Name: קידוד גנטי חומצת אמינו קאנונית לדור של נוגדן תרופתיים Conjugates דרך תגובה מהירה Bioorthogonal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: למד שיטה לשינוי ספציפי של נוגדנים באמצעות נגזרת ציקלופרופן של ליזין ליצירת ADCs. הטכניקה מציעה תפוקה גבוהה, יציבות קשרים ויישום בטיפולים ממוקדים בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר רפואי, בריטניה. ריח רע-S. מחזיק של אחוות EMBO (ATLF 158-2016) והיא אסירת תודה ה' פלהאם, צ'ין וו לתמיכה, קים ג'י, מורגן וו ג ו- O. Perisic עבור עזרה וייעוץ.

1. לייצר, לאפיין את הנוגדן
<ol><li>אקספרס הנוגדן<ol>
<li>הפשרת בקבוקון של תאים ההשעיה HEK בבקבוקון 250 מ ל המכיל 50 מ של הביטוי מדיום בתוספת 100 יחידות/mL פניצילין סטרפטומיצין µg/mL 100, 250 ננוגרם למ"ל שהוא גוסס B. לשמור התאים ב 37 ° C עם 8% CO2 ב humidified חממות מצויד עם מטרף-125 סל ד. פצל תאים 0.3-0.5 x 106 תאים/מ ל (כל 2-3 ימים) לפחות 2 פעמים לפני transfecting.</li>
		<li>כאשר צפיפות של 2.5 x 106 תאים למ"ל הגיעו (2-3 ימים לאחר פיצול), להכין פתרון טריים של 100 מ מ CypK. למטרה זו, שוקלת 64 מ"ג של CypK, להוסיף 2.5 מ של 0.1 נתרן הידרוקסידי, מערבולת, ספין למטה כדי לשחזר את כל undissolved חלקיקים sonicate.</li>
		<li>להוסיף 2.5 מ של CypK (100 מ מ ב- 0.1 M NaOH) 42.5 מ של הביטוי בינוני עם אנטיביוטיקה. לערבב היטב, להוסיף 250 µL של 0.1 M HCl, לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
		<li>לדלל 50 µg HC ו- LC pKym1 פלסמידים21 עד 2.5 מ"ל מופחת סרום בינונית. בשפופרת נפרדים, לדלל 135 µL של תרביות תאים ריאגנט 2.5 מ ל מופחת סרום בינונית.</li>
		<li>חמש דקות לאחר הכנת את הפתרונות, לערבב את פלסמידים והפתרון ריאגנט תרביות תאים, תקופת דגירה של 20 דקות לאפשר הקמת מתחמי בין ה-DNA הכימית תרביות תאים.</li>
		<li>בינתיים, צנטריפוגה 125 מיליון תאים על הצפיפות יעד של 5 דקות ב 500 x g, resuspend עם המדיום ביטוי המכיל CypK ולהוסיף את תערובת ריאגנט DNA – תקנים. ניתן לרכוש CypK או מסונתז כפי שדווח בעבר18.</li>
		<li>לאחר המקננת תאים עבור 20 h, להוסיף 250 µL של תרביות תאים ריאגנט משפרי כלול בערכה.</li>
		<li>הקציר נוגדנים מן supernatant 6-7 הימים לאחר תוספת של CypK (ללא שינוי של מדיום זה נדרש במהלך הביטוי). *. לחלופין, כדי להשיג תשואות גבוהות יותר ועקבית יותר, קו תא יציב יכול להיווצר כפי שמתואר Oller-מרווה. et al. 201821. במקרה זה, trastuzumab(CypK)2 מתבטאת פשוט על ידי תוספת של CypK 5 מ מ ב המדיום הביטוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטהר את הנוגדן<ol>
<li>Centrifuge התאים למשך 15 דקות ב 3000 x g.</li>
		<li>לסנן את תגובת שיקוע של 0.45 או מסנן 0.22 מיקרומטר. אם המסנן הופך occluded, להחליף אותו באחד חדש והמשך סינון. אם זה קורה לאחר רק כמה מיליליטר, centrifuge את תגובת שיקוע למשך 15 דקות נוספות ב 7000 x g.</li>
		<li>להוסיף חלבון A שרף (2 מ ל/100 מ של תגובת שיקוע) בעמודה הריקה כרומטוגרפיה פוליפרופילן, equilibrate השרף לפחות 5 כרכים של מאגר שטיפת חרוז (0.1 M סודיום פוספט, 150 מ מ NaCl).</li>
		<li>לפצל את תגובת שיקוע שני צינורות חרוט 50 מ"ל ולהוסיף 5 x חרוז שטיפת מאגר (0.5 M סודיום פוספט, 150 מ מ NaCl) ואחריו השרף A חלבון equilibrated מראש. במקום הצינור חרוט על גלגלת עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר, כדי להוריד את הנוגדן ב תגובת שיקוע. לחלופין: להוסיף את תגובת שיקוע על העמודה לפחות פעמיים את אמצעי האחסון המומלץ של שרף ולאפשר לזרום דרך. ודא שאין כמות משמעותית של נוגדן שמאלן תגובת שיקוע על ידי עמודים מרחביות. אם יש, elute שוב את תגובת שיקוע דרך השרף.</li>
