הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האקולוגיה הכימית, כגון זיהוי פרומונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מקשרת תרכובות חדשות לתפקוד הפרומונים. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו 15-30 צמדי ים זכרים בוגרים מינית במיכל המסופק עם 250 ליטר מי אגם הורון מוגזים, הנשמרים בטמפרטורה של 16-18 מעלות צלזיוס.

כדי לחלץ את המים הממוזגים על ידי מיצוי בשלב מוצק, העבירו אותם מהמיכל דרך מערכת השאיבה לראש העמוד. המים עוברים דרך מצע של שני קילוגרמים של שרף חילופי יונים פולימרי קוטבי בינוני הכלול בסדרה של ארבעה עמודי זכוכית בקיבולת ליטר אחד. לאחר מכן, הסר את הממס האורגני וקצור את התמצית על ידי אידוי סיבובי במשך חמש שעות בלחץ מופחת ב-40 מעלות צלזיוס.

כדי לבודד את בריכות השברים, יש להשרות את ג'ל הסיליקה בשלב הנייד הראשוני למשך 30 דקות. העבירו את הג'ל עם הממס לעמוד זכוכית ופתחו את השסתום שלו כדי לאפשר לשלב הנייד לעבור. לאחר מכן, מערבבים היטב את התמציות עם סיליקה ג'ל ומעמיסים אותן לתוך עמוד הכרומטוגרפיה הנוזלית מעל מצע הסיליקה ג'ל.

יש לסלק אותם עם שיפוע מ-95% כלורופורם למתנול ל-100% מתנול, וכתוצאה מכך בסך הכל 2.5 ליטר, ואז לאסוף את חומר הניקוי בבקבוקונים בודדים של 10 מיליליטר. לאחר מכן, בצע את ניסוי TLC על צלחות סיליקה ג'ל מצופות מראש על ידי מריחת הדגימה על קו ההתחלה וטבילת קו ההתחלה של הצלחת בממס המתפתח במיכל זכוכית אטום. לאחר שהממס המתפתח מגיע לקו הסיום, הוציאו את הצלחת מהמיכל והמתינו 10 דקות עד שהממס יתאדה.

דמיינו את הכתמים, תחילה תחת אור UV ב-254 ננומטר, ולאחר מכן צבעו את הצלחת על ידי ריסוס בתמיסת מתנול חומצית של 5% אניסלדהיד באמצעות מרסס כרומטוגרפיה וחימום ב-85 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן, רכזו את השבר לשאריות על ידי אידוי סיבובי בלחץ מופחת ב-40 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות. כדי לבצע הקלטת EOG, מלאו את האלקטרודות הנימים ואת מחזיקי האלקטרודות במצב מוצק, שהוכנו מראש עם כדורי כלוריד כסף-כסף, באשלגן כלורי תלת מולארי באמצעות מיקרופיפטה.

לאחר מכן, הכנס את האלקטרודות המוטות למחזיקי האלקטרודות. לאחר מכן, הכינו 100 מיליליטר של 10 עד מינוס 5 מולארי L-ארגינין במים מסוננים בפחם מ-10 עד מינוס שתי מוחנות L-ארגינין במים נטולי יונים בבקבוק נפחי. עבור עקומת תגובת הריכוז, הכינו 10 מיליליטר של דילולים פי 10 של בריכות השברים.

כעת, כוונו צמד מורדם במעמד בצורת V ועטפו אותו במגבת נייר רטובה כדי למנוע התייבשות. הכנס צינור של מים מוגזים במחזור המכיל 50 מיליגרם לליטר MS222 לחלל הבוקאלי. התאם את קצב הזרימה וודא שהמים יוצאים דרך פתחי הזימים כדי להשקות את הזימים באופן רציף.

שטפו את צינור אספקת הריח במים מסוננים וחברו אותו לשסתום המותקן על מיקרומניפולטור. לאחר מכן, הנח את צינור הנימים של אספקת הריח לתוך חלל אפיתל הריח כדי להעביר מים מסוננים לאפיתל הריח כדי למנוע התייבשות כאשר לא נותנים ריחות. לאחר מכן, הרכיב את אלקטרודות ההקלטה והייחוס על המיקרומניפולטורים.

הורד את אלקטרודת הייחוס על העור החיצוני ליד הנארס. בעזרת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי, הורד את אלקטרודת ההקלטה כדי לגעת בקושי במשטח אפיתל הריח. לאחר מכן, העבירו את ספיגת צינור אספקת הריח מהמים המסוננים ברקע לתמיסת L-ארגינין 10 למינוס חמש מולריות.

