Name: העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: למד העברת עוברים לפרוסקופית מינימלית בארנבים בשילוב פרוטוקול ויטריפיקציה יעיל. שיטה זו מאפשרת אחסון לטווח ארוך ומספקת מודל אידיאלי למחקר רבייה אנושית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממשרד הכלכלה והתחרותיות של ספרד (AGL2017-85162-C2-1-R) ו הכלטאת ולנסיה תוכנית מחקר (PrometeoII 2014/036). גרסת טקסט באנגלית שתוקנה על-ידי נ. מאקאן שירות לשפות אנגלית

כל ההליכים הניסיוניים המשמשים במחקר זה בוצעו בהתאם להנחיה 2010/63/האיחוד האירופי לניסויים בבעלי חיים ולביקורת ואושר על ידי הוועדה האתית לניסויים עם בעלי חיים של הפוליטטיניקה דה ואלטק, ספרד (קוד מחקר: 2015/VSC/אפונה/00170). XGD, FMJ, MPVC ו-JSV מחזיקה אישור הרשאה שהונפק על ידי הממשל הממשלות ולנסיה להתנסות בבעלי חיים. XGD מוסמכת לפקח על הרווחה והטיפול בבעלי החיים במהלך הניסוי.
1. העברת עובר
<ol><li>הכנת נקבות הנמען
	<ol>
<li>השתמש רק נשים בוגרות מינית (&gt; 4.5 חודשים בן).</li>
		<li>שבוע לפני ET, להתאים נקבות ל 16 h אור/8 h משטר כהה כדי ליזום צמיחה פוליקולרית ומוגברת קבלה נשית.</li>
		<li>בחר את הנקבות הנמען, התבוננות בטורגיקות ובצבע של הפות. אם הפות הוא טורד ואדמדם, הנקבה היא פתוחה.</li>
		<li>לגרום פסבדו-אקראי (ביוץ) על ידי הזרקה בודדת שרירית של 1 μg של אצטט buserelin (אנלוגי סינתטי של הורמון משחרר Gonadotropin) ללא קשר למשקל הגוף. הערה: בדרך כלל, 0.8 μg היא מינון מתאים עבור הביוץ בתוך שפנים בגודל בינוני (4-5 ק"ג), כך 1 μg בדרך כלל מבטיח את הביוץ.</li>
		<li>לגרום הביוץ כמה ימים רבים מראש כמו גיל העוברים להיות הועבר (למשל, 70-72 h לפני מורולה ET טריים).</li>
	</ol></li>
	<li>הרדמה וחוסר כאבים
	<ol>
<li>שוקלים את הארנב ומעמיסים את ההרדמה הבאה ומשככי כאבים.<ol>
<li>ב 1 מזרק mL עם מחט 30g: לטעון xylazine (5mg/ק"ג) ו בופרנורפין הידרוכלוריד (0.03 מ"ג/ק"ג). בעוד מזרק 1 מ ל עם מחט pericranial 23G, טען קטמין הידרוכלוריד (35 מ"ג/ק"ג).</li>
		</ol>
</li>
		<li>החזיקו את הארנב והזבו את התערובת הבופרזטין-בופריפין.</li>
		<li>הכניסו את המחט הpericranial עם קטמין בווריד האוזן השולי והציגו לאט את כל תכני המזרק.</li>
		<li>תקן את המחט ולהשאיר אותו מוכנס לאורך השלבים הנותרים כדי לנהל הרדמה יותר במידת הצורך.</li>
		<li>השאר את הארנב בכלוב (נקי ובלי כל בעלי חיים אחרים) על הבמה החם.</li>
		<li>פעם מחוסרת הכרה, להחיל משחה העין כדי למנוע יובש של העין ולבדוק את העדר palpebral freflex. הערה: פרוטוקול זה מספק מטוס הרדמה כירורגית למינימום של 30 דקות. אם נדרש זמן רב יותר, הכנס מינונים נוספים עם מחצית מכמות הקטמין ההידרוכלוריד המתואר בשנת 1.2.1 לאחר 30 דקות.</li>
		<li>עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי בדיקת התנועה רפלקס הדוושה ונשימה. שינויים בתבנית הנשימה לקצב לא סדיר ומהיר יותר מצביעים על אובדן המישור התקין של ההרדמה.</li>
		<li>הצג את צבע הקרומים הריריות (עיניים, שפתיים וכו '), קצב נשימה (30-60 נשימות לדקה), קצב הלב (120-325 פעימות לדקה) וטמפרטורת הרקטום (38-39.6 ° c).</li>
		<li>שמונה שעות לפני ההעברה, מניעת מזון מבעלי חיים כדי למנוע את הגודל והפעילות הגדולים יותר עד לסיום תהליך ה-ET. . תשאירו גישה חופשית למים</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה לעובר
	<ol>
<li>חם העובר מניפולציה מדיה ל 25 ° צ': בסיס בינוני (BM), המורכב של מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) שיושלם עם 0.2% (w/v) של סרום של בקר של שור.</li>
		<li>עבודה תחת stereomicroscope, לשטוף טרי או להפשיר (שלב 2) עוברים עם BM.</li>
		<li>באמצעות כפפות סטרילי, לצרף את הצנתר התקין 17G מוגדר למזרק של 1 מ"ל.</li>
