Name: Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: למד את שיטת drop-off ddPCR לאבחון סרטן באמצעות זיהוי DNA של גידול מסתובב בדם. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מרובה מוטציות בתגובה אחת תוך חיסכון בדגימות יקרות ערך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכון קירי SiRIC (גרנט האינקה-DGOS-4654). המחברים רוצים גם להודות קרוליין Hego על תרומתה הווידאו.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
<li>Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li>
<li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li>
<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

מספר סופרים נקראים הממציאים של שתי בקשות לפטנטים (EP17305920.5, EP18305277.8) הקשורה ctDNA האיתור.

כדי לעצב assay ddPCR יעילה מסירה, אופטימיזציה הוא מכריע, הפרוטוקול צריך להתבצע בזהירות. כל שילוב של צבעי יסוד וזונדים יש יעילות התגובה הייחודי של ה-PCR. לפיכך, וזמינותו הפרט חייב לאשר בקפידה על דגימות הבקרה לפני בשימוש על ערך הבדיקה דוגמאות. אופטימיזציה ובדיקת חשובים לאשר את שיא אות זיהוי והערכת ירידה לפרטים ורגישות. כמפורט בפרוטוקול, יכול כל המוטציות ממוקם באזור היעד מכוסה על ידי "החללית 2" פוטנציאל להיחקר. למרות זאת, אימות מומלצת מוטציות ממוקם בקצה 5' או 3' של "בדיקה 2", שכן אלה עלולים להשפיע על יעילות וזמינותו מסירה.<...

אלפי סומאטית מוטציות הקשורות להתפתחות סרטן כבר דווח על1. בין אלה, כמה סמנים חזוי יעילות של טיפול ממוקד 2,3 , גנטית ההקרנה של מוטציות אלו היא עכשיו שגרתית הקלינית. הטכנולוגיה הדיגיטלית droplet PCR (ddPCR) יכול לשמש כדי לפקח על הנוכחות או העדר של מוטציות עם דיוק זיהוי גבוהה והוא מאוד תואם עם ביופסיות נוזלי לא פולשנית4,5. עם זאת, מבחני ddPCR הנוכחי נועדו בעיקר כדי לזהות מוטציות ידוע א-פריורי. קשות, זה מגביל את השימוש ddPCR ככלי גילוי כאשר המוטציה לא ידוע. אכן, עיצוב ddPCR המקובלת, בדיקה הידרוליזה להכרת אלל פראי-סוג (WT העצמית) מתחרה עם בדיקה ספציפית להכרת אלל mutant (בדיקה MUT) (איור 1 א'). החללית עם זיקה גבוהה יותר hybridizes על תבנית ומשחרר שלה fluorophore, המציין את אופי אלל המתאימים. ניתן לאבחן את נתוני קרינה פלואורסצנטית השיג עבור כל droplet בחלקה פיזור המייצג את קרינה פלואורסצנטית הנפלטת את הגששים WT ו MUT בממדים שונים. ייצוג סכמטי של תוצאה אופיינית עבור assay ddPCR המקובלת מוצג איור 1A. בדוגמה זו, הענן הכחול מקביל טיפות המכילות אללים WT המזוהה על-ידי החללית WT, ואילו הענן האדום מקביל טיפות בו אלל MUT יש כבר מוגבר, מזוהה על ידי החללית MUT. תלוי בכמות הדנ א שטעון התגובה, טיפות חיובית כפולה המכילה amplicons WT והן MUT יכולים להופיע (ענן ירוק). ענן אפור בהיר מקביל טיפות ריק.
מאז רוב פלטפורמות לאפשר הגילוי של מספר מוגבל של fluorophores (בדרך כלל 2, אבל עד 5), התפוקה של ddPCR המקובלת היא מוגבלת. לכן, מיקוד באזורים בעלי מוטציות סמוכים מרובים דורשת תכנון טכנית מאתגר מבחני ddPCR מולטיפלקס או השימוש של מספר תגובות מיקוד כל מוטציה במקביל. האסטרטגיה ddPCR מסירה, מתגבר על מגבלה זו, כפי שעשוי להיות ניתן לזהות כל שינוי גנטי בתוך אזור היעד באמצעות זוג ייחודי של WT הידרוליזה הגששים. הכריכה בדיקה (בדיקה 1) הראשון שרצף שאינו משתנה, סמוך לאזור היעד המכשיר השני (המכשיר 2) הוא משלים הרצף WT של אזור היעד שבו מוטציות הם צפויים (איור 1B). בעוד החללית הראשונה מכמת את הסכום הכולל של המולקולות amplifiable של התגובה, המכשיר השני מפלה אללים WT ו MUT על ידי הכלאה תת אופטימלית כדי mutant רצפי. בדיקה 2 ניתן לזהות מספר סוגים של מוטציות בהיעד אזור (נוקלאוטיד בודד או מספר החלפות, מחיקה וכו ')6. כמו ddPCR רגיל, ענן אפור בהיר מקביל טיפות המכילה מולקולות DNA אין. חשוב לזכור כי בסוג זה של assay, ההפרדה אופטימלית של עננים WT ו MUT הוא תלוי כמות ה-DNA שטעון התגובה, שכן לא ניתן להבחין בין טיפות המכילות WT והן MUT אללים היעד של טיפות המכיל רק את WT טופס. לכן, וזמינותו זו דורשת רוב טיפות יכיל לא יותר מעותק אחד של הגן יישוב.