הפעל את המחשב, המגבר, המסנן והדיגיטייזר. באמצעות תוכנת מנהל התקן השסתומים, תכנת את ההליך למתן פעימה בודדת של ארבע שניות של ריח על ידי סימון התיבה של T1, הגדרת T לארבע שניות וסימון התיבה של T2.In תוכנת רכישת הנתונים, הגדר את מצב הרכישה לאוסילוסקופ במהירות גבוהה. לחץ על סמל ההפעלה ולאחר מכן לחץ על התחל במנהל התקן השסתום כדי להפעיל את דופק הריח.

התחל להקליט את הבקרה הריקה, L-ארגינין, ולאחר מכן את הריחות מריכוזים נמוכים לגבוהים עם שטיפה של שתי דקות של מים מסוננים בין יישומים. כדי לזהות שברים פעילים מבחינה התנהגותית, אקלמו את נקבת צמד הים הבוגרת מינית בכלוב השחרור במבוך למשך חמש דקות. שחררו את צמדי הים ותעדו את משך הזמן המצטבר שהצמדים מבלים בערוץ הניסוי והבקרה, שכל אחד מהם מכיל מי נהר, למשך 10 דקות.

לאחר מכן, החל את גירוי הבדיקה על ערוץ הניסוי שהוקצה באופן אקראי ברכב לערוץ הבקרה באמצעות משאבות פריסטלטיות בקצב קבוע של 200 מיליליטר לדקה למשך חמש דקות, ולאחר מכן החל את גירוי הבדיקה ברכב למשך 10 דקות נוספות ורשום את משך הזמן המצטבר שהצמד מבלה בערוצי הניסוי והבקרה. בהליך זה, יש לטהר עוד יותר את השברים הפעילים לתרכובות עם כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל באמצעות עמודת LH-20 ספאדקס. הכן את הדגימה ב-0.5 מיליליטר מהשלב הנייד הראשוני, טען אותה לעמודת הכלורופורם למתנול ולאחר מכן לעמודת המתנול, והוציא את השברים הפעילים כדי להניב את התרכובת.

ממיסים ומדללים את התרכובת המטוהרת בשלב הנייד הראשוני של HPLC ליצירת תמיסה של 10 מיקרוליטר של כמיקרוגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן, העבר את תמיסת הדגימה לבקבוקוני HPLC והכנס אותם לדגימה האוטומטית של HPLC. הזרקו את הדגימה לספקטרומטריית המסה של יינון אלקטרוספריי והקליטו את ספקטרומטריית המסה של יינון אלקטרוספריי ברזולוציה גבוהה באמצעות ספקטרומטר מסה כרומטוגרפיה.

ממיסים לחלוטין את הדגימה בממיסים המנופחים שנבחרו ליצירת תמיסה בריכוז שנע בין 0.1 ל -10 מיליגרם למיליליטר. העבירו את תמיסת הדגימה לתוך צינור NMR כדי להקליט את ספקטרום התמ"ג החד-ממדי והדו-ממדי על ספקטרומטר תמ"ג של 900 מגה-הרץ. מוצג כאן ספקטרומטר NMR של 600 מגה-הרץ.

זוהו חמישה פרומונים משוערים חדשים של צמדי ים והמבנים שלהם הובהרו בשיטות ספקטרומטריות וספקטרוסקופיות. פרומונים משוערים אלה היו מגרים לאפיתל הריח של צמד הים הבוגר והיו בעלי סף זיהוי נמוך ברישומי אלקטרו-אולפקטוגרמה. במבחני ההתנהגות של מבוך שתי האפשרויות, נקבות צמדי ים מיויצים נמשכו לפטרומיזון A, פטרומיזן A ופטרומיזן B, ונדחו מפטרומיזון C. תוך כדי ניסיון הליך בין-תחומי זה, חשוב לזכור לתאם את הניסויים הכימיים והביולוגיים לביצוע פרוטוקול איטרטיבי זה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ותגובות נגזרות על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הסטריאוכימיה של התרכובות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המוצרים הטבעיים והנוירואתולוגיה לחקור את הביוסינתזה הסבירה ואת התפקוד הביולוגי של הפרומונים באורגניזמים ימיים כמו צמדי ים. אל תשכח שעבודה עם כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון עבודה במכסה המנוע הכימי, לבישת כפפות ומשקפי מגן, בזמן הטיפול במגיב זה.