		<li>מנושף 1 ס מ של BM לתוך הצנתר, ואחריו בועה אוויר קטן.</li>
		<li>מנושף 5-7embryos בנפח של 10 μL של BM, ואחריו בועת אוויר קטנה אחרת.</li>
		<li>לסיים את טעינת הקטטר על ידי מבסת 1 ס מ של BM.</li>
	</ol></li>
	<li>העברת עובר
	<ol>
<li>שקול את השימוש של כפפות סטרילי, שמלה ומסכה כדי להבטיח סביבה אספטי.</li>
		<li>לעקר כלים כירורגיים, לנקות את המשטחים שבהם הניתוח יבוצע, ולנגב אותם עם 70% אתנול.</li>
		<li>לבצע הרדמה כפי שמפורט בעבר (שלב 1.2), בדיקת אובדן רפלקסים.</li>
		<li>מגלחים את הפרווה מהבטן הגגעלת. עם תער חשמלי</li>
		<li>הכינו את הבטן הגסית באופן כאוטית.<ol>
<li>לנקות את האזור כירורגי ולהסיר את כל השיער הנותר. שטוף את האזור הכירורגי עם סבון גלוקונקסטין. האזור עם תמיסת כלורקסדין ואתנול 96 º (3 פעמים).</li>
		</ol>
</li>
		<li>מניחים את החיה על שולחן כירורגי חם, בעמדת טרדלינבורג (ראש למטה ב 45 °) כדי להבטיח כי הקיבה והמעיים ממוקמים בגולגולת. שקול את פינוי שלפוחית. השתן אם זה מטורד אם נפגעו מעיים כלשהי בתהליך, החיה עלולה למות. לכן חשוב לקבל אותם ממוקם כראוי (איור 1).</li>
		<li>לכסות את האזור באמצעות מגבת סטרילית, עם חור (הגדר) חשיפת האזור מגולח, כדי להפריד את האתר הכירורגי מאזורים פוטנציאליים מזהם.</li>
		<li>הכנס מכונית אנדוסקופית אחת 5 ס מ לתוך חלל הבטן, 2 ס מ caudal לתהליך xiphoid, וinsufflate דרכו את החלל הצפק עם הלחץ והוויסות insufflator מכני. הערה: לחץ פנים-בטן צריך להיות 8-12 mmHg עם CO2 (איור 1a).</li>
		<li>הכנס את המצלמה אנדוסקופ דרך המכונית אנדוסקופית (איור 1B). הערה: לזהות את מערכת הרבייה, קביעת הסטטוס והמיקום של שפך ו ampulla לפני ET כדי להקל על השלבים הבאים.</li>
		<li>הכנס את המחט 17-G אפידורל לתוך האזור האינטינומי בין 2-3 ס מ מ שפך (איור 1b).</li>
		<li>זהה את הכניסה של שפך (איור 2a, 2a).</li>
		<li>הכנס את הקטטר טעון (שלב 1.3) דרך מחט אפידורל לתוך הבטן (איור 1C).</li>
		<li>אתר את צינור ההטלה והוסף 1-2 ס מ של קטטר האפידורל דרך שפך ב ampulla (איור 2a-2a). אל תתקדם רחוק מאוד לתוך תעלת ההטלה כדי למנוע נזק ודימום.</li>
		<li>שחררו את העוברים לצינור ההטלה על ידי לחיצה עדינה על הבוכנה של המזרק ביחד לצנתר (איור 2D-2d). שתי בועות האוויר חייב לצאת הקטטר.</li>
		<li>להסיר את הצנתר רק לאחר העוברים שוחרר.</li>
		<li>שטפו את הקטטר, מנשפת ומשחררים את המדיום כדי לבדוק את העדר העוברים ולאשר את העברתו המוצלחת.</li>
		<li>חזור על שלבים ה1.4.11 ל1.4.16 בצד השני של הרחם, אם תרצה.</li>
		<li>הסר את המחט אפידורל ומצלמה אנדוסקופ.</li>
		<li>שחרר CO2 דרך המכונית אנדוסקופית. אם הגזים העודפים יישארו בבטן החיה, יהיה לו כאב וחוסר נוחות.</li>
		<li>הסר את המכונית האנדוסקופית מחלל הבטן. . תסיר את המגבת הכירורגית</li>
		<li>. להפסיק את ההרדמה</li>
		<li>לנקות את החתך שנעשו על ידי נקז עם פתרון כלורהקדין. סגרו את החתך שנעשה על ידי הטרוקאר עם אלומיניום מיקרומי ורוטב פלסטי.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפול פוסט-פעיל
	<ol>
<li>לטפל בבעלי חיים עם אנטיביוטיקה: 10 מ"ג/ק"ג של enrofloxacin, תת-עורי, כל 24-h עבור 5 ימים.</li>
		<li>ניהול משככי כאבים: בופרנורפין הידרוכלוריד (0.03 מ"ג/ק"ג), בפנים, כל 12 שעות במשך 3 ימים; מלוקסיעם (0.2 מ"ג/ק"ג), תת-עורי, כל 24-h במשך 3 ימים.</li>
		<li>ניטור בעלי החיים לפחות 30 דקות לאחר הניתוח (בהתאם לבעל החיים ומינון ההרדמה בשימוש) לוודא שהם לשחזר את התנאים הפיזיולוגיים שלהם.</li>