<table><tbody><tr><td>שפופרת K2EDTA (קוד צבע: לבנדר)</td> צינורות <td>BD</td><td>367863</td><td>EDTA משמשים להשגת דגימת דם מלא או פלזמה EDTA</td></tr><tr><td>ערכת חומצות גרעין במחזור QIAamp (פרוטוקול ידני)</td> <td>Qiagen</td><td>55114</td><td>לבידוד DNA במחזור חופשי מפלזמה אנושית</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP ערכת DNA במחזור (פרוטוקול אוטומטי)</td> <td>Qiagen</td><td>937556</td><td>לבידוד DNA במחזור חופשי מפלזמה אנושית</td></tr><tr><td>מערכת QIAsymphony SP</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>מערכת משולבת ואוטומטית במלואה לטיהור cfDNA, DNA או RNA</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>לטיהור של עד 24 cfDNA בו זמנית</td></tr><tr><td>פלואורומטר קיוביט</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>הפלואורומטר של קיוביט הוא פלואורומטר שולחני לכימות קורא DNA</td></tr><tr><td>QX100 או QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 או 186-4003, בהתאמה</td><td>הקורא מודד את עוצמת הקרינה של כל טיפה ומזהה את הגודל והצורה כאשר טיפות עוברות את הגלאי</td></tr><tr><td>מחולל טיפות QX100 או QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 או 186-4002, בהתאמה</td><td>מכשיר המשמש לדור טיפות</td></tr><tr><td>C1000 מחזור תרמי</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>פלטפורמת מחזור תרמית מודולרית, כוללת שלדת מחזור תרמי C1000 Touch, מודול תגובה מהירה 96 בארות</td></tr><tr><td>אוטם צלחות</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; אוטם צלחת PCR</td></tr><tr><td>מחזיק מחסנית DG8</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>מיקומים ומחזיק את מחסנית DG8 במכשיר ליצירת</td></tr><tr><td>טיפות מחסניות ואטמים של מחולל טיפות</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>מחסנית Microfluidic DG8 המשמשת לערבוב דגימה ושמן ליצירת טיפות; אטמי DG8 אוטמים את המחסנית כדי למנוע אידוי ומפעילים את הלחץ הנדרש להיווצרות טיפות</td></tr><tr><td>PCR supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR supermix לבדיקות (ללא dUTP)</td></tr> <tr><td>לוחות PCR 96 בארות</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>צלחות חצי חצאיות 96 בארות</td></tr><tr><td>חותם נייר כסף</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>אטם חום נייר כסף ניתן לניקוב</td></tr><tr><td>ddPCR קורא טיפות שמן</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td>שמן המשמש בקריאה</td></tr><tr><td>שמן ליצירת טיפות לבדיקות</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>שמן ליצירת טיפות</td></tr><tr><td>DNA loBind Tube 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Eppendorf LoBind Tubes ממקסמים את התאוששות הדגימה על ידי הפחתה משמעותית של כריכת דגימה למשטח</td></tr><tr><td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>תקני הייחוס של Multiplex I cfDNA הם חומרי ייחוס מאופיינים מאוד, רלוונטיים ביולוגית המשמשים להערכת הביצועים של מבחני cfDNA המזהים מוטציות סומטיות</td></tr><tr><td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>בדיקת HS סלקטיבית ביותר עבור DNA דו-גדילי (dsDNA) על פני RNA והיא מתוכננת להיות מדויקת עבור ריכוזי דגימה ראשוניים מ-10 pg/&micro; L עד 100 ng/&micro; צינורות</td></tr><tr><td>בדיקה L Qubit</td> Life <td>Technologies</td><td>Q32856</td><td>צינורות בדיקת Qubit הם 500 ומיקרו; צינורות פוליפרופילן דקי דופן L לשימוש עם הפלואורומטר של קיוביט</td></tr></tbody></table>

droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet דיגיטלי תגובת שרשרת פולימראזית (ddPCR) היא שיטה תגובת שרשרת (PCR) רגישה מאוד פולימראז כמותי המבוסס על מדגם fractionation לאלפי בגודל ננו תגובות בודדות מים בתוך שמן. לאחרונה, ddPCR הפך להיות אחד הכלים הכי מדויק ורגיש עבור מחזור הגידול זיהוי ה-DNA (ctDNA). אחת המגבלות הגדולות של הטכניקה ddPCR רגיל הוא מספר מוגבל של מוטציות יכולים להיות מוקרן לכל תגובה, כנדרש הגששים הידרוליזה ספציפי לזהות כל גירסה allelic אפשרי. מתודולוגיה חלופיים, ddPCR מסירה, מגדיל את התפוקה, מכיוון שהיא דורשת רק זוג אחד של הגששים כדי לזהות ולכמת באופן פוטנציאלי כל שינויים גנטיים באזור ממוקד. מסירה ddPCR מציג רגישות דומה ddPCR קונבנציונאלי מבחני עם היתרון של זיהוי מספר רב יותר של מוטציות בתגובה אחת. שזה חסכוני, חוסך חומר מדגם היקר, יכול לשמש גם ככלי גילוי כאשר מוטציות לא ידועים א-פריורי.

במחקר הוכחה הרעיון, קראס אקסון 2 מוטציות (codons 12 ו 13) ומחיקות EGFR אקסון 19 נחקרו FFPE רקמות ו פלזמה דגימות חולי סרטן באמצעות אסטרטגיה ddPCR6מסירה.
המכשיר מסירה קראס חקרו אזור bp 16 המקיף מספר מוטציות ב אקסון 2 של הגן קראס , אשר הנמל יותר מ 95% של מוטציות קראס ידוע סרטן אנושיים11. החללית ההפניה היה 20 bp ב אורך ו-3 bp במורד הזרם. כדי...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

