Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

שיטה זו יכולה לשמש ככלי אבחון לסרטן כדי לנתח את ה-DNA הגידול במחזור. טכניקה זו חוקרת שינויים גנטיים מרובים באזורים של מוטציות אשכול בתגובה אחת. זה עוזר לחסוך דגימות מטופל יקרות.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לנטל הגידול על הפרופיל המוטציה שלה. עכשיו זה יכול להיות מיושם גם על ניתוח מולקולרי כחלופה qPCR כדי להשיג כימות מוחלט של רצפי יעד חומצת גרעין. לאסוף דגימות דם בצינורות EDTA שבעה מיליליטר.

שני צינורות מומלץ לאסוף סביב ארבעה מיליליטר של פלזמה. צנטריפוגה דגימות הדם במשך 10 דקות ב 820 פעמים כוח הכבידה בתוך שלוש שעות של הדם לצייר להפריד תאי דם אדומים, תאי דם לבנים, ופלזמה. הזמן בין הדגימה לצנטריפוגה הוא קריטי כדי להשיג דנ"א ללא תאי T ברמה גבוהה שלא מזוהם בדנ"א ששוחרר מתאי דם לבנים.

לאחר הצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי לאסוף את העל-טבעי מבלי לגעת בשכבת תאי הדם הלבנים. סביב שני מיליליטר של פלזמה הם התאוששו בדרך כלל לכל צינור EDTA. לאחר העברת הפלסמות לשני צינורות מיליליטר, צנטריפוגה aliquots ב 16, 000 פעמים כוח הכבידה במשך 10 דקות ב 15 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת התא.

בזהירות לאסוף את הפלזמה מבלי להפריע גלולה ולהעביר שני צינורות קריוגני מיליליטר. יש לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס שליליות עד לצורך. התחל על ידי הוספת 400 microliters של proteinase K לצינור 50 מיליליטר.

לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של פלזמה ו 3.2 מיליליטר של מאגר תזה ACL המכיל מיקרוגרם אחד של RNA נושאת מערכת החילוץ. סוגרים את הצינור ומערבבים על ידי מערבולת במשך 30 שניות כדי להשיג פתרון הומוגני. לאחר מכן, דגירה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, מוסיפים 7.2 מיליליטר של ACB חיץ לליזט כדי לייעל את הכריכה של חומצות הגרעין במחזור לממברנה סיליקה. מערבבים על ידי מערבולת במשך 15 עד 30 שניות. לאחר מכן, דגירה הצינור על קרח במשך חמש דקות.

חבר את העמודה ואת מאריך 20 מיליליטר על משאבת ואקום. סגור את החלקים שאינם שימוש כדי לאפשר שאיפת ואקום. לאחר צנטריפוגה קצרה את הצינור, בזהירות להציג את התערובת לתוך מאריך הצינור.

לאחר מכן הפעל את משאבת ואקום ולאפשר lysate להיות נמשך דרך העמודים לחלוטין. הסר והשליך את מאריך הצינור. לאחר מכן, החל 600 מיקרוליטרים של ACW1 של מאגר על העמודה.

כאשר מאגר ACW1 נמשך דרך העמודה, הוסף 750 מיקרוליטרים של מאגר ACW2, ולבסוף, 750 מיקרוליטרים של 96 עד 100%אתנול. לאחר מכן, מניחים את העמוד בצינור איסוף נקי של שני מיליליטר וצנטריפוגה במלוא המהירות במשך שלוש דקות כדי לחסל אתנול. לאחר הנחת העמוד לתוך צינור איסוף חדש שני מיליליטר, לפתוח את המכסה ולאחר מכן דגירה ב 56 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לייבש את הממברנה לחלוטין.

לאחר הדגירה, מניחים את העמוד לתוך צינור נקי 1.5 מיליליטר נמוך מחייב. יש למרוח בזהירות 36 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase עם 0.04% נתרן אזיד. לאחר מכן, לסגור את המכסה דגירה בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.

צנטריפוגה במלוא המהירות שוב לדקה אחת כדי לחמק חומצות הגרעין. לאחר מכן, יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס שליליות עד לצורך. התחל בהפשרה ובשיווי משקל של רכיבי התגובה לטמפרטורת החדר במכסה המנוע הנקי של PCR.

לאחר מכן הכינו תערובת של 20 פעמים של פריימרים ובדיקות במים מזוקקים נטולי RNase ו- Dnase עם כל פריימר בריכוז של 18 מיקרומולרים וכל בדיקה בריכוז של חמישה מיקרומולרים. עבור כל התגובות PCR בודדים, להכין תערובת מדגם על ידי שילוב של 10 microliters של פעמיים ddPCR Supermix, microliter אחד של 20 פעמים פריימרים ובדיקות לערבב, עד 10 ננוגרם של דגימת ה-DNA ב 20 microliters של מים מזוקקים. מערבולת תערובת התגובה ביסודיות כדי להבטיח הומוגניות.

ולזמן קצר צנטריפוגה כדי לאסוף תוכן בתחתית הצינור לפני חלוקת. הכנס את מחסנית ddPCR למחזיק וטען 20 מיקרוליטרים של תערובת תגובה לדוגמה לתוך הבארים האמצעיות של המחסנית עבור ייצור טיפה. מוסיפים 70 מיקרוליטרים של שמן גנרטור טיפות לתוך בארות התחתונות.

הכנס את המחסנית עם אטם לגנרטור טיפה. טיפות ייוצרו בארות העליונות של המחסנית. לאט ובעדינות שאפו 40 מיקרוליטרים של טיפות מהמחסניות והתחלקו לצלחת PCR עם 96 באר.

לאטום את צלחת PCR הסופית עם רדיד אלומיניום באמצעות אטם צלחות מיד לאחר העברת טיפות כדי למנוע אידוי. בקצרה צנטריפוגה הצלחת כדי לאסוף תוכן בתחתית הבארות. הפעל הגברה קונבנציונלית של PCR על רכיב מחזור תרמי.

כאשר הריצה הושלמה, בקצרה צנטריפוגה הצלחת כדי לאסוף תוכן בתחתית הבארות. לאחר הגברה PCR, להשתמש בקורא טיפות לספור טיפות PCR חיובי PCR שלילי PCR בעקבות הוראות היצרן. להלן תוצאות מייצגות שהושגו במהלך שלבי אופטימיזציה של הבדיקה הנפתחת ddPCR.

תמונה זו מראה זיהוי של דנ"א מוטנט ודנ"א מסוג פראי בתגובה המכילה 100% דנ"א מוטנטים, דנ"א מוטנטים 5% ו-100% דנ"א פראי. תמונה זו מציגה דוגמאות של דגימות פלזמה שנותחו עם KRAS ו EGFR הנפתח ddPCR תערוכות מראה זיהוי של נוקלאוטיד יחיד תחליפים מרובים exon שתיים של KRAS ומחיקה ב EGFR exon 19. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להמשיך בזהירות בכל שלב עם תשומת לב מיוחדת בדור טיפות, שהוא צעד קריטי של שיטה זו.

לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקר וקלינאי בתחום חקר הסרטן כדי לייעל את ניתוח מוטציות הגידול באמצעות ביופסיה נוזלית.