		<li>זהה את הנמען (למשל, קעקוע האוזן) וחיות הבית בנפרד בכלוב נקי עם המצב הסביבתי המתאים.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig1.jpg"> איור 1: העברת העובר לפרוסקופ בסיוע לפרוסקופיה (מבט חיצוני). A) החדרת מכונית אנדוסקופית (יציאה אחת). ב) החדרת המצלמה האנדוסקופית והמחט האפידורל (חץ שחור). ג) החדרת קטטר העברת העובר (חץ לבן) דרך המחט אפידורל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig2.jpg"> איור 2: העברת העובר לפרוסקופ בסיוע לפרוסקופיה (מבט פנימי). א: החדרת הקטטר דרך המחט אפידורל לתוך אזור הבטן. כוכבית מציין את infundibulum. B, C, D: הקטטר הטעון עם העוברים מוכנס לאזור ampulla ברחבי infundibulum. E, F: שחרור העוברים, אושר על ידי ויזואליזציה של צינור ההטלה נפוח. דמות זו הותאמה מרקו-חימנס אל. 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. ויטריפיקציה העובר והתחממות
<ol><li>בצע את כל המניפולציות בטמפרטורת החדר (סביב 22 ° c) כדי להפחית את רעילות הפתרון הויטריפיקציה בטמפרטורות חמות יותר. הערה: ניתן להזיז עוברים באמצעות הצינורות האוטומטיים של 0.1-2 μL בפרוטוקול זה, אך התקנים דומים אחרים להזזת העוברים הגוררים את אמצעי האחסון המינימלי יכולים להיות מתאימים.</li>
	<li>העבר את העוברים בתהליך נוסף של שני שלבים:<ol>
<li>מניחים את העוברים 2 דקות בתמיסה הכוללת של 10% (v/v) אתילן גליקול 10% (v/v) diמתיל סולפוקסיד הומס ב BM.</li>
		<li>הזיזו את העוברים (משלב 2.2.1) לדקה אחת לפתרון ויטריפיקציה המורכב מ -20% (v/v) אתילן גליקול ו -20% (v/v) diמתיל סולפוקסיד הומס ב-BM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטעון את העוברים לתוך 125 μL פלסטיק מיני (אשר מכיל קצה סגור אחד עם תקע כותנה ואקסטרים אחד פתוח). התהליך מחושב באיור 3.<ol>
<li>זוג הקצה הסגור של 0.125 μL ministraw עם המיקרומינפק המתאים (למשל Captroll III®).</li>
		<li>משוף מוניטור עד 1/3 של אורך הקש, לאחר בועת אוויר קטנה.</li>
		<li>מנושף את העוברים בנפח של 40 μL של פתרון ויטריפיקציה, ואחריו בועת אוויר קטנה אחרת.</li>
		<li>משומת מוניטור עד שבר הנוזל הראשון (שלב 2.3.2) מגיע כותנה.</li>
		<li>סגור את הקצה הפתוח באמצעות תקע קש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בצע את שלב 2.2.2 בזמן שלב 2.3 נעשה כדי להבטיח כי לא יותר מדקה אחת חולף, אשר יהיה רעיל לעוברים.</li>
	<li>לצלול המיניקש ישירות לתוך חנקן נוזלי כדי להשיג ויטריפיקציה.</li>
	<li>לאחסן את המיניקש בבית מלחמה לחנקן בזמן הרצוי.</li>
	<li>הפשרת העוברים בצעד אחד.<ol>
<li>מניחים את המיניקש אופקית 10 ס מ מהחנקן הנוזלי עבור 20-30 s.</li>
		<li>כאשר תהליך התגבשות מתחיל בתוך ministraw, לטבול את המיניקש באמבט מים ב 25 ° c עבור 10-15 s.</li>
		<li>תסיר את התקע של המיניקש. ותחתוך את תקע הכותנה</li>
		<li>עם מיקרומנפק מצמידים, לגרש את כל התוכן ministraw לתוך צלחת המכילה 0.33 M הפתרון בשעה 25 ° c ב BM עבור 5 דקות. הערה: יש לבצע פעולה זו במהירות על-מנת לצמצם את החשיפה של העובר לפתרון הויטריפיקציה.</li>
		<li>להעביר את העוברים לצלחת חדשה המכילה את הפתרון BM עבור 5 דקות נוספות.</li>
		<li>שקול רק עוברים שאינם פגומים (עם מעיל ריריות שלמים וסונה pellucida) כדי להמשיך עם ET. הערה: קח בחשבון כי העוברים המופששים, העברות אסינכרוני (למשל, 60-62 h ב העברות morula) עשוי לשפר את התוצאות על ידי מתן סנכרון מחדש בין העובר ואת האנדורירית האימהית.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig3.jpg"> איור 3: שייטיזציה של קש שנטען כראוי. A) BM מתייחס העובר מניפולציה מדיה המועסקים במהלך ויטריפיקציה. העוברים חייבים להיות טעונים בפתרון ויטריפיקציה. ב) המראה המקסקופי של הקש הטעון עם פירוט מוגדל של מיקום העובר. התקן זה של נפח גדול מאפשר לנו להתקשות מספר רב של עוברים, בניגוד התקני נפח מינימלי. יתר על כן, הטיפול במכשיר זה קל יותר לעומת התקנים מינימלי נפח, בעוד התוצאות דומות ארנבים41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