שיטה זו יכולה לשמש ככלי אבחון לסרטן כדי לנתח את ה-DNA הגידול במחזור. טכניקה זו חוקרת שינויים גנטיים מרובים באזורים של מוטציות אשכול בתגובה אחת. זה עוזר לחסוך דגימות מטופל יקרות.שיטה זו יכולה לספק תובנה לנטל הגידול על הפרופיל המוטציה שלה. עכשיו זה יכול להיות מיושם גם על ניתוח מולקולרי כחלופה qPCR כדי להשיג כימות מוחלט של רצפי יעד חומצת גרעין. לאסוף דגימות דם בצינורות EDTA שבעה מיליליטר.שני צינורות מומלץ לאסוף סביב ארבעה מיליליטר של פלזמה. צנטריפוגה דגימות הדם במשך 10 דקות ב 820 פעמים כוח הכבידה בתוך שלוש שעות של הדם לצייר להפריד תאי דם אדומים, תאי דם לבנים, ופלזמה. הזמן בין הדגימה לצנטריפוגה הוא קריטי כדי להשיג דנ"א ללא תאי T ברמה גבוהה שלא מזוהם בדנ"א ששוחרר מתאי דם לבנים.לאחר הצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי לאסוף את העל-טבעי מבלי לגעת בשכבת תאי הדם הלבנים. סביב שני מיליליטר של פלזמה הם התאוששו בדרך כלל לכל צינור EDTA. לאחר העברת הפלסמות לשני צינורות מיליליטר, צנטריפוגה aliquots ב 16, 000 פעמים כוח הכבידה במשך 10 דקות ב 15 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת התא.בזהירות לאסוף את הפלזמה מבלי להפריע גלולה ולהעביר שני צינורות קריוגני מיליליטר. יש לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס שליליות עד לצורך. התחל על ידי הוספת 400 microliters של proteinase K לצינור 50 מיליליטר.לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של פלזמה ו 3.2 מיליליטר של מאגר תזה ACL המכיל מיקרוגרם אחד של RNA נושאת מערכת החילוץ. סוגרים את הצינור ומערבבים על ידי מערבולת במשך 30 שניות כדי להשיג פתרון הומוגני. לאחר מכן, דגירה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר הדגירה, מוסיפים 7.2 מיליליטר של ACB חיץ לליזט כדי לייעל את הכריכה של חומצות הגרעין במחזור לממברנה סיליקה. מערבבים על ידי מערבולת במשך 15 עד 30 שניות. לאחר מכן, דגירה הצינור על קרח במשך חמש דקות.חבר את העמודה ואת מאריך 20 מיליליטר על משאבת ואקום. סגור את החלקים שאינם שימוש כדי לאפשר שאיפת ואקום. לאחר צנטריפוגה קצרה את הצינור, בזהירות להציג את התערובת לתוך מאריך הצינור.לאחר מכן הפעל את משאבת ואקום ולאפשר lysate להיות נמשך דרך העמודים לחלוטין. הסר והשליך את מאריך הצינור. לאחר מכן, החל 600 מיקרוליטרים של ACW1 של מאגר על העמודה.כאשר מאגר ACW1 נמשך דרך העמודה, הוסף 750 מיקרוליטרים של מאגר ACW2, ולבסוף, 750 מיקרוליטרים של 96 עד 100%אתנול. לאחר מכן, מניחים את העמוד בצינור איסוף נקי של שני מיליליטר וצנטריפוגה במלוא המהירות במשך שלוש דקות כדי לחסל אתנול. לאחר הנחת העמוד לתוך צינור איסוף חדש שני מיליליטר, לפתוח את המכסה ולאחר מכן דגירה ב 56 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לייבש את הממברנה לחלוטין.לאחר הדגירה, מניחים את העמוד לתוך צינור נקי 1.5 מיליליטר נמוך מחייב. יש למרוח בזהירות 36 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase עם 0.04% נתרן אזיד. לאחר מכן, לסגור את המכסה דגירה בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.צנטריפוגה במלוא המהירות שוב לדקה אחת כדי לחמק חומצות הגרעין. לאחר מכן, יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס שליליות עד לצורך. התחל בהפשרה ובשיווי משקל של רכיבי התגובה לטמפרטורת החדר במכסה המנוע הנקי של PCR.לאחר מכן הכינו תערובת של 20 פעמים של פריימרים ובדיקות במים מזוקקים נטולי RNase ו- Dnase עם כל פריימר בריכוז של 18 מיקרומולרים וכל בדיקה בריכוז של חמישה מיקרומולרים. עבור כל התגובות PCR בודדים, להכין תערובת מדגם על ידי שילוב של 10 microliters של פעמיים ddPCR Supermix, microliter אחד של 20 פעמים פריימרים ובדיקות לערבב, עד 10 ננוגרם של דגימת ה-DNA ב 20 microliters של מים מזוקקים. מערבולת תערובת התגובה ביסודיות כדי להבטיח הומוגניות.ולזמן קצר צנטריפוגה כדי לאסוף תוכן בתחתית הצינור לפני חלוקת. הכנס את מחסנית ddPCR למחזיק וטען 20 מיקרוליטרים של תערובת תגובה לדוגמה לתוך הבארים האמצעיות של המחסנית עבור ייצור טיפה. מוסיפים 70 מיקרוליטרים של שמן גנרטור טיפות לתוך בארות התחתונות.הכנס את המחסנית עם אטם לגנרטור טיפה. טיפות ייוצרו בארות העליונות של המחסנית. לאט ובעדינות שאפו 40 מיקרוליטרים של טיפות מהמחסניות והתחלקו לצלחת PCR עם 96 באר.לאטום את צלחת PCR הסופית עם רדיד אלומיניום באמצעות אטם צלחות מיד לאחר העברת טיפות כדי למנוע אידוי. בקצרה צנטריפוגה הצלחת כדי לאסוף תוכן בתחתית הבארות. הפעל הגברה קונבנציונלית של PCR על רכיב מחזור תרמי.כאשר הריצה הושלמה, בקצרה צנטריפוגה הצלחת כדי לאסוף תוכן בתחתית הבארות. לאחר הגברה PCR, להשתמש בקורא טיפות לספור טיפות PCR חיובי PCR שלילי PCR בעקבות הוראות היצרן. להלן תוצאות מייצגות שהושגו במהלך שלבי אופטימיזציה של הבדיקה הנפתחת ddPCR.תמונה זו מראה זיהוי של דנ"א מוטנט ודנ"א מסוג פראי בתגובה המכילה 100% דנ"א מוטנטים, דנ"א מוטנטים 5% ו-100% דנ"א פראי. תמונה זו מציגה דוגמאות של דגימות פלזמה שנותחו עם KRAS ו EGFR הנפתח ddPCR תערוכות מראה זיהוי של נוקלאוטיד יחיד תחליפים מרובים exon שתיים של KRAS ומחיקה ב EGFR exon 19. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להמשיך בזהירות בכל שלב עם תשומת לב מיוחדת בדור טיפות, שהוא צעד קריטי של שיטה זו.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקר וקלינאי בתחום חקר הסרטן כדי לייעל את ניתוח מוטציות הגידול באמצעות ביופסיה נוזלית.

