטת תרביות תאים שמתואר 2.2-2.11, על פלסמיד המאומת לבטא GFP. לקבוע את מספר התאים transfected לכל coverslip עבור כל ערך ה-pH של מאגר תרביות תאים להעריך אילו מאגר עובד הכי טוב.</li>
		<li>Aliquot המאגר עם יעילות תרביות תאים הגבוהה לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל להקפיא ולאחסן הצינורות ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחמם את מופחת סרום בינוני בינוני התרבות תאים, מים מזוקקים עד 37 ° C באמבט מים.</li>
	<li>הכינו את התמהיל תרביות תאים צינור microcentrifuge 1.5 mL. לעבוד תחת למינארי על מנת להבטיח תנאי עבודה סטרילית.<ol>
<li>מיקס 7.5 µL של 2 מ' סידן כלורי עם 4 µg של כל DNA ללא אנדוטוקסין (Synaptophysin-מורנג ו- mGFP/GFP-Rogdi). מוסיפים מים כדי להגיע הנפח הכולל של 60 מ ל צינור microcentrifuge 1.5 mL.</li>
		<li>להוסיף 60 מ של תרביות תאים מאגר לתערובת. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, להוסיף למאגר תרביות תאים dropwise תוך כדי טלטול DNA-לערבב בעדינות על המערבולת.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות. נמנעים מללחוץ את הצינור הדגירה במהלך זמן הדגירה על ידי הנחת הצינור ליד למינארי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית, להסיר את המדיום תרבות תא ("בינוני ממוזגים") מן הבארות באמצעות pipet 1000 מ"ל ואחסן אותו במיכל נפרד בחממה.</li>
	<li>להוסיף 500 מ"ל של מדיום מופחת סרום מכל קידוח. דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד תקופת הדגירה 20 דקות (שלב 2.3.3).</li>
	<li>להוסיף 30 מ של תרביות תאים לערבב כל טוב על-ידי pipetting מספר טיפות. למחוק את השאריות בתחתית הצינורית.</li>
	<li>לאחר כל הבארות אלו שסופקו עם תערובת תרביות תאים, לנער בעדינות את הצלחת 24-טוב על מנת להבטיח הפצה של המיקס תרביות תאים בטווח הבינוני.</li>
	<li>תקופת דגירה הבארות של 60 דקות-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>להסיר למחוק את התמהיל תרביות תאים, לשטוף אותו שלוש פעמים עם תא תרבות בינוני. להוסיף 1 מ"ל של התא תרבות בינוני מכל קידוח, דגירה אותם למשך 30 שניות ב RT. להסיר 750 מ"ל של מדיום ולהוסיף את אותה כמות בינונית טרייה. חזור על זה שלוש פעמים. הערה: השלב כביסה הוא קריטי. לשמור על הפעם בה כל טוב יש לא בינוני לכל הפחות (כלומר., להסיר ולהחליף טוב-מאת-טוב) ולהוסיף המדיום כביסה בעדינות.</li>
	<li>להסיר, למחוק את המדיום תרבות תא ולהוסיף 450 מ של ממוזגים בינוני טוב-מאת-טוב.</li>
	<li>תן את הנוירונים בוגרים בחממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד DIV 10.</li>
</ol>3. Syt1 ספיגה ולניתוח
הערה: הפרוטוקול הבא חל על תפיסה 3 בארות. דפולריזציה של כל מספר אחר של בארות, להתאים את הכמויות בהתאם.
<ol><li>להכין 50 מ של 10 x דפולריזציה (640 מ"מ NaCl, 700 מ"מ. אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2, 20 מ מ CaCl2, 300 מ"מ גלוקוז, 200 מ"מ HEPES, pH 7.4) של מאגר הבקבוק Erlenmeyer. הערה: מאגר דפולריזציה ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. אם פתרון שאינו depolarizing משמש גם, להכין 10 הפתרון של x Tyrode המורכב מ מ 1290 NaCl, 50 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2, 20 מ מ CaCl2, 300 מ"מ גלוקוז, 200 מ"מ HEPES pH 7.4 על מנת להשוות גירוי הנוצרות על-ידי מיחזור עם ספונטנית מיחזור. לאחר דילול ל- 1 x, להוסיף 1 מיקרומטר של טטרודוקסין לפני השימוש כדי לחסום את פוטנציאל הפעולה הדור.<ol>