. למחברים אין מה לגלות

מאז המתועד הראשון של מקרה הלידה החיה מעוברים הועברו9, טכניקה זו ומינים הארנב הפכו קריטיים בלימודי הרבייה. חוץ מזה, מחקרי מחקר עובר מעורבים, ייצור, הקפאה, וכו ' דורשים כצעד האחרון הערכה של יכולת העובר ליצור צאצאים בריאים לטווח מלא. לכן, טכניקת העברת העובר היא הכרחית13,28. במהלך השנים, השיטות הכירוגרפיות המועסקים בתחילה כדי להעביר עוברים אל הרחם האימהי הוחלפו בהדרגה על ידי שיטות פולשנית פחות ברוב המכריע של מינים13<...

עם מטרות של עקיפת פוריות האדם או שיפור הפצת בעלי חיים של ערך גנטי גבוה ושמירה על משאבים גנטיים בעלי חיים, סט של טכניקות שנקרא באופן קולקטיבי טכנולוגיות רבייה, כגון סופר ביוץ, ב הפריה חוץ גופית , תרבות העובר, או הקפאה,פותחו 1,2. כיום, מקבלים טיפולים הורמונליים כדי לעורר את השחלות ולייצר מספר רב של זקיקי השחלות העאליים1. Oocytes שנאסף מזקיקי אלה יכול להיות התבגר, מופרית, ופיתח בתוך מבחנה עד שהם הקפאה או הועבר אמהות פונדקאית3. עם זאת, במהלך טיפולים אלה, המשחק והזיטים חשופים לסדרה של תהליכים לא פיזיולוגיים שיכולים לדרוש הסתגלות העובר כדי לשרוד בתנאים אלה4,5. הסתגלות זו אפשרית עקב הפלסטיות המוקדמת של העובר, המאפשר שינויי העובר בביטוי הגנים ובתכנות התפתחותי6. עם זאת, שינויים אלה יכולים להשפיע על השלבים הבאים של התפתחות העובר עד לבגרות, ועכשיו הוא מקובל באופן נרחב כי שיטות, תזמון, הליך הקפאה או תנאי תרבות להראות תוצאות שונות על גורל העובר7 , 8. לכן, כדי להבהיר את ההשפעות הנובעות של אומנויות, השימוש במודלים של בעלי חיים מאופיין הוא בלתי נמנע.
הלידה הראשונה שתועדה כתוצאה מהעברת עוברי יונקים התקיימה ב-18909. היום, העברת העובר (ET) לנקבה פונדקאית היא צעד מכריע בלימוד השפעות האמנות המושרה במהלך טרום ההשתלה על שלבים לפיתוח העובר הבאים10. טכניקות ET תלויות בגודל ובמבנה האנטומי של כל חיה. במקרה של דגמים גדולים של בעלי חיים, זה היה אפשרי לבצע ET על ידי שיטות ET שאינן כירורגית, אבל בגודל קטן יותר צנתור מיני של צוואר הרחם הוא מורכב יותר טכניקות כירורגי משמשות לעתים קרובות11. עם זאת, ET כירורגית יכול לגרום לדימום שעלול לפגוע השרשה והתפתחות העובר, כמו דם יכול לפלוש לומן הרחם, גרימת מוות העובר10. שיטות שאינן כירורגיות ו-ET מיושמים עדיין בבני אדם, בבונים, שור, חזירים ועכברים12,13,14,15,16,17, אבל כירורגי מינים אלה עדיין נמצאים בשימוש במינים כגון עיזים, כבשים או בעלי חיים אחרים אשר מציגים קשיים נוספים10,18,19,20,21, כגון ארנבים (שניים קרוקס עצמאיים) או עכברים (בגודל קטן). עם זאת, שיטות העברה כירורגית נוטים להיות הוחלף בהדרגה על ידי שיטות פחות פולשנית. אנדוסקופיה שימש להעברת עוברים, למשל, בארנבים, חזירים ומעלי גירה קטנים18,19,20. אלה שיטות מינימלית פולשנית אנדוסקופיה ניתן להשתמש כדי להעביר עוברים אל ampulla באמצעות infundibulum, אשר חיוני ארנבים הפגינו השפעות מועילות במינים מסוימים20. הדבר מתבסס על חשיבות הדיאלוג הנכון בין העובר לבין האם בשלבי העובר המוקדמים בתעלת ההטלה. כפי שהוזכר לעיל, שיפוץ העובר המתרחשים בארנבים במהלך העברת העובר דרך תעלת ההטלה חיונית להשגת עוברים המסוגלים להשתיל22,23.
מודלים בעלי חיים גדולים יותר, כגון שור, מעניינים משום שהתכונות הביוכימי והשהשתלה דומות לאלה שבמין האנושי24. עם זאת, בעלי חיים גדולים הם יקרים מדי לשימוש בניסויים ראשוניים, ומכרסמים נחשבים מודל אידיאלי (76% אורגניזמים מודל הם מכרסמים) למחקר מעבדה25. עם זאת, מודל הארנב מספק כמה יתרונות על פני מכרסמים בלימודי הרבייה, כמו כמה תהליכים ביולוגיים הרבייה על ידי בני אדם דומים יותר ארנבים מאשר אלה בעכברים. האדם והארנבים להציג הפעלה דומה כרונולוגי הגנום העובריים, מבנה השליה והמניפולציה. בנוסף, שימוש בארנבים ניתן לדעת את העיתוי המדויק של הפריה ושלבי היריון בשל הביוץ המושרה25. מחזורי חיים בארנבות קצרים, השלמת ההריון במשך 31 ימים והגיעו לבגרות בסביבות 4-5 חודשים; החיה קלה לטיפול בשל התנהגותו הצייתנים והלא-אגרסיבית, והאחזקה שלה חסכונית מאוד בהשוואה להוצאות של בעלי חיים גדולים יותר. כמו-כן, חשוב לציין שבארנבים יש רחם דופלקס עם שני cervixes עצמאיים11,25. זה מציב את הארנב בעמדה מועדף, כמו עוברים מן הקבוצות הנסיוניות השונות ניתן להעביר לאותה חיה, אבל לתוך קרן רחם אחרת. זה מאפשר לנו להשוות בין ההשפעות הנסיוניות, הפחתת הגורם האימהי מהתוצאות.
כיום, לא כירורגי שיטות ET אינם בשימוש ארנב. מחקרים מסוימים שבוצעו בסוף שנות ה-90 באמצעות טכניקת העברת הדואר הביאו לשיעורי משלוח נמוכים החל מ-5.5% עד 20.0%11,26 לעומת 50-65% בשיטות כירורגיות, ביניהן הליך הלפרוסקופיה המתואר על ידי בסננפלדר וברים18. שיעורי ההצלחה הנמוכים של שיטות ET אלה שאינם כירורגיים בארנבים חופפים עם חוסר שיפוץ העובר הדרוש בתעלת ההטלה, אשר נמנעת במהלך הניתוח. כאן, אנו מתארים הליך אפקטיבי מינימלית לפרוסקופי ET באמצעות ארנבים כאורגניזם מודל. טכניקה זו מספקת מודל לחקר הרבייה נוסף בבעלי חיים גדולים ובבני אדם.
מכיוון שלארנבים יש חלון זמן צר במיוחד להשרשת העובר, ET במין זה מחייב מידה גבוהה של סנכרון בין השלב ההתפתחותי של העובר ב-ET והמצב הפיזיולוגי של הנמען27. במקרים מסוימים, לאחר טיפול הרבייה המאט את התפתחות העובר (כגון בתרבות מבחנה ) או משנה את הקבלה של רירית הרחם (כגון טיפולים ביוץ), אין סנכרון בין העובר והרחם האימהי. מצבים אלה יכולים להשפיע לרעה על התוצאה. כדי להגיב בהקשרים אלה, אנו מתארים ויטריפיקציה הארנב יעיל מורולה הפרוטוקול המאפשר לנו להשהות, לארגן ולחדש את הניסויים. תהליך זה הוא באופטימיות רצוי ללימודי הרבייה ונותן לנו את היכולת לאחסון לטווח ארוך של עוברים, המאפשר הובלה שלהם. הליך הלפרוסקופי ואסטרטגיות הקריוסקופיות מאפשרים תכנון טוב יותר של מחקרים עם פחות בעלי חיים. לפיכך, המתודולוגיה שלנו מציעה יתרונות היגיוניים וכלכליים ומתאימים לקונספט של שלושה ר' (החלפה, הפחתה ועידון) של מחקר בעלי חיים במטרה לשפר את הטיפול האנושי בבעלי חיים ניסיוניים. כך, עם שיטות אלה, הארנבים מהווים אורגניזם מודל אידיאלי עבור vivo הרבייה .