		<li>להעביר חלבון א' שרף עם תגובת שיקוע לתוך עמודה ולא תאפשר לנוזל לזרום דרך.</li>
		<li>להוסיף 25 מ של שטיפת מאגר (או שרף לפחות 10 כרכים) ולאפשר לזרום דרך.</li>
		<li>Elute הנוגדן עם 4 מ של 0.1 M סודיום ציטרט, pH 3, ב- 1 מ ל 1 מ' פוספט מאגר, 150 מ מ NaCl.</li>
		<li>לדלל הנוגדן עם 10 מ"ל ל- PBS, להתרכז 0.5-1 מ על ידי סינון צנטריפוגלי, מאגר exchange שלוש פעמים עם PBS.</li>
		<li>לטהר את הדגימות מאת FPLC באמצעות עמודה היק בוטיל עם זרם של 0.5 mL/min ו- 0-100% מעבר 30 דקות של מאגר מלח נמוכה (50 מ מ סודיום פוספט pH 7.0, 20% אלכוהול איזופרופיל) במאגר מלח גבוהה (1.5 M (NH4)2אז4, 50 מ מ סודיום פוספט pH 7.0 5% אלכוהול איזופרופיל). לאסוף את השברים כל ולנטר את • תנאי ב 280 ננומטר. כמויות קטנות (< 1 מ ג) יכול להיטהר עם HPLC-HIC בתנאים המתוארים 2.4 כדי למקסם את התשואה וטוהר.</li>
		<li>בריכת שברים להכיל נוגדנים, לדלל אותם לפחות 4 מ עם PBS, לרכז אותם על-ידי מאגר סינון והחלפת צנטריפוגלי שלוש פעמים עם PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכמת את הנוגדן<ol>
<li>להשיג ריכוז המשוער על ידי מדידת ספיגת ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים מיקרו נפח.</li>
		<li>אם נדרש מדידה מדויקת, להשתמש ערכת דיאגנוסטיקה כדי למדוד IgGs האנושית. הערכה גסה, השתמש מרחביות-דף עם כתם מבוססי Coomassie כדלקמן:<ol>
<li>הכן סטנדרטים על ידי דילול שש פעמים כפולה של הרצפטין סטנדרטי לכמת מאת אליסה-1 מ"ג/מ"ל.</li>
			<li>מרתיחים את הסטנדרטים והדוגמאות כ 0.25 מ"ג/מ"ל בהפחתת טעינת מאגר.</li>
			<li>להפעיל אותן בהקשר האבטחה משתמש Bis-טריס מרחביות-דף 4-12% מאגר MES-מרחביות, הכתם עם צבע מבוסס Coomassie. לבסוף למדוד צפיפות צבע של הלהקה התואם את האור או את שרשרת כבדה באמצעות ImageJ, לבצע אינטרפולציה האות מדגימות בעקומת סטנדרטי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>חנות הנוגדן ב 4 º C.</li>
</ol>2. נזווג הנוגדן ולאפיין את ADC
<ol><li>נזווג הנוגדן עם מולקולת tetrazine מניבי<ol>
<li>לדלל 10 טוחנת במקבילות של tetrazine-vcMMAE (4 µL, 3.4 מ מ דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) עם 20 µL של acetonitrile ו µL 76 ל- PBS בשפופרת חרוטיים קטנים (למשל,ה-PCR הצינור).</li>
		<li>להוסיף 1 שן טוחנת המקבילה trastuzumab(CypK)2 (100 µL, 2 מ"ג/מ"ל ב- PBS), לערבב היטב, אפשר להגיב במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר (25 ° C) כדי ליצור trastuzumab(MMAE)2. הערה: מולקולות אחרות כגון tetrazine-5-טמרה שניתן לקשרו הנוגדן במקום tetrazine-vcMMAE באמצעות פרוטוקול זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטהר את ADC<ol>
<li>מראש equilibrate גודל אי-הכללה של ספין עמודה עם PBS בעקבות הוראות היצרן.</li>
		<li>להוסיף את כל עוצמת התגובה על עמודה ספין, צנטריפוגה ב 1500 x g עבור 1 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכמת את ADC ולנתח את המספר המשלים מאת מרחביות-דף<ol>
<li>לכמת את ADC כפי שמתואר 1.3.2. על ידי מדידת צפיפות צבע של שרשרת אור בעמוד-מרחביות באמצעות הנוגדן-לאחרונה עבור העקומה סטנדרטי.</li>
		<li>שרשרת כבדה צריך מעט זזו מראה עלייה משקל מולקולרי על הבניין. הערה: אם הנוגדן משתנה עם fluorophore כגון trastuzumab(TAMRA)2, רק הלהקה המתאים לשרשרת כבדה צריך להראות זריחה בג'ל לפני צביעת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את המספר המשלים על-ידי HPLC-היק<ol>