<li>להמיס 1.87 g של NaCl, g 2.61 של אשלגן כלורי, 0.1 גר' MgCl2-6 H20, 0.15 גרם CaCl2-2 H2O ואת 3.0 גר' גלוקוז-1 H2O g 2.38 של HEPES ב 50 מ ל מים מזוקקים flask Erlenmeyer. להתאים את ה-pH עם NaOH וסינון סטרילי-הפתרון. לדלל 1:10 מאגר במים מזוקקים להשגת ריכוז 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x PBS (pH 7.4) קיבוע לאחר גירוי.<ol>
<li>עבור 500 מ של 4% מחברים ב- PBS 1 x, לפזר 20 גר' paraformaldehyde ב 450 מ של מזוקקים H2O. הערה: חימום הפתרון עשוי להאיץ את המסת, אך שלא לחמם את הפתרון מעל 70 מעלות צלזיוס, כאשר מחברים עלולה להתפרק. זהירות: PFA היא רעילה, קרצינוגני ו- teratogenic. יש ללבוש כפפות בעת עבודה עם כדורגלן, לעבוד תחת מכסה המנוע fume ולהימנע בליעה.</li>
		<li>ומצננים את פתרון כדי RT ולהוסיף 50 מ של פתרון מניות PBS x 10. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם NaOH/HCl באמצעות מד pH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחמם 600 מ ל 1 x מאגר דפולריזציה של 10 מ"ל של התא תרבות בינוני עד 37 ° C באמבט מים.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של נוגדן anti-Syt1 העכבר (שיבוט 604.2) 1-מאגר דפולריזציה ו מערבולת למשך 10 שניות.</li>
	<li>להסיר ולמחוק את המדיום התרבות התא מהתאים. להוסיף 200 מ של המיקס דפולריזציה-נוגדן אחד טוב, תקופת דגירה של 5 דקות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בחממה.</li>
	<li>להסיר למחוק את התמהיל דפולריזציה-נוגדן, לשטוף אותו שלוש פעמים עם תא תרבות בינוני. להוסיף 1 מ"ל של התא תרבות בינוני מכל קידוח, תקופת דגירה של 30 שניות ב RT. להסיר 750 מ"ל של מדיום ולהוסיף את אותה כמות בינונית טרייה. אני חוזר שלוש פעמים.</li>
	<li>להסיר, למחוק את המדיום תרבות תא ולהוסיף 300 מ של 4% מחברים ב- 1 x PBS. תקופת דגירה של 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>רחץ שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 x PBS. הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.</li>
</ol>4. Immunocytochemistry
<ol><li>להכין 50 מ של מאגר חסימה. הערה: חסימת מאגר ניתן לשמור ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.<ol>
<li>להמיס 2.5 g של סוכרוז ו- 1g של אלבומין שור (BSA) ב 5 מ של פתרון מניות PBS x 10. להוסיף 1.5 מיליליטר 10% הפתרון מניות דטרגנט. מערבבים את הפתרון עד שכל הרכיבים יש מומס כראוי ולהוסיף מזוקקים H2O עד שהגיע נפח סופי של 50 מ. Aliquot הפתרון ומקפיאים את aliquots עבור אחסון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לדלל המשני, מצמידים fluorophore הנוגדן (מכוונת נגד המין Syt1-נוגדן ראשוני) ב- 200 מ של מאגר חסימה של כל טוב-לדילול 1:1000.</li>
	<li>להסיר ולמחוק מגניב 1 x מ המכילים כל אחד טוב של coverslip.</li>