<table><tbody><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין הידרוכלוריד</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>626</td><td>יוזמן על ידי וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>בוסרלין אצטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B3303</td><td></td></tr><tr><td>סבון קלורהקסידין דיגלוקונאט</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCJ500B</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת קלורהקסידין דיגלוקונאט</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCA500B</td><td></td></tr><tr><td>CO<תת>2</תת></td><td>אוויר נוזלי</td><td>99921</td><td>CO2 N48.</td></tr><tr><td>חממת CO2</td><td>פישר 15385194</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>W387509</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5773</td><td>ללא סידן כלורי.</td></tr><tr><td>סכין גילוח חשמלי</td><td>אוסטר גולדן A5</td><td>078005-140-002</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת אנדוסקופ</td><td>אופטימיק ספרד S.A</td><td>OP-714</td><td></td></tr><tr><td>אנדוסקופ טרוקר עם שסתום עלון סיליקון</td><td>קארל סטורץ אנדוסקופיה Ib&eacute; rica S.A.</td><td>30114GK</td><td>דגם טרוקר קל משקל.</td></tr><tr><td>Enrofloxacin</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993046</td><td>יש להזמין על ידי וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>מחט אפיקרנלית 23G</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>514056353</td><td>ניתן להשתמש גם במחטים קטנות יותר.</td></tr><tr><td>קטטר אפידורלי</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>מחט אפידורלית</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>102466-M</td><td></td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>5273</td><td></td></tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>184</td><td>יוזמן על ידי וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>ציוד לפרוסקופיה</td><td>קארל סטורץ אנדוסקופיה Ib&eacute; rica S.A.</td><td>26003</td><td>AA הופקינס&reg; לפרוסקופ, לפרוסקופ 0&ordm;-מ"מ ישר לצפייה ישירה, אורך 30 ס"מ, תעלת עבודה 5 מ"מ.</td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>Optomic ספרד SA</td><td>Fibrolux 250</td><td></td></tr> נוזל <tr><td>חנקן</td><td>אוויר נוזלי</td><td>P1505XXX</td><td></td></tr><tr><td>מכני CO2 אינסופלטור</td><td>קארל סטורץ אנדוסקופיה Ib&eacute; rica S.A.</td><td>אנדופלטור &reg;</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993501</td><td>יש להזמין על ידי וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>צלחות פטרי, 35 מ"מ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165-500EA</td><td></td></tr><tr><td>רוטב פלסטיק (Nobecutan)</td><td>IBOR medica</td><td>7140028</td><td></td></tr><tr><td>קש פלסטיק 0.25 מ"ל</td><td>IMV - טכנולוגיות</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת יודיד פובידון</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>02656DPYS500S</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>כל מספריים ישרים קטנים מפלדה בדרגה כירורגית רגילה יעבדו.</td></tr><tr><td>צינור סיליקון לאינספלטור</td><td>קארל סטורץ, אנדוסקופיה Ib&eacute; rica S.A.</td><td></td><td></td>20400040</tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>ישנן אפשרויות זולות יותר כמו Leica MZ8 או Nikon SMZ-10 או SMZ-2B, אם להזכיר כמה.</td></tr><tr><td>כפפות סטריליות</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>087GL010075</td><td></td></tr><tr><td>שמלה סטרילית</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td></td><td></td>12261501</tr><tr><td>מסכה סטרילית</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>058B15924B</td><td></td></tr><tr><td>תקע קש</td><td>IMV - טכנולוגיות</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>מזרק סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7903</td><td></td></tr>, מזרק <tr><td>פישר 11750425</td><td></td><td></td>מדעי<td>1 מ"ל</td></tr>, <tr><td>5 מ"ל</td><td>צנתר שתן פישר 11773313</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td></td><td>IMV - טכנולוגיות</td><td>17722</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>RAYPA</td><td>BAE-4</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>525225</td><td>יש להזמין על ידי וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>Rabbits</td><td>Universitat Polit&egrave; cnica de Val&egrave; ניתן</td><td>להשתמש בקווים אימהיים אחרים, כגון קו V או קו HP.</td><td></td></tr></tbody></table>