<li>Equilibrate את העמודה HPLC-HIC עם 100% מאגר A (1.5 M (NH4)2אז4, 50 מ מ סודיום פוספט pH 7.0, 5% אלכוהול איזופרופיל) במשך 5 דקות.</li>
		<li>לערבב 15 µL (67 pmol) של פתרון 1 מ"ג/מ"ל של הרצפטין (CypK) 2 עם µL 15 של 2 x מאגר A בבקבוקון. ואז תוכנית זריקה 10 µL ב- HPLC.</li>
		<li>Elute ב תזרים 1 mL/min איזוקראטית עם 100% למאגר A 1 דקות ולאחריו הדרגתי 15 דקות מ- 100 ל- 0% של מאגר A B (50 מ מ סודיום פוספט pH 7.0, 20% אלכוהול איזופרופיל). לפקח על • תנאי ב 280 ננומטר.</li>
		<li>לחשב את דאר בהכניסו שיא המתאימים לכל מין ושימוש האזורים וכתוצאה מכך המשוואה הבאה: דאר = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2) /(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 trastuzumab(MMAE)2) שמירה צפוי זמן trastuzumab(CypK)2 הוא מין 7.5-8.0, הרצפטין (CypK, MMAE) הוא מין 9.1-9.6, עבור trastuzumab(MMAE)2 הוא 10.5-11.0 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את המספר המשלים על-ידי LC-MS<ol>
<li>Deglycosylate 30 µL של 1 מ"ג/מ"ל ADC ו הנוגדן יאומתו בהפחתת ללא תנאי שימוש 250 יחידות PNGase F לפחות 6-אייץ '-37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>Elute הנוגדן לתוך ספקטרומטר מסה ב- C4 1-5 מיקרומטר 1.0 x 100 מ"מ עמודה באמצעות שיפוע 20 דקות של 2% עד 80% acetonitrile במים. לרכוש נתונים מעל טווח מ/z 350-4000 במצב יון חיובי עם מתח קונוס של 150v.</li>
		<li>Deconvolute את הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנה מתאימה. לחשב את ההבדל במסה בין שונה נוגדנים שלא שונתה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. assay היציבות של ניגודים Dihydropyridazine Trastuzumab(TAMRA)2 בנסיוב
<ol><li>לסנן בנסיוב באמצעות מסנן 0.22 μm בתנאים סטריליים. ניתן להוסיף 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/mL 100.</li>
	<li>למלא הבארות חיצוני של צלחת 96-ובכן עם מים. בבארות במרכז, מערבבים את µL 90 triplicate של נסיוב המסוננת עם 10 µL של 1 מ"ג/מ"ל trastuzumab(TAMRA)2 ב- PBS ב ריכוז סופי של 0.1 mg/mL. מקם את הצלחת באינקובטור רווי לחות-CO 37 ° C ו- 4-5%2.</li>
	<li>כל 24 שעות ביממה במשך 5 ימים, pipet כל טוב ביסודיות מערבבים, לקחת µL 5 aliquot, הקפאה בחנקן נוזלי, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר שנאסף כל הדגימות, להפשיר את aliquots ולנתח תוך שימוש של אליסה עקיף כמו שדווחה בעבר12 עם מספר שינויים:<ol>
<li>מעיל צלחת 96-ובכן לילה עם 0.25 µg/mL HER2 ב 4 º C. כל צעדים אחרים מבוצעות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>למחרת, לשטוף 5 פעמים עם PBS 0.05% tween (PBS-T) ולחסום עם אלבומין פרה 1% לשעה.</li>
		<li>רוחצים את דגירה הדגימות ב 1:10000 דילול ב- PBS כבר שעתיים.</li>
		<li>רוחצים את דגירה נוגדן anti-טמרה העולות העכבר 1:2000 דילול ב- PBS-T עם 0.5% BSA לשעה.</li>
		<li>רוחצים את דגירה אנטי-העכבר HRP תרכיב 1:1000 ב- PBS-T עם 0.5% BSA לשעה.</li>
		<li>להוסיף שוייץ ולאפשר להגיב 5-10 דקות.</li>
		<li>לעצור את התגובה עם µL H 502אז ספיגת 1 מ' ולמדוד4 -450 ננומטר. להחסיר רקע נמדד ב 570 ננומטר.</li>
		<li>להתאים עקומה רגרסיה לוגיסטית 4-פרמטר כדי דילולים סטנדרטי, אינטרפולציה מדידות מדגימות. הערה: היציבות של trastuzumab(MMAE)2 יכול להיות מוערך באמצעות פרוטוקול אותו על-ידי שינוי וזמינותו שמתואר 3.3 עבור ערכת דיאגנוסטיקה מסחרית כדי למדוד את הריכוז של נ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. להעריך את Cytotoxicity של נ
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על מבחני שדווחה בעבר23,,26 , עם מספר שינויים.