	<li>להוסיף 200 מ של חסימת שילוב מאגר-נוגדן מכל קידוח ולאחר תקופת דגירה של 60 דקות ב- RT. התראה: מאחר נוגדנים משניים הם רגישים לאור, כל הצעדים להתקדם חייב להתבצע בחושך.</li>
	<li>לאחר דגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 1 מ"ל של PBS 1 x.</li>
	<li>להטביע את coverslips על שקופיות מיקרוסקופ עם המדיום ההטבעה.<ol>
<li>להוסיף טיפה 7 mL הטבעה בינוני על גבי השקופית מיקרוסקופ. הסר את coverslip הצלחת 24-ובכן באמצעות הרמת אותו עם מזרק תופס אותו עם מלקחיים. התראה: תאים על משטח coverslip בקלות פגומים, אז מלקחיים יש לטפל בזהירות.</li>
		<li>טובלים את coverslip לתוך מים מזוקקים כדי להסיר את PBS לייבש אותו בקפידה על-ידי נגיעה צד אחד כדי רקמה רכה.</li>
		<li>להעיף את coverslip על גבי ה-droplet בינוני ההטבעה, כך השטח נושאת את התאים פונה השקופית מיקרוסקופ, ובכך הטבעה התאים אל המדיום ההטבעה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשאיר את השקופיות יבש מתחת למכסה המנוע עבור h 1-2 (לכסות אותם כדי למנוע חשיפה קלה) ולאחסן אותם בקופסה שקופיות מיקרוסקופ ב 4 º C. הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.</li>
</ol>5. ניתוח מיקרוסקופי
<ol><li>לאחר coverslips יבשה, למקם אותם תחת המיקרוסקופ עם המטרה ואת המצלמה.</li>
	<li>להתאים את זמן החשיפה לערוץ כל כך כמה פיקסלים הם חשיפת כדי להבטיח הפצה המרבי של ערכי אפור. הערה: בזמן חשיפה הזמן עשוי להשתנות בין הערוצים, זה צריך להיות קבועה עבור ערוץ אחד להבטיח comparability בין coverslips.</li>
	<li>לרכוש תמונות מרובה ערוצים עבור 10 אזורים מעניינים (ROIs) לכל coverslip. בדוק כי רועי מכיל תהליכים עצב נוירון transfected בבדיקת ה-GFP-זריחה, אשר אמור להיות punctate.</li>
</ol>6. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>לייצא את התמונות כקבצים. tif. לטעון את התמונות לתוך OpenView18 על-ידי לחיצה על קובץ | טעינת קובץ תמונה.</li>
	<li>בחר את התמונה Synaptophysin-מורנג כערוץ 1 בתמונה Rogdi-GFP/mGFP כמו ערוץ 2, בתמונה זריחה Alexa647 כמו ערוץ 3.</li>
	<li>סף ROIs.<ol>
<li>לחץ על ניתוח | אזור מקום מעל puncta. לבחור ערכי הסף ו דלתא בעוצמה כך על בדיקה ויזואלית, זריחה ' מאטום לשקוף ' הוא נשלל, עוזב רק punctate אותות בדמותו של ערוץ 1 (זריחה Synaptophysin-מורנג ייצוג). שמור את הסף זהה עבור כל התמונות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העברת אלה ROIs לערוץ המתאים 2 (זריחה GFP-Rogdi/mGFP) ו- 3 (Syt1-זריחה) של כל אזור coverslip על ידי לחיצה על ביצוע עכשיו. הערה: ROIs צריך להיחשב רק אם התא אינו transfected כפול. בשיטה זו, זריחה מורנג GFP צריך להיות ברור לעין.</li>
	<li>לשמור את הנתונים לתוך עורך יומן ניתוח על ידי לחיצה על נתוני יומן רישום.</li>
	<li>לפתוח את עורך יומן ניתוח תחת הלשונית Windows ולהעתיק את הערכים עבור כל ערוץ. להדביק את הערכים עבור ערוצים נפרדים גיליון אלקטרוני.</li>
	<li>קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע של Syt1-הערוץ ב ROIs בתנאים שתי תרביות תאים (GFP-Rogdi ו- mGFP).</li>
	<li>החל המתאים בדיקות סטטיסטיות כגון של התלמיד במבחן t כדי לקבוע הבדלים משמעותיים.</li>
</ol>