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

טכניקות הרבייה בסיוע (אמנויות), כגון תרבות העובר מחוץ לאדמה או קריוגנית העובר, להשפיע על דפוסי התפתחות טבעית עם השלכות לאחר הלידה ולידה. כדי להבטיח את innocuousness של יישומי אמנות, מחקרים במודלים של בעלי חיים נחוצים. בנוסף, כצעד אחרון, מחקרי פיתוח העובר דורשים הערכה של היכולת שלהם לפתח צאצאים בריאים לטווח מלא. כאן, העברת העובר אל הרחם הוא הכרחי לבצע כל ניסוי הקשורות לאומנויות.
הארנב שימש כאורגניזם מודל לחקר הרבייה של היונקים במשך יותר ממאה שנה. בנוסף הקרבה פילוגנטי שלו למין האנושי הגודל הקטן שלה ועלות תחזוקה נמוכה, יש לו מאפיינים הרבייה חשוב כגון ביוץ המושרה, כרונולוגיה של התפתחות עובריים מוקדם דומה לבני אדם הריון קצר המאפשרים לנו ללמוד את ההשלכות של יישום האמנות בקלות. יתר על כן, אמנויות (כגון הזרקת זרע תאיים, העובר תרבות, או הקפאה) מוחלים עם יעילות מתאימה במין הזה.
השימוש בטכניקת המעבר לפרוסקופי ובפרוטוקול הקריוגנית המוצג במאמר זה, אנו מתארים 1) כיצד להעביר עוברים דרך טכניקה קלה, פולשנית ומינימלית ו -2, פרוטוקול אפקטיבי לאחסון לטווח ארוך של ארנבים עוברים לספק יכולות לוגיסטיות זמן גמישות ויכולת להעביר את המדגם. התוצאות שהתקבלו לאחר העברת עוברי ארנבים בשלבים התפתחותיים שונים מצביעים על כך morula הוא השלב האידיאלי עבור התאוששות העובר הארנב והעברה. לפיכך, נדרשת העברה של עובר האובידיוס, המצדיקים את ההליך הכירורגי. יתר על כן, הארנב מורולאי בהצלחה מועברים והועבר לפרואו, ומוכיחים את האפקטיביות של הטכניקות המתוארות.

העברה פולשנית לפרוסקופי של עוברים רעננים או מבתרים את הארנב בקרב חיות המופת הטובות ביותר ללימודי הרבייה. טבלה 1 מראה את התוצאות של ET חדש בשלבים התפתחותיים שונים (איור 4) של עוברים הועברו. שיעור ההישרדות בלידה (אחוז העוברים הנובעים גור) הוכיחה את היעילות של טכניקת הפרוסקופי המתוארת במאמר זה. הערכים הגבוהים יותר הושגו כאשר ה-ET בוצעה עם עוברים בשלב מורולה, או מוקדם או קומפקטי. בהתבסס על תוצאות אלה, ביצעו ניסוי שני כדי להדגים את שיעור ההישרדות ...

טכניקות הרבייה בסיוע (אמנויות) הן בהערכה רציפה כדי לשפר את התוצאות ולהפחית את הסיכונים הקשורים. כתב יד זה מתאר הליך מינימלית פולשני העברת העובר עם פרוטוקול הקריוגנית יעיל המאפשר שימוש בארנבים כמודל בעלי חיים אידיאלי של רבייה אנושית.