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בסרטון זה, אנו מציגים הליך שלב אחר שלב ליצירת ננו-טיפות מתחלבות לזיהוי חומצות גרעין מטרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית או dPCR.

תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית: שיטה ליצירת תגובות PCR ננו-טיפתיות לאיתור מוטציות סרטניות נדירות

סרטון זה מדגים את תפקידה של תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית בזיהוי מוטציה אינדל בדגימת DNA. הדיוק והרגישות הגבוהים של ddPCR מאפשרים זיהוי מדויק ועקבי של מוטציות נדירות הקיימות בדגימה, גם ברמות נמוכות. הוא יכול לזהות ולכמת מוטציות אינדל באזורים שונים של הגנום, ומספק תובנות חשובות על מנגנוני המוטציה וההשלכות התפקודיות של מוטציות אלה.

תגובת שרשרת דיגיטלית של פולימראז טיפתי לזיהוי מוטציות אינדל בגני מטרה

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ה-PCR הדיגיטלי הדו-צדדי (ddPCR) – שינוי של טכניקת ה-PCR המסורתית השימושית בזיהוי שני סמנים גנטיים שונים בו זמנית. תגובת PCR יחידה מחולקת לטיפות מתחלבות בגודל ננוליטר המועצמות באופן עצמאי, וזיהוי אותות הגברה פלואורסצנטיים בצבעים שונים מחלק הטיפות משמש לחישוב הריכוז ההתחלתי של רצפי המטרה.

PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של סמנים גנטיים כפולים

סרטון זה מדגים את טכניקת תגובת השרשרת של פולימראז טיפות מרובות לכימות סימולטני של אזורי DNA מתילציה באוכלוסיות תאי דם לבנים שונות כסמן ביולוגי מוקדם לאבחון קליני ופרוגנוזה.

תגובת שרשרת של Multiplex Droplet Polymerase לזיהוי מתילציה של DNA בלויקוציטים

סרטון זה מדגים את התועלת של PCR דיגיטלי בפורמט שבב בצינור לזיהוי וריאציות נוקלאוטידים בודדים בדגימות DNA. תגובת PCR יחידה מחולקת לחדרים הפועלים כתגובות PCR עצמאיות, וזיהוי אותות פלואורסצנטיים מהמטרות המוגברות בתאים משמש לחישוב תדירות האלל המשתנה בדגימה.

PCR דיגיטלי מבוסס שבב בצינור לכימות גרסאות נוקלאוטידים בודדים

PCR חוסם מסוג פרא ואחריו ריצוף ישיר מציע שיטה רגישה ביותר לזיהוי מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (PCR) הוא כלי שימושי עבור גילוי רגישות גבוהה של נוקלאוטיד יחיד גרסאות ו- DNA עותק מספר גרסאות. . הנה, נדגים שיקולים מרכזיים למדידת גרסאות נדיר הגנום האנושי באמצעות PCR דיגיטלי עם התבנית שבב-ב--שפופרת.

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

שרשרת פולימראז משופר שיטת פולימורפיזם תגובת הגבלה שבר אורך עבור genotyping מיני נפוחיתיים ידי ספקטרומטריית נוזלי כרומטוגרפיה / מסה מתוארת. טור מונולית סיליקה הפוכה פאזיים מועסק להפרדת amplicons מתעכל. שיטה זו יכולה להבהיר את המוני monoisotopic של oligonucleotides, אשר הוא כלי שימושי לזיהוי רכב בסיס.

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

למד את שיטת drop-off ddPCR לאבחון סרטן באמצעות זיהוי DNA של גידול מסתובב בדם. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מרובה מוטציות בתגובה אחת תוך חיסכון בדגימות יקרות ערך.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

גלה סרטונים נוספים