<ol><li>הפשרת SK-BR-3 ו- MCF-7 תאים ולאפשר להם להתיישב p25 מבחנות המכילות בינוני מלא, קרי DMEM בתוספת 10% חום להשבית סרום שור עוברית, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100.</li>
	<li>פצל תאים על 80-90% הנהרות (כל 3-4 ימים) לפחות 2 פעמים לפני וזמינותו.</li>
	<li>יומיים לפני וזמינותו, למלא הבארות החיצוני של צלחת 96-ובכן עם מים. לאחר מכן להרים תאים עם 0.05% טריפסין ב- 0.5 מ מ EDTA, צנטריפוגה 3 דקות ב 250 x g, resuspend במדיום חדש, זרע 3000 בתאים µL 100 לכל טוב (ריק) לוחית 96-ובכן.</li>
	<li>יומיים לאחר זריעת תאי, להכין 10 דילולים טורי של כל הדגימות שהפקידים עם דימתיל סולפוקסיד 0.1% בינוני מלא. שקול את דגימות והפקדים הבאים: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, הרצפטין פראי סוג, tetrazine-vcMMAE ו- MMAE.</li>
	<li>מוסיפים 100 µL של כל דגימה מכל קידוח, תקופת דגירה של 5 ימים-CO 37 ° C ו- 4-5%2.</li>
	<li>יום 5, למדוד תא הכדאיות. לשם כך, השתמש ערכת מסחרי lyse התאים ולמדוד את ATP שוחרר. להתוות את אחוז אות ביחס תאים שליטה שטופלו דימתיל סולפוקסיד 0.1%. הערה: ADCs יכול להיות מודגרות במשך 5 ימים בנסיוב, לבדיקה עבור cytotoxicity להוכיח יציבות פונקציונלי. התראה: MMAE הוא רעיל מאוד. לפיכך משתמשים כפפות ומשקפי מגן בעת טיפול MMAE נגזרים. אם אתה משתמש MMAE שלא שונתה כפקד בניסוי שלך, כאשר מכינים את הפתרון מניות ב דימתיל סולפוקסיד, להתמודד עם המוצר מוצק בפנים ברדס fume.</li>
</ol>

<ol><li>Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).</li>
<li>Wakankar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+Stability+of+the+Antibody%E2%88%92Drug+Conjugate+Trastuzumab-DM1%3A+Changes+due+to+Modification+and+Conjugation+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).</li>
<li>Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antineoplastic+Efficacy+of+Doxorubicin+Enzymatically+Assembled+on+Galactose+Residues+of+a+Monoclonal+Antibody+Specific+for+the+Carcinoembryonic+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen.</a> Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).</li>
<li>Hamblett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Drug+Loading+on+the+Antitumor+Activity+of+a+Monoclonal+Antibody+Drug+Conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate.</a> Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Drug+Conjugates%3A+An+Emerging+Concept+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).</li>
<li>Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+and+Reprogramming+the+Genetic+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expanding and Reprogramming the Genetic Code.</a> Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).</li>
<li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li>
<li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Conjugates+with+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Approach+to+Site-Specific+Antibody+Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).</li>
<li>Kern, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Pyrophosphate+Diesters+as+Tunable%2C+Soluble%2C+and+Bioorthogonal+Linkers+for+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).</li>
<li>Zimmerman, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Optimized+Non-Natural+Amino+Acids+in+a+Cell-Free+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).</li>
<li>VanBrunt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Azide+Containing+Amino+Acid+in+Mammalian+Cells+Enables+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Click+Cycloaddition+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).</li>
<li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Incorporation+of+Multiple+Unnatural+Amino+Acids+into+Proteins+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Strategies+for+Single-Molecule+Protein+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Efficient+Procedures+for+the+Conjugation+of+Biomolecules+through+Huisgen+Azide-Alkyne+Cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).</li>
<li>Koehler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Code+Expansion+for+Multiprotein+Complex+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering.</a> Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).</li>
<li>Lyon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Hydrophobicity+of+Homogeneous+Antibody-Drug+Conjugates+Improves+Pharmacokinetics+and+Therapeutic+Index%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).</li>
<li>Elliott, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+Labeling+and+Protein+Identification+in+Specific+Tissues+and+at+Specific+Developmental+Stages+in+an+Animal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal.</a> Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).</li>
<li>Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/qo/c7qo00054e">Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems.</a> Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).</li>