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

המטרה העיקרית של ניסוי זה היא לתאר הליך העברת עובר לפרוסקופי בארנב כמודל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי זה עובד כדי להעביר עוברים באמצעות טכניקה קלה, פולשנית מינימלית. יתר על כן, פרוטוקול ההקפאה היעיל של העובר המתואר כאן פועל גם לאחסון ארוך טווח של עוברי הארנב, ומספק יכולת לוגיסטית גמישה בזמן ויכולת להעביר את המדגם.כידענו, טכנולוגיות רבייה בסיוע נמצאות בהערכה רציפה כדי לשפר את התוצאות ולהפחית את הסיכונים הקשורים. לכן, באמצעות שתי הטכניקות, ארנב יכול לשמש כמודל בעלי חיים אידיאלי של רבייה אנושית כדי לענות על שאלות מפתח בתחום זה, כגון ההשפעות של מניפולציה העובר במבחנה על צאצאים. הדגמה חזותית של עניינים אלה הם קריטיים כמו צעדי העברת העובר קשה ללמוד, כי זה חייב להיעשות בדיוק רב כדי להבטיח את ההצלחה של הטכניקה.עבור vitrification עוברי, לטבול את העוברים בתווית שיווי משקל במשך שתי דקות, ואחריו דגירה דקה אחת בתת פתרון vitrification. בסוף הדגירה, לטעון את העוברים לתוך מיני קש פלסטיק 125 microliter, וזוג הקצה הסגור של מיני קש עם מיקרו-חיוני מיליליטר מתאים. בסיס שאפות בינוני עד שליש מאורך הקש, ואחריו בועת אוויר קטנה.לאחר מכן, השתמש בסטריאומיקרוסקופ כדי לשאוף את העוברים ב -40 מיקרוליטרים של פתרון vitrification, ואחריו עוד בועת אוויר קטנה ומספיק מדיום בסיס כדי להעביר את השבר הנוזלי הראשון עד הכותנה של המיני קש. לאחר מכן לסגור את הקצה שנפתח של מיני קש עם תקע קש, לצלול מיני קש ישירות לתוך חנקן נוזלי כדי להשיג vitrification, ולאחסן את המיני קש במנוון חנקן נוזלי. כדי להפשיר את העוברים להעברה, מניחים את המיני קש אופקית 10 ס"מ מאיד החנקן הנוזלי במשך 20 עד 30 שניות.כאשר תהליך ההתגבשות מתחיל בתוך המיני קש, טובלים את המיני קש באמבט המים 25 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 שניות. מיד להסיר את תקעי מיני קש וכותנה ולהשתמש microdispenser מזוגת לגרש את תכולת מיני קש לתוך צלחת המכילה 25 מעלות צלזיוס בסיס בינוני בתוספת 0.33 פתרון סוכרוז טוחנת, שבו עוברים חייבים להישאר במשך חמש דקות. ואז להעביר את העוברים לצלחת של מדיום בסיס טרי עוד חמש דקות דגירה.כמו ימים רבים לפני גיל העוברים להיות מועבר, להתבונן טורגידות וצבע של הפות של ארנבות בוגרת מינית זמין 4.5 חודשים נקבה, ולזרז ביוץ בבעלי החיים פתוחים עם זריקה תוך שרירית אחת של מיקרוגרם אחד של אצטט buserelin ללא קשר למשקל הגוף. ביום ההעברה, שוטפים את העוברים הטריים או המופשרים במדיום בסיס צלזיוס של 37 מעלות תחת סטריאומיקרוסקופ, ומצמידים קטטר אפידורלי 17-מד מוגדר כראוי למזרק מיליליטר אחד. שאף סנטימטר אחד של מדיום בסיס לתוך הקטטר, ואחריו בועת אוויר קטנה.לאחר מכן שאף חמישה עד שבעה עוברים ו-10 מיקרוליטרים של מדיום בסיס, ואחריו עוד בועת אוויר קטנה, וס"מ אחד אחרון של מדיום בסיס. לאחר שהעוברים נטענו, מניחים את הארנב המותקבל הרדמה בכלוב על במת התחממות, ומחילים משחה על עיני החיה. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, לגלח את הפרווה מהבטן הגחונית, לנקות את האזור הכירורגי עם סבון גלוקונטי כלורקסידין, ולהסיר את כל השיער שנותר.מכסים את האזור עם וילון סטרילי עם חור עבור האזור הכירורגי, ולהכניס אחד פורל אנדוסקופי חמישה סנטימטרים לתוך חלל הבטן, שני סנטימטרים caudal לתהליך zyphoid, ולהשתמש מנפח מכני ויסות לחץ כדי לנפח את חלל peritoneal. הכנס את מצלמת האנדוסקופ דרך הטרופי האנדוסקופי, והכנס את מחט האפידורל 17-מד לאזור inguinal, שניים עד שלושה סנטימטרים מן infundibulum. הכנס את הקטטר טעון דרך מחט אפידורל לתוך הבטן, ולהכניס אחד עד שני סנטימטרים של קטטר אפידורל דרך infundibulum באמפולה.בעדינות לדכא את הבוכנה קטטר לשחרר את העוברים לתוך oviduct. שתי בועות האוויר חייבות לצאת מהקטטר. הסר את הקטטר מיד לאחר שהעוברים שוחררו, ושאוף ושחרר את המדיום הנותר כדי לאשר את היעדר העוברים.לאחר אישור העברה מוצלחת של העוברים, הסר את המחט האפידורלית ואת מצלמת האנדוסקופ, ושחרר את דו תחמוצת הפחמן בבטן דרך האזור האנדוסקופי. נקה את החתך trocar עם פתרון chlorhexidine, ולסגור את הפצע עם אלומיניום micronised ורוטב פלסטיק. לאחר מכן לטפל בבעלי החיים עם אנטיביוטיקה המתאימה משככי כאבים, ולפקח על החיה עד להחלמה מלאה.העברת עובר לפרוסקופית זעיר פולשנית ממקמת את הארנב בין המודלים הטובים ביותר של בעלי חיים למחקרי פוריות, כאשר אחוז גבוה של עוברים טריים שהועברו וכתוצאה מכך גור. יש לציין כי ערכים גבוהים יותר מושגים כאשר העברת העובר הטרי מבוצעת עם עוברים בשלב מורולה מוקדם או קומפקטי. תוצאות דומות נצפו לאחר העברת מורולה ארנבת מוטורית מוקדמת ודחוסה, במיוחד עם מורולה קומפקטית, המאשר את היעילות והאמינות של טכניקה זו להעברת עוברים טריים ב vitrified בארנבים.בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו טכנולוגיות רבייה מסייעת מותנית ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איך תוספת של צפיפות יכול לגרום אפקט משכך כאבים בהמשך החיים. לאחר ההתפתחות האחרונה, טכניקה זו סוללת את הדרך עבור מדענים בתחום הרבייה לחקור את האפקט הזה בבני אדם בהתבסס על המרחק ההיגלוגנטי ההדוק בין ארנב לבני אדם. לכן, טכניקה זו יכולה לספק תוצאות הניתנות להעברה בקלות לרפואה קלינית אנושית, כמו גם במין יונקים אחרים.אל תשכח כי השיטה שלנו מציעה כמה יתרונות היגייניים וכלכליים התואמים את המושג של שלושה R של רווחת בעלי חיים, החלפה, צמצום, ועידון, על ידי כוונה המטרה של שיפור הטיפול האנושי בבעלי חיים ניסיוניים.