<ol><li>Koh, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+I%2C+a+Ca2%2B+sensor+for+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release.</a> Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).</li>
<li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Does+Synaptotagmin+Trigger+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).</li>
<li>Perin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Conservation+of+Synaptotagmin+%28p65%29+in+Drosophila+and+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).</li>
<li>Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytotic+Recycling+of+Synaptic+Vesicles+in+Developing+Processes+of+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).</li>
<li>Ko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin-1+performs+neurexin-dependent+and+neurexin-independent+functions+in+synapse+validation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation.</a> The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).</li>
<li>Shinoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+enhances+spontaneous+and+activity-dependent+neurotransmitter+release+at+excitatory+terminals+but+not+at+inhibitory+terminals+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27(2014).</li>
<li>Ivanova, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25652077">Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo.</a> The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).</li>
<li>Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+impairment+of+spontaneous+neurotransmission+modulates+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy.</a> Nature Communications. 8, 1-14 (2017).</li>
<li>Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kohlsch%C3%BCtter-T%C3%B6nz+syndrome+associated+gene+Rogdi+encodes+a+novel+presynaptic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rogdi+Defines+GABAergic+Control+of+a+Wake-promoting+Dopaminergic+Pathway+to+Sustain+Sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila.</a> Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).</li>
<li>Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptic+encephalopathy+and+amelogenesis+imperfecta%3A+Kohlsch%C3%BCtter-T%C3%B6nz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Euopean+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome.</a> Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).</li>
<li>Kraszewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicle+Dynamics+in+Living+Cultured+Hippocampal+Neurons+Visualized+with+CY3-Conjugated+Antibodies+Directed+against+the+Lumenal+Domain+of+Synaptotagmin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin.</a> Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li>
<li>Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/02/08/262246">Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> bioRxiv. , 262246(2018).</li>
<li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).</li>
<li>Dresbach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regions+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+Bassoon%3A+Significance+for+synaptic+targeting+and+cytomatrix+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+Prenatal+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).</li>
<li>Tsuriel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+sharing+as+a+predominant+determinant+of+synaptic+matrix+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics.</a> PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).</li>
<li>Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Synaptic+Vesicle+Recycling+Using+FM+Dyes+During+Evoked%2C+Spontaneous%2C+and+Miniature+Synaptic+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).</li>
<li>Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Synaptic+Vesicle+Endocytosis+in+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24369372">Visualizing presynaptic function.</a> Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).</li>
<li>Opazo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+Intermixing+of+Synaptic+Vesicle+Components+upon+Vesicle+Recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling.</a> Traffic. 11, 800-812 (2010).</li>
<li>Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).</li>
<li>Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21145004">Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix.</a> Neuron. 68, 907-920 (2010).</li>
<li>Wittenmayer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Neuroligin1+regulates+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).</li>
<li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Remodeling+of+the+Presynaptic+Cytomatrix+upon+Homeostatic+Adaptation+to+Network+Activity+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing.</a> Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).</li>
<li>Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+synaptic+vesicles+in+nerve+endings+monitored+by+recovery+from+photobleaching+of+synaptic+vesicle-associated+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence.</a> Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).</li>
<li>Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+origin+of+synaptic+vesicles+undergoing+evoked+and+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion.</a> Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).</li>
<li>Han, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycosylation+Is+Essential+for+Vesicular+Targeting+of+Synaptotagmin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1.</a> Neuron. 41, 85-99 (2004).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+is+dispensable+for+sorting+of+synaptotagmin+1+but+is+critical+for+targeting+of+SV2+and+synaptophysin+to+recycling+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).</li>
<li>Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pool-specific+modification+of+neurotransmitter+release+by+intravesicular+free+radical+generation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation.</a> The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).</li>
<li>Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+pool+of+vesicles+recycles+at+rest+and+drives+spontaneous+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 45, 563-573 (2005).</li>
<li>Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+same+synaptic+vesicles+drive+active+and+spontaneous+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release.</a> Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).</li>
<li>Bacci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+blockade+of+glutamate+receptors+enhances+presynaptic+release+and+downregulates+the+interaction+between+synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated+membrane+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2.</a> Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).</li>
<li>Piccoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Controls+Synaptic+Vesicle+Storage+and+Mobilization+within+the+Recycling+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool.</a> Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).</li>
<li>Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+knockdown+of+AMPA+receptors+reveals+a+trans-synaptic+signal+for+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation.</a> The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).</li>
<li>Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/08/03/172239">Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25.</a> bioRxiv. , 172239(2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ישנם שלושה מבחני בשימוש שגרתי ללמוד שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור. השניים הראשונים כוללים את השימוש) styryl פלורסנט צבענים כמו FM1-43 (אשר לשלב ממברנות נלקחים לתוך organelles במהלך אנדוציטוזה, משתחררים לאחר אקסוציטוזה); ו- b) fluorescently מתויג חומרים SV (אשר, על ביטוי, לשלב מכונות מיחזור proteinaceous). אם fluorophores מצורף לשנות שלהם פלורסצנטיות בהתאם רמת החומציות, הם יכולים לשמש כדי לעקוב אחר השינויים בין הפנים חומצי של SV ה-pH של המדיום חוץ-תאית. החלבונים רקומביננטי מתויג בווריאציה רגיש pH של GFP נקראים Phluorins. מב...