<li>Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Cyclopropene+Tags+with+Fluorogenic+Tetrazine+Cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).</li>
<li>Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Efficient+Generation+of+Stable+Antibody-Drug+Conjugates+via+an+Encoded+Cyclopropene+and+an+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).</li>
<li>Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Multisite+Unnatural+Amino+Acid+Incorporation+in+Mammalian+Cells+via+Optimized+Pyrrolysyl+tRNA+Synthetase%2FtRNA+Expression+and+Engineered+eRF1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li>
<li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Conjugation+of+a+Cytotoxic+Drug+to+an+Antibody+Improves+the+Therapeutic+Index%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li>
<li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+of+Reactive+Cysteine+Residues+for+Site-Specific+Labeling+of+Antibody-Fabs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Doronina, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+potent+monoclonal+antibody+auristatin+conjugates+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).</li>
<li>Shiraishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Highly+Reactive+Cysteine+Residues+at+Less+Exposed+Positions+in+the+Fab+Constant+Region+for+Site-Specific+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).</li>
<li>Sabourin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Antibody+Yield+and+Modulating+Final+Product+Quality+using+the+Freedom%28TM%29%5BTitle%5D)+AND+%22CHO-S%28TM%29+Production+Platform.+BMC+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM).</a> CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102(2011).</li>
<li>Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lines+as+Candidate+Reference+Materials+for+Quality+Control+of+ERBB2+Amplification+and+Expression+Assays+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer.</a> Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).</li>
<li>Shinmi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+Conjugation+Method+for+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+through+Reactive+Cysteine-Engineered+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).</li>
<li>Badescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+Disulfides+for+Stable+and+Defined+Antibody+Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).</li>
<li>Vazquez-Lombardi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+human+antibodies+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transient expression of human antibodies in mammalian cells.</a> Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).</li>
<li>Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaldi%2C+L+%22Protein+Expression+in+Mammalian+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22">Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols</a>. Hartley, J. L. , Humana Press. 13-26 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ההליך ביטוי ארעית כדי לייצר trastuzumab(CypK)2 שמתואר פרוטוקול זה היא פשוטה ומאפשרת מודולריות גבוהות. התשואות שהושגו נמצאים במרחק אלה צפוי של הגדרה אקדמית27 , שורות תאים יציב יכול להיווצר להמשיך להגביר את תפוקת הייצור21. במהלך ביטוי, ריכוזי CypK נמוכים מ- 5 מ מ עשוי לגרום לתוך התחתון התאגדות המכללות, סכומים גבוהים עשויים להשפיע על צמיחת תאים ולהקטין נוגדן התשואות. CypK כמו חומצה אמינית חופשית יש מסיסות נמוכה במים, וכך זה צריך להיות קודם נעלם על 100 מ מ ב- 0.1 M NaOH ולאחר מכן נוסף המדיום תרבות. לאחר דילול CypK בטווח הבינוני, לפני הוספתו לתאים, הוא קריטי כדי לנטרל. את המדיום עם HCl מסנן כדי לעקר. לאחר מכן, בעזרת ריאגנטים של תרביות תאים שצוין בפרוטוקול זה, בעקבות הזמנים הדגירה המומלץ על ידי היצרן חשוב עבור ביטוי גבוהות תנובה. לפרטים נוספים על ביטוי ארעית של נוגדנים אנושיים, הקורא מכונה אחרים שפורסמו פרוטוקולים31,32.
כאשר הנוגדן מטוהר, עודף גבוה של חלבון A שרף נדרש כמצוין כדי להבטיח נוגדן מלא לנתץ מ תגובת שיקוע. על מנת למנוע תחילת המדידות של הרצפטין • תנאי, זה recommendable להשתמש פתרון עם אגירת גבוהה קיבולת, שתדללו מיד עם PBS ולהחליף את המאגר הימנעות ריכוז מופרז. תמיד מחזיקים הנוגדן < 5 מ"ג/מ"ל.
הבניין של trastuzumab(CypK)2 עם tetrazine-vcMMAE הוא מהיר יותר מאשר רוב התגובות התייצבתי עם ידיות bioorthogonal אחרים ADCs. יתר על כן, cycladdition הזה מתרחש בתנאים קלה מאוד: בטמפרטורת החדר או pH נמוך יותר, פיזיולוגיים. זה חשוב לדלל את הפתרונות דימתיל סולפוקסיד מניות של שני המגיבים עם acetonitrile לפני תוספת של PBS הנוגדן; אחרת לזרז נגזרות tetrazine. Acetonitrile נדרשת רק בשל hydrophobicity גבוהה של MMAE, טמרה, אך פחות מולקולות הידרופוביות ייתכן שלא תזדקק התוספת של הממס שותף. לחלופין, tetrazine-vcMMAE יכול להיות מצומדת ללא acetonitrile ושווי טוחנת רק 2 של tetrazine-vcMMAE בתוך 20 h. זו כמות קטנה של הרעלן יכול לכלול ירידה משמעותית עלות הייצור של ADC בהשוואה לטכנולוגיות הנוכחי מבוסס ncAA. Trastuzumab(CypK)2 הוא מלא תגובתי לפחות 4 חודשים כאשר נשמר ב 4 º C.