minimally-invasive-embryo-transfer-embryo-vitrification-at-optimal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אתילן גליקול מבוססי שיטה vitrification עבור עוברי עכבר מתואר. זהו יתרון לשיטות אחרות בפשטותו ורעילות נמוכה עובריים, ולכן יכול להיות ישים באופן נרחב זנים רבים של עכברים, כולל עכברים טבועה ו גנים שונה.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

בסרטון זה, אנו מתארים את הליך הוויטריפיקציה של עוברי ארנבים שנקטפו בשלב ההתפתחות הרצוי באמצעות אתילן גליקול ודימתיל סולפוקסיד כהגנה קריוגנית וקש קריוגני כמערכת הנשא. לעוברים המזוגגים יש שיעור הישרדות גבוה וניתן לאחסן אותם לתקופה ממושכת עד לשימוש.

ויטריפיקציה של עוברי ארנב באמצעות קש קריוגני: טכניקת קירור מהירה במיוחד לשימור עוברי ארנבים לאחסון לטווח ארוך

סרטון זה מדגים את הליך הפשרת עוברי ארנב מזוגגים ואת צעדי מדידת הזהירות להתאוששות אופטימלית של העוברים.

הפשרת עוברי ארנב: הליך התחממות לשחזור עוברי ארנב שמורים בהקפאה לצורך החזרת עוברים

סרטון זה מתאר את הטכניקה של העברת עוברים לתוך האובידוקט של ארנבת נקבה מושתלת באמצעות לפרוסקופיה. הוא מאפשר עיצוב מחדש של עובר בארנבים במהלך נדידתו דרך האובידוקט, ובסופו של דבר מסייע בהשתלה מוצלחת. טכניקה זו יכולה לשמש גם עבור עוברים מאוחסנים עם יעילות טובה.

החזרת עוברים לארנבת: הליך להעברה מונחית לפרוסקופיה של עוברים לאובידוקט של מודל הארנבת המושתלת-ביוץ

ההתפתחות אחרונות בכלי מיקוד גן הופכת את הייצור של נוקאאוט ארנבים (KO) אפשרי. בעבודה הנוכחית, יצרו חמש ארנבות אפוליפופרוטאין (Apo) C-III KO באמצעות nucleases אבץ אצבע (ZFN). עבודה זו הראתה כי ZFN הוא שיטה יעילה ביותר כדי לייצר ארנבות KO.

ייצור של ארנבים נוק אפוליפופרוטאין C-III באמצעות nucleases אצבע האבץ

העברת עובר ברחם, חצוצרות משתמשת בצומת הרחם-חצוצרות כמחסום כדי למנוע את יצוא העובר שעלול להתרחש בעת ביצוע העברה ברחם. זכרים שעוקרו נדרשים להשיג מקבלי pseudopregnant לעוברים. שני הטכניקות הם דנו.

העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

MicroSecure Vitrification פותחה כמערכת התקני ויטריפיקציה סגורה אספטית לא מסחרית התואמת לשיטות הייצור והטיפול ברקמות של ה-FDA. עקב הוצאת קשיות עובר סתומות הידרופוביות מהתעשייה, הליך הזיגוג שונה כך שיכלול אטם פנימי לפני פקק הכותנה הפנימי הסטנדרטי.

Vitrification MicroSecure השתנה: כספת, פשוט מאוד נוהל Cryopreservation אפקטיבי עבור blastocysts אנוש

ביופסיה blastocyst ו ויטריפיקציה נדרשים ביעילות לבצע בדיקה גנטית מראש השרשה. גישה הדורשת את הפתיחה הרציפה של הסונה והחזרת התאים ה7-8 של תאי העור ביום 5-7 שלאחר ההפריה מגבילה גם את מספר המניפולציות הנדרשות ואת חשיפת העובר לתנאי הסביבה האופטימליים.

ביופסיה של האדם בלסטוציסטה וויטריפיקציה

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס מודל פשוט ויעיל להשתלת עוברים במבחנה להערכת המולקולות הרלוונטיות המשפיעות על תהליך השתלת העוברים.

הקמת מודל השתלת עוברים במבחנה

פרוטוקול זה מתאר טכניקת ניהול הריון והאכלה לארנבים שהועברו בעוברים והונדסו גנטית, שמטרתה להפחית את תמותת הארנבים שזה עתה נולדו ולשפר את יעילות ההכנה של ארנבים שעברו עריכה גנטית.

ניהול הריון והנקה לארנבות שהועברו בעוברים והונדסו גנטית

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מרית מונטווידאו לזיגוג עוברים לפני השרשה של עכברים וכבשים, המורכב ממרית תוצרת בית ושימוש בתמיסות תוצרת בית. העוברים מתאזנים במהירות בשתי תמיסות קריופרוטקטנטיות בריכוז הולך וגובר, נטענות על המרית, טובלות בחנקן נוזלי, ולבסוף נאטמות בקשית של 0.5 מ"ל.

מרית מכשיר מונטווידאו לזיגוג של עוברי יונקים

למד העברת עוברים לפרוסקופית מינימלית בארנבים בשילוב פרוטוקול ויטריפיקציה יעיל. שיטה זו מאפשרת אחסון לטווח ארוך ומספקת מודל אידיאלי למחקר רבייה אנושית.

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

גלה סרטונים נוספים