לומד שלפוחית סינפטית מיחזור חשוב בקביעת כיצד לשנות מאפיינים presynaptic, במהלך הפלסטיות הסינפטית או בתגובה ההפרעות בתפקוד סינפטית. נוגדן ספיגת לומד Synaptotagmin-1 (Syt1) מספק שיטה אחת של מד-SV מיחזור. Syt1 הוא חלבון SV-הקשורים משמש חיישן2 + Ca, הוא הכרחי עבור שחרור exocytotic של הנוירוטרנסמיטר1,2. . זה חלבון טראנסממברנלי עם תחום cytoplasmic C-מסוף מחוץ ה-SV, תחום luminal של N-מסוף בתוך SV3... במהלך אקסוציטוזה, תחום luminal של Syt1 הופך להיות חשוף למדיום החיצוני. למדיום החיצוני זה, אנו מוסיפים נוגדנים נגד קבוצת המחשבים cytoplasmic, אשר הופך הפנימו במהלך אנדוציטוזה. נוגדנים אלו יכולים להיות שגם מראש מצומדת עם fluorophores או immunostained עם נוגדנים משניים4,5,6,7. עוצמת קרינה פלואורסצנטית immunosignal שנוצר הוא יחסי לסכום של SV מיחזור. גישה זו יכול לשמש כדי לקבוע SV מכוננת והן דפולריזציה-induced מיחזור6,8.
מבחני ספיגת Syt1 יכול להתבצע לאחר העברה גנטית וירוס בתיווך על כמעט כל התאים בצלחת או לאחר תרביות תאים דליל של מספר קטן של תאים. השיטה שלנו משלב וזמינותו עם תרביות תאים זוגיים דלילה של נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי באמצעות סידן פוספט9. אנו משתמשים חלבון רקומביננטי סמן ידוע לצבור ב presynapses, Synaptophysin fluorescently מתויגות, לאיתור מסופי presynaptic של overexpress שלנו חלבון של עניין, Rogdi. זה מאפשר לנו לבדוק אם לאו Rogdi מטרות פונקציונלי synapses ומשפיע SV מיחזור. הגן קידוד Rogdi זוהה במקור ב מסך למוטאנטים דרוזופילה מאופיין זיכרון לקוי10. בבני אדם, מוטציות בגן Rogdi לגרום מחלה נדירה ולא הרסניות הנקראת תסמונת Kohlschütter-Tönz. חולים הסובלים אמייל השיניים מומים pharmacoresistant אפילפסיה, העיכובים psychomotor; עם זאת, ההתאמה subcellular של המוצר הגן נשאר חמקמק11. לפיכך, וזמינותו ספיגת Syt1 סיפק ראיות מפתח עבור ההתאמה של GFP מתויג Rogdi הסינפסות פונקציונלי9.
טכניקה זו ספיגת יש מספר יתרונות. ראשית, SV מיחזור יכול להיות שנצפו הן בזמן אמת על ידי ביצוע חי7,הדמיה12, ואחרי קיבוע6,9 על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית של התווית זריחה Syt1. בנוסף, פותחו גרסאות שונות של נוגדן Syt1. ישנם גרסאות לא מתויגות ניתן שכותרתו עם נוגדנים משניים בעקבות פרוטוקול סטנדרטי immunostaining לאחר קיבוע, וכל הווריאנטים מצומדת מראש עם תווית פלורסצנטיות כבר מצורף. לבסוף, זריחה נוגדן מבוססי היא יתרון בשל מבחר עשיר של צבעים משניים או מצומדת זמינים מסחרית שניתן להשתמש בהם.
כאשר תיקון ו immunostaining הנוירונים, זה גם אפשרי כתם חלבונים נוספים ולבצע ניתוח colocalization. זה יכול לעזור לקבוע היכן הם ממוקמים ביחס SVs מיחזור. האינטנסיביות של התווית פלורסצנטיות היא מדד ישיר של כמות SV מיחזור. בנוסף, הנוגדנים באופן סלקטיבי תווית מבנים המכילים Syt1, וכתוצאה מכך ירידה לפרטים גבוה מעט רקע זריחה4. פרוטוקולים גירוי שונות יכולות לשמש, כגון מאגרי דפולריזציה או גירוי חשמלי פרוטוקולים9,12,13,14. עם זאת, מיחזור SV הבזליים ניתן למדוד ללא גירוי של תרבויות עצביים15.
השיטה שלנו מטפל באופן ספציפי Syt1 ספיגת נוגדן בנוירונים transfected כפול עם נוגדן משני immunolabeling לאחר קיבוע. עם זאת, אנו מתייחסים כל הווריאציות בשימוש שגרתי של וזמינותו בדיון שלנו לתת לצופים הזדמנות להתאים הפרוטוקול לצרכים הספציפיים.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>פוטומטריה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>חמור אנטי עכבר Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td>715605151</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24 באר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת (50 מ"ל)</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td></td><td></td>227261</tr><tr><td>FBS מעולה</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Merck</td><td>1,083,421,000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td> <td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסופט אקסל</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Experiment Analysis Application</td><td>תוכנה חופשית, ראה הערות</td><td></td><td>שנכתבו על ידי נועם א. זיו, הטכניון &ndash; מכון טכנולוגי לישראל, חיפה, ישראל</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים בטיחותי</td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>מס' סידורי 40649111</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1 Synaptic</td><td>Systems</td><td>105311</td><td>עכבר חד-שבטי; שיבוט 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>אמבט מים IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&nbsp;</td><td>צייס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית overexpressing חלבונים presynaptic