HPLC-HIC מאפשר של קביעה מדויקת של דאר מאז MMAE הידרופוביות מאוד ומספק פתרון מעולה של הפסגות המתאים נוגדן conjugates עם רעלים 0, 1 ו-2. Tetrazine unreacted-vcMMAE elutes בסביבות 13.7 min, ומתגלה ב 280 ננומטר. טכניקה זו דורשת חומר המוצא עם טוהר גבוהה. יתר על כן, זה לא recommendable כדי להרוות את התגובה עם מולקולות tetrazine-תגובתי אחרות כגון BCN-הו, מאחר שהם יכולים לשנות את הזמנים שבהם השמירה ואת הצורה של הפסגות. זה חיוני כי ריכוז מלח של הדגימות תואם האחד בשלב ניידים ההתחלה של מעבר הצבע על מנת לקבל הפרדה טובה, במיוחד אם יותר מ 10-20 µL מוזרקים.
לגבי הניתוח של LC-MS, deglycosylation של הדגימות נוגדן נדרש כדי להשיג לשיא יחיד על deconvolution של הספקטרום raw. הדיוק של נוגדן הכולל וגושים ADC עשוי להשתנות בהתאם callibration של המכשיר. לפיכך, על מנת לחשב את המסה על השינוי, להחסיר את המסה השיג עבור נוגדנים שלא שונתה מזו השיג עבור נ. מודרני ספקטרומטרים המוני ברזולוציה גבוהה לספק הודעת שגיאה יחסית מתחת 1:10000. למרות LC-MS יכול לשמש גם כדי לחשב את היחס בין המינים השונים, ערך זה הוא בדרך כלל הערכה מופרזת כי השינוי עשוי להשפיע על יכולת יינון של המין האנושי שנוצר ולא ייתכן כמויות נמוכות של זיהומים לא יזוהו.
היציבות של מקשר ב ADCs היא קריטית, כי שחרור מוקדם של התרופה גורמת רעילות גבוהה יותר, יעילותם נמוכה יותר; cytotoxin חינם נזקים לרקמות בריאות ומתחרה הנוגדן עירום עם אחד החמושים של האתרים מחייב היעד על תאים נגועים. שחרור להלן 5%, אשר נמצאים ההשתנות של יציבות וזמינותו, אמור להיות צפוי.
בסופו של דבר, את מידת הבררנות של ADC פילוח HER2 כגון trastuzumab(MMAE)2 יכול להיות מוערך על ידי השוואת את cytotoxicity בתאי SK-BR-3 (HER2 גבוהה) ו- MCF-7 תאים (HER2 נמוך) מאז שהאחרון express 15-fold קולטני HER2 פחות מאשר לשעבר28 . Immunoconjugate צפויה לגרום לתוך הכדאיות תא לפחות 2 סדרי גודל נמוך יותר ב- SK-BR-3 בהשוואה ל- MCF-7. ה EC50 ב- SK-BR-3 צריך להיות בטווח של nanomolar-ספרתיים המשקף את האון גבוהה של29,הזה ADC30. הנוגדן שלא שונתה, trastuzumab(MMAE)2 או הרצפטין, צריך להראות אין רעילות ב זה וזמינותו. Tetrazine-vcMMAE צריך להיות עם אפקט 3 סדרי גודל נמוך יותר ADC מאז מקשר מסיר את הפעילות של הרעלן peptidomimetic. לעומת זאת, כי MMAE הוא מסוגל לחדור את קרום התא30, רצוי יש של רעילות דומה ל נ אלא להציג שום אפליה בין HER2 גבוהה וקווים תא נמוך HER2. יתר על כן, אם וזמינותו הזה מבוצע לאחר דגירה 5 ימים של נ בנסיוב, זה יכול לשמש כדי לספק הוכחה פונקציונלי היציבות של מקשר: שחרור של הרעלן יגרום לתוך גם ירידה ברמת היעילות ADC SK-BR-3 MMAE שוחרר עם p אמנות את מקשר או לירידה סלקטיביות אם מקשר היה ביקע בצורה traceless.
הטכנולוגיה ADC המתוארים בזאת מאפשר שילוב יעיל של בייעודי לאתר של נגזרת cyclopropene של ליזין לתוך IgG1s. בעקבות הוא לטיהור נתיישב, נוגדנים יכולים להיות במהירות מצומדת עם מולקולות המכילות tetrazine, מניבים מוצרים הומוגנית. בשל גודלו הקטן תגובתיות גבוהה של הידית מינימלית cyclopropene, שיטה זו צריך לאפשר את ההטיה של מטענים sterically הפריע. Immunoconjugates שנוצר יציבים בנסיוב והם מאוד חזק, סלקטיבי. בסך הכל, CypK מאפשר חיבור אמיתי bioorthogonal מהיר, בייעודי לאתר ויציב נוגדן, אחרים conjugates חלבון כדי לשמש טיפול או אבחון.

