שמירה על תרבויות ביולוגי מדידה ביטוי גנים ב Aphis nerii: מערכת Non-מודל עבור אינטראקציות צמח-חרק

שיטה זו מתארת שלבים כלליים לגידול כנימות ושלבים לניתוח גנטי של כנימות. ניתן ליישם שיטות אלו כדי לענות על שאלות מפתח באבולוציה ובאקולוגיה של כנימות ובמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הביולוגיה של הכנימות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה בדרך כלל על רוב מיני הכנימות ולבצע אותה בעלות נמוכה יחסית.

התחל במילוי מגש שתילים רגיל באדמת תערובת נביטה, תוך הקפדה שהאדמה תגיע לראש הבארות. לאחר מילוי כל הבארות, צרו חור בעומק של שלושה סנטימטרים באדמה של כל באר והניחו זרע אחד בכל חור. השקה את התאים עד שהאדמה המכסה את הזרעים רוויה והניח את המגש בחממה עם השקיה יומית עד יומיומית, כדי לשמור על רמת לחות קרקע מתונה.

כאשר השתילים גדלו סט העלים המלאים הראשון שלהם, ממלאים עציצים עגולים בגודל ארבעה סנטימטרים באדמת עציצים, עד כחמישה סנטימטרים מתחת לשפה. צרו שלם באדמה עמוק מספיק כדי להגיע לתחתית העציץ וגרפו בעדינות את השתילים הבוגרים ביד כדי למקם אותם עמוק בתוך החורים בעציצים החדשים. לאחר מכן, מכסים את השתילים באדמה ומשקים את השתילים מדי יום עד כל יומיים כדי לשמור על רמת לחות קרקע מתונה.

כאשר הצמחים גדלו לפחות שלושה עד ארבעה סטים של עלים מלאים וגובהם לפחות עשרה סנטימטרים, בדוק ידנית את הצמחים לאיתור מזיקים לא רצויים והשתמש בפיפטה בפה כדי להעביר בזהירות שדה רבייה יחיד שנאסף כנימה בוגרת על העלה של הצמח הראשון כדי ליצור קו איזו-שבטי. לאחר שכל הכנימות הועברו, כסו היטב את הצמחים בכלוב כוסות בהתאמה אישית, והניחו את הצמחים הנגועים בכנימות בתא סביבה מבוקר. כדי לשמור על אוכלוסיות המלאי, השתמש בפיפטה בפה כדי להעביר בבטחה נימפה אחת עד שלוש נימפות שנייה או שלישית, וכנימה בוגרת אחת, לצמח חדש על בסיס שבועי.

וכסו כל צמח בכלוב כוסות חדש לתרבית כפי שהודגם. למיצוי DNA מכנימה בוגרת אחת, הניחו את הכנימה ליד החלק התחתון של צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר המכיל חנקן נוזלי וטחנו את הכנימה עם עלי. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור המיקרו-צנטריפוגה והמשיך לטחון את הכנימה הכתושה עד שהדגימה מתפרקת באופן גלוי.

שוטפים את העלי עם 100 מיקרוליטר נוספים של מאגר ליזה, ודוגרים על כנימת הקרקע בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בסוף הדגירה מוסיפים 14 מיקרוליטר של אמולור אשלגן אצטט לצינור והופכים לערבוב. לאחר 30 דקות על הקרח, אספו את הפסולת התאית על ידי צנטריפוגה והעבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר מבלי להפריע לגלולה.

הוסף 200 מיקרוליטר של אתנול קר 100 אחוז בדרגה מולקולרית לסופרנטנט והפוך את הצינור לערבוב. לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, אספו את ה- DNA המשקע על ידי צנטריפוגה, והוציאו את האתנול באמצעות פיפטה. השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של אתנול קר 70 אחוז בדרגה מולקולרית עם הבהוב לשטיפת צנטריפוגה שנייה.

ולהשעות את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של אתנול טרי וקר 100 אחוז בדרגה מולקולרית. לאחר הצנטריפוגה השלישית, הנח את הצינור בצורה אופקית על פיסת נייר טישו לייבוש אוויר למשך חמש עד עשר דקות. ולהשעות מחדש את כדור ה-DNA ב-80 מיקרוליטר של טריס אדטה נמוך.

לאחר מכן, כמת את ה-DNA המושעה בספקטרופוטומטר, ואחסן את הדגימה הנותרת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר ריסוק של עד חמש כנימות בוגרות בחנקן נוזלי כפי שהודגם, העבירו את הדגימה למכסה אדים והוסיפו 800 מיקרוליטר של מגיב מיצוי גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם לצינור הדגימה. הומוגניזציה של הדגימה עם עלי ודגירה על ההומוגנאט למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף לדגימה 160 מיקרוליטר כלורופורם, ולאחר מכן 15 שניות של ניעור נמרץ ביד. לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך שתיים-שלוש דקות בטמפרטורת החדר ובצנטריפוגה כדי לאסוף את ה-RNA שחולץ. כדי לזרז את ה-RNA, העבירו את הפאזה המימית לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ללא RNS מבלי להפריע לשלב הביניים, והוסיפו 400 מיקרוליטר של איזופרופנול ל-RNA.

לאחר דגירה של עשר דקות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס, אספו את ה-RNA המשקע על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, שטפו את הדגימה פעמיים עם מיליליטר אחד של 75 אחוז אתנול במים שטופלו בדיאתיל פירוקרבונט, לדגימה עם מערבולת איטית וצנטריפוגה כדי להסיר מזהמי פנול. לאחר הכביסה השנייה, לרוב יבשו את הכדור באוויר במשך חמש עד עשר דקות על ספסל סטרילי, והמיסו את כדור ה-RNA ב-30 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד עם פיפטינג עדין לפני דגירה של עשר עד 15 דקות בטמפרטורה של 55 עד 60 מעלות צלזיוס.

לזרעים ייקח כשבועיים עד ארבעה שבועות, תלוי בעונה, לגדול מספיק כדי לשתול מחדש. שתילים מחודשים ייקח עוד שבועיים עד ארבעה שבועות לגדול לגודל אופטימלי לתרבית כנימות. העין הבוגרת נבדלת על ידי זנב כהה, ועשויה להיות חסרת כנף או מכונפת.

רפידות כנפיים מתפתחות הופכות לגלויות כאשר נימפות מגיעות לכוכב השלישי. אדם בוגר יחיד יניב כ-100 עד 200 ננוגרם למיקרוליטר DNA ו-150 עד 300 ננוגרם למיקרוליטר RNA. לאחר מכן ניתן לחשב את הביטוי היחסי של גן מועמד בתנאי טיפול שונים.

כאשר מנסים הליך זה חשוב לא לזהם את המניות האיזו-שבטיות שלך. כמו כן, זכור שאיכות הכנימות שלך תלויה מאוד באיכות הצמחים שלך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מיצוי וטכניקות ריצוף אחרות כדי לענות על שאלה לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הביולוגיה של הכנימות.