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

ב- active presynaptic קצות עצבים היקפיים, הסינפטיות עוברים מחזורים של מסכות, אנדוציטוזה. במהלך מיחזור, התחומים luminal של חלבונים transmembrane SV הופכים חשופים על פני התא. אחד החלבונים האלה הוא Synaptotagmin-1 (Syt1). נוגדן נגד תחום luminal של Syt1, פעם נוספו המדיום תרבות, הוא נלקח במהלך מחזור exo-endocytotic. זו תפיסה פרופורציונלית לכמות SV מיחזור, ניתן לכמת דרך immunofluorescence. כאן, אנו משלבים את ספיגת נוגדן Syt1 עם תרביות תאים כפול של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית. זה מאפשר לנו (1) בתרגום אתרי presynaptic המבוססים על ביטוי של סמן רקומביננטי presynaptic Synaptophysin, (2) לקבוע את הפונקציונליות שלהם באמצעות ספיגת Syt1 ו- (3) לאפיין את המיקוד ואת ההשפעות של חלבון של עניין, GFP-Rogdi.

תוצאה צפויה של גישה זו היא איתור כ 50 transfected כפול נוירונים לכל coverslip ב צפיפות של נוירונים 50,000 לכל טוב. הפעולה באקסון של הנוירון כל צפוי להראות נקודות חמות מרובות של מתויג fluorescently הצטברות Synaptophysin, ומציין אשכולות ofSVs. באתרים presynaptic תפקודית, האות Synaptophysin רקומביננטי colocalizes עם זריחה Syt1 punctate. GFP-Rogdi כמו החלבון עניין (איור 1) או mGFP של הפקד באמצעות תרביות תאים זוגיים, היא ביטוי במשותף עם רקומביננטי Synaptophysin.</...