נוגדן תרופתיים conjugates (ADCs) לשלב את מידת הבררנות של חברת את העוצמה של מולקולות קטנות ציטוטוקסיות. רוב ADCs במטרה להקטין את תופעות הלוואי של כימותרפיה מסורתי על ידי מיקוד תרופות המשפיעות על דנ א או microtubule הפילמור סרטן תאים1. דור ראשון ADCs אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) מסתמכים על השינוי של lysines ו cysteines, אשר יוצר תערובות של מולקולות ששינה לעבר עמדות שונות עם ירידה המאפיינים פרמוקוקינטיים2. לעומת זאת, ההטיה לרישום תרופות הנוגדנים ניתן להפיק תרכובות עם3,indeces טיפולית משופר4. המבקשים לפנות את האתגר של הפקת ADCs הומוגנית, מספר סלקטיבי שינויים כימיים, אנזימטי כבר דווח על1,5. עם זאת, שיטות הנוכחי יכול המטרה רק עמדה מסוימת על הנוגדן, סובלים ביטוי חלבון נמוכה, linkers לספק יציבות נמוכה או להסתמך על תגובות איטי תנובה נמוך.
שילוב של חומצות אמינו קאנונית (ncAA) דרך הרחבת הקוד הגנטי מאפשר התקנה בייעודי לאתר של שפע של קבוצות תגובתי bioorthogonal לחלבונים, פוטנציאל להתגבר על המגבלות של שיטות אחרות ששימשו ליצירת ADCs. קידוד ncAAs בתגובה codon היעד (stop) מסתמך על זוגות המעביר/tRNA aminoacyl-tRNA שנמצאים אורתוגונלית כדי זוגות אנדוגני המשלבים חומצות אמינו הקנוני6. NcAAs מספר שולב נוגדנים כדי ליצור ADCs. עם זאת, ביותר סובלים התחייבויות שונות עבור יישומים בסמים טיפולית ההטיה. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 הוא לא מלא bioorthogonal, דורש חומציות נמוכה (4.5), זמני תגובה ארוכים (> 60 h), בעוד azides כגון p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11, ושאול אזיד של ליזין (AzK)12,13 עשוי להיות מופחת ב תא14, ואת הנחושת נהגה לעודד Huisgen cycloadditions יכול לגרום נזק חמצוני 15.
למרות ncAAs חלופית המבוססת על טרנס-cyclooctene (TCO), cyclooctyne (SCO) ו- bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) לאחרונה קודדו נוגדן למטרות הדמיה, מערכת ביטוי סובל תשואות נמוכות מאוד (0.5 מ ג/ליטר)16. יתר על כן, cyclooctenes ואת cyclooctynes הם גדולים, ידיות הידרופובי אשר עשוי להגדיל את הרגישות של נ עבור מטענים -ADC צבירת באופן מסורתי הידרופובי הינם המאפיינים physicochemical של מקשר הוכחו במידה רבה השפעת פרמקוקינטיקה ותרפויטי17. לעומת זאת, cyclopropenes 1, 3-disubstitued הן קבוצות קטנות תגובתי זה אמור לגרום שינוי מינימלית חלבון מבנה ו- physichochemical מאפיינים18. Cyclopropenes באופן סלקטיבי ובלתי במהירות להגיב עם tetrazines דרך האלקטרון הפוך-דרישה תגובת דילס-אלדר cycloaddition19. ב פרוטוקול זה נעשה שימוש נגזרת של מיסב ליזין (CypK, איור 1b) מתיל-cyclopropene זה פחות מושפע הסטריים אני אפריע גדול יותר מחזורי רוויים מאומצות ויש קבוע קצב התגובה לפי סדר 1-30 מ'-1ש -1 מדיה מימית18,20.
לאחרונה דיווחנו כיצד לשלב CypK נוגדנים כדי ליצור ADCs תוך שהיא מגיבה זו אחיזה מינימלית bioorthogonal עם מולקולות tetrazine מניבי21. כאן נתאר את ההליך הכנה ADC בפירוט רב יותר עם דגש על השלבים המאתגרים ביותר. שילוב של CypK מכוון משתמש של pyrrolysyl-סינתזת המעביר (PylRS) / זוג tRNAצ'ואה(PylT) בתגובה codon ענבר הציג בשרשרת כבדה נוגדן (HC)22. כאן אנו משתמשים פלסמידים 2 תרביות תאים ארעי (איור 1 א'), אחד קידוד שרשרת כבדה של הנוגדן, והשני קידוד שרשרת אור (LC), שני המכיל את הקלטת PylRS/PylT. לחלופין, ניתן להפיק קו תא יציב המאפשר תשואות גבוהות של נוגדנים דרך פרוצדורה יותר מפרך21.