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה מאוד, דורשת ציוד סטנדרטי בלבד, ונהנית מהיתרון העיקרי של נוגדנים, שהוא הספציפיות שלהם. הפרוטוקול הוצג במקור על ידי מיקלה מטאולי ועמיתיו, והוכח כיעיל ביותר. השתמשתי בו כדי לבדוק אם קורדוקטי חלבון מסוים ממוקם בסינפסות פעילות.התחל הליך זה על ידי תרבית תאי היפוקמפוס ראשוניים על תלושי כיסוי בצלחת של 24 בארות למשך שלושה ימים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. יש לחמם מראש את המדיום המצומצם בסרום, את מדיום תרבית התאים ואת המים המזוקקים ל-37 מעלות צלזיוס באמבט המים. עבדו מתחת למכסה הזרימה הלמינרי כדי להבטיח תנאי עבודה סטריליים, הכינו את תערובת הטרנספקציה בצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.ראשית, ערבבו 7.5 מיקרוליטר של סידן כלורי דו-מולארי עם ארבעה מיקרוגרם מכל DNA נטול אנדוטוקסין. הוסף מים כדי להגיע לנפח כולל של 60 מיקרוליטר בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כעת, הוסף 60 מיקרוליטר של מאגר טרנספקציה לתערובת.כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, הוסף את מאגר הטרנספקציה בטיפה תוך ניעור תערובת ה-DNA בעדינות על המערבולת. דגרו את תערובת הטרנספקציה המתקבלת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הימנע מטלטול הצינור בזמן הדגירה.מתחת למכסה המנוע הלמינר, הסר את מדיום תרבית התאים מהבארות באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, אחסן אותו במיכל נפרד והוסף מיד 500 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לכל באר. אחסן את המדיום המותנה בחממה. דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד לסיום תקופת הדגירה של 20 דקות לתערובת הטרנספקציה.לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של תערובת טרנספקציה לכל באר על ידי פיפטינג של מספר טיפות. השלך את השאריות בתחתית הצינור. לאחר שכל הבארות סופקו עם תערובת טרנספקציה, יש לנער בעדינות את צלחת 24 הבארות כדי להבטיח פיזור של תערובת הטרנספקציה במדיום.כעת דגרו על הבארות למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר הדגירה, הסר והשליך את תערובת הטרנספקציה, ושטוף את התאים שלוש פעמים במדיום תרבית תאים. שלב הכביסה הוא קריטי.צמצם את הזמן שלכל באר אין מדיום על ידי הסרה והחלפה באר אחר באר. כמו כן, הקפידו להוסיף את המדיום בעדינות. כדי לשטוף את התאים, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים לכל באר, ודגרו אותם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הסר 750 מיקרוליטר של מדיום, והוסף את אותה כמות של מדיום טרי. לאחר חזרה על תהליך זה שלוש פעמים, הסר והשליך את מדיום תרבית התאים, והוסף 450 מיקרוליטר מהמדיום המותנה היטב. כעת תנו לתאי העצב להתבגר באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד DIV 10.יש לחמם מראש 600 מיקרוליטר של מאגר דפולריזציה 1X ו-10 מיליליטר של תרבית תאים בינונית עד 37 מעלות צלזיוס באמבט המים. הוסף מיקרוליטר אחד של נוגדן Anti-Syt1 של עכבר למאגר הדפולריזציה 1X, ומערבולת למשך 10 שניות. לאחר הסרה והשלכה של מדיום תרבית התאים מהתאים, הוסף 200 מיקרוליטר מתערובת נוגדני הדפולריזציה לכל באר.דגרו את הצלחת למשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בחממה. הסר והשליך את תערובת נוגדני הדפולריזציה, ושטוף את התאים שלוש פעמים במדיום תרבית תאים. הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים לכל באר, ודגירה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הסר 750 מיקרוליטר של מדיום, והוסף את אותה כמות של מדיום טרי. חזור על תהליך זה שלוש פעמים. לאחר מכן, הסר והשליך את מדיום תרבית התאים, והוסף 300 מיקרוליטר של 4% PFA ב-1X PBS.לבסוף, דגרו במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני שטיפה שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת עם 1X PBS. לדלל את הנוגדן המשני המצמד לפלואורופור ב-200 מיקרוליטר של מאגר חוסם לכל באר בדילול של 1 עד 1,000. הסר והשליך את ה-1X PBS מכל באר המכילה תלושי כיסוי עם הנוירונים המתורבתים.הוסיפו 200 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים חוסמים לכל באר, ודגרו במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים למשך חמש דקות עם מיליליטר אחד של 1X PBS. לאחר מכן, הוסף טיפה של שבעה מיקרוליטר של מדיום הטבעה על שקופית המיקרוסקופ.הסר את הכיסוי מצלחת 24 הבארות על ידי הרמתו בעזרת צינורית ותפיסתו במלקחיים. טבלו את הכיסוי במים מזוקקים כדי להסיר את ה-PBS, וייבשו אותו בזהירות על ידי נגיעה בקצה אחד ברקמה רכה. הפוך את הכיסוי על טיפת המדיום המוטמע כך שהמשטח הנושא את התאים פונה לשקופית המיקרוסקופ, ובכך להטמיע את התאים במדיום ההטבעה.השאירו את המגלשות לייבוש מתחת למכסה המנוע למשך שעה עד שעתיים, וכסו אותן כדי למנוע חשיפה לאור. אחסן את השקופיות המיובשות בקופסת שקופיות מיקרוסקופ בארבע מעלות צלזיוס. לאחר תיוג חיסוני של נוגדן Syt1 עם נוגדן משני המסומן פלואורסצנטי, מידת הספיגה של Syt1 מכומתת לבסוף באמצעות האות החיסוני.אימונופלואורסצנציה מנוקבת מצביעה על אתרים של קליטת Syt1 בשדה הראייה. אתרים אלה מכילים אפוא שלפוחיות סינפטיות שמוחזרו במהלך הניסוי. Synaptophysin-mפלואורסצנציה כתומה מצביעה על הצטברות של שלפוחיות סינפטיות באקסון של נוירון שעבר טרנספטציה.הקרינה GFP-Rogdi מצביעה על הצטברות של רוגדי באקסון של הנוירון הטרנספטנטי. חלק זה של הניסוי חושף קו-לוקליזציה נרחבת של GFP-Rogdi ו-Synaptophysin-mOrange, מה שמרמז על כך ש-GFP-Rogdi מצטבר באתרים פרה-סינפטיים בתוך האקסון. שכבת העל חושפת אילו מההצטברות המשותפת של GFP-Rogdi ו-Synaptophysin-mOrange מתמקמות עם אתרים של קליטת נוגדנים Syt1.האתרים המסומנים בחצים מייצגים הצטברות של רוגדי רקומביננטי וסינפטופיזין רקומביננטי בסינפסות פונקציונליות. הפרוטוקול מתאר דרך פשוטה מבחינה טכנית לקבוע את היקף מיחזור השאריות הסינפטיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדע המולקולרי והתאי, כגון היכן מוקצים מסופי עצב פרה-סינפטיים באקסון של נוירון מסוים והאם חלבון רקומביננטי או אנדוגני מעניין מצטבר במסופים אלה.לאחר פיתוחה, טכניקה זו שימשה בדרכים רבות לניטור מיחזור שלפוחית סינפטית במסופים פרה-סינפטיים. לדוגמה, ניתן להשתמש בו כדי לקבוע מיחזור שלפוחית סינפטית בתאי עצב לאחר ביטוי יתר על חלבונים אדפטיביים וכן בתאי עצב המתקבלים מבעלי חיים או מתאי עצב שמקורם בתאי גזע.

an-optical-assay-for-synaptic-vesicle-recycling-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

דו"ח זה מדגים טכניקה בידוד מכני של נוירונים בודדים קיימא שמירה boutons presynaptic המצורפת. נוירונים Vibrodissociated יש את היתרונות של ייצור מהיר, שליטה מעולה תרופתי ושיפור חלל מהדק ללא השפעה של תאים שכנים. שיטה זו יכולה לשמש עבור הדמיה של אלמנטים הסינפטי ו-clamp תיקון ההקלטה.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

טכניקת דימות פלואורסצנטי לחיות לכמת את חידוש והתגייסות של שלפוחית ​​סינפטית ספציפי (SV) בריכות במסופי העצבים המרכזית מתוארת. שני סיבובים של SV מיחזור מנוטרים על מסופי העצב אותו מתן הבקרה הפנימית.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

סרטון זה מדגים את ההליך להכנת תאי עצב בתרבית לניתוח אופטי של שלפוחיות סינפטיות ממוחזרות. התהליך כולל תיוג פלואורסצנטי של חלבוני שלפוחית סינפטית וצביעת מערכת החיסון כדי לתייג ולדמיין את השלפוחיות הממוחזרות בתוך הנוירונים.

הכנת תאי עצב בתרבית לאנליזה אופטית של בועיות סינפטיות ממוחזרות

אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית ​​הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

יכול להיות מאופנן דעתנית עצביים באמצעות תהליך דינאמי של אנדו - אקסוציטוזה של רצפטורים גלוטמט ionotropic סינאפסות. המתוארים כאן הוא assay הנגיש, תיכון-תוכן לכימות תנועת משטח ופנימיים קולטן האוכלוסייה בריכות.

וזמינותו גבוהים-תוכן עבור ניטור אמפא קולטן סחר

היווצרות preסינפסה הוא תהליך דינמי כולל הצטברות של חלבונים סינפטית בסדר הנכון. בשיטה זו, היווצרות preסינפסה מופעלות על ידי חרוזים מצועם עם חלבון preסינפא מארגן על גיליונות סיבי של "כדור תא העצב" התרבות, כך הצטברות של חלבונים סינפטית קל להיות מנותח במהלך היווצרות preסינפסה.

שיטת היווצרות טרום-סינפסה באמצעות חרוזי סדרן ותרבות "תא כדור"

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

למד שיטה אופטית פשוטה לניתוח מיחזור שלפוחיות סינפטיות בנוירונים היפוקמפיים בתרבית. השיטה משתמשת בנוגדנים ספציפיים ובהעברת גנים כדי לזהות אתרים פרה-סינפטיים ולהעריך את השפעת חלבונים על תהליכי מיחזור.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

גלה סרטונים נוספים