המערכות הביטוי הנ ל יכול לייצר את נוגדן anti טיפולית-HER2 1 (IgG1) הרצפטין עם CypK ברמות דומות כדי פראי סוג נוגדן. בחרנו העמדה הראשונה של התחום CH1 בשרשרת כבדה כדי לקודד ncAA (HC-118TAG). זה הוא אתר ששונה הנפוץ ביותר ADCs23 נקראת HC-118 (האיחוד האירופי מספור) אבל יש גם מכונה HC-121 (רצף מיקום) ו HC-114 (מספור Kabat)24. מאז עמדה זו כולו לאורך כל IgG1s, מערכות אלו ביטוי צריך להיות מקובל נוגדנים הכי טיפולית.
אנו מראים trastuzumab(CypK)2 יכול בקלות להיטהר על ידי חלבון שהופעלו על ידי חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית עם עמודה אינטראקציה הידרופובי (FPLC-HIC). לאחר מכן הנוגדן מקושר covalently בתוך 3 h microtubule הפילמור מעכב monomethyl auristatin E (MMAE), אשר משמש את ADC Adcetris שאושרו על-ידי ה-FDA. כאן אנו משתמשים נגזרת בנזיל-tetrazine של MMAE (tetrazine-vcMMAE) עם מקשר (linker) כגון כרווח glutarate, ולין-citrulline רכיב פרוטאז-יציב ולאחריו יחידת - aminobenzylalcohol pself-immolative; מקשר זה הוא ביקע מאת Cathepsin B ב- ליזוזום על הפנמה של נ וכתוצאה מכך השחרור traceless של הרעלן25. כדי להראות היקפה הנרחב של התגובה, הנוגדן מקושר גם tetramethylrhodamine fluorophore (טמרה). נסביר איך לאמת את זהות לחשב את המשלים שלו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים ספקטרומטר מסה (LC-MS) כדי לחשב את יחס סמים-כדי-נוגדנים (DAR) באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים עם עמודה אינטראקציה הידרופובי (HPLC-HIC) .
במסגרת האפיון של הופעת נוגדנים, אנו נתאר כיצד לבחון את היציבות של ניגודים dihydropyridazine בנסיוב אדם. פרמטר זה בקלות רבה יותר שקובעת בטמרה-הרצפטין כי זה ניתן לכמת מאת אליסה פשוטה הפרשנות של התוצאות לא מסובך ידי ברכיב פרוטאז יציב של trastuzumab(MMAE)2. לבסוף, סלקטיביות של עוצמת האנרגיה של trastuzumab(MMAE)2 מוערך על-ידי השוואת את cytoxicity של ADC מעבר לגבולות התא לבטא רמות שונות של HER2. זה וזמינותו מספק גם הוכחה פונקציונלי של יציבות ADC כאשר מבוצעת לאחר המקננת על immunoconjugate בנסיוב אדם.

<table><tbody><tr><td>Expi293F</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14527</td><td>תאי השעיה HEK</td></tr><tr><td>Expi293 ביטוי בינוני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>A1435101 ביטוי בינוני</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייקטית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B</td></tr><tr><td>125 מ"ל פוליקרבונט בקבוק ארלנמאייר עם מכסה אוורור</td><td>קורנינג</td><td>431143</td><td>צלוחיות לנער</td></tr><tr><td>חממת Brunswick S41i</td><td>Eppendorf</td><td>S41I230011</td><td>חממת CO2 עם שייקר</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד 4 mol/l (4 N) בתמיסה מימית</td><td>VWR</td><td>191373M</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopropene lysine</td><td>Sichem</td><td>SC-8017</td><td>במחקר זה הוא סונתז כמתואר על ידי Elliot et al. 2014</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0.22 &micro; m, polyethersulfone, גמא מוקרן</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, סרום מופחת בינוני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>סרום מופחת</td></tr><tr><td>בינוני ExpiFectamine 293 Transfection Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14525</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>5810 R צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5811000460</td><td></td></tr><tr><td>יחידת מסנן מזרק Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m, polyethersulfone, 33 מ"מ, מעוקר</td><td>גמא Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>חלבון A שרף</td><td>סינו ביולוגי</td><td>10600-P07E-RN-25</td><td></td></tr><tr><td>עמודות כרומטוגרפיה פולי-הכנה, חבילה של 50</td><td>ביו-ראד</td><td>7311550</td><td>פוליפרופילן עמודה כרומטוגרפיה</td></tr><tr><td>אקונו-עמודה משפך</td><td>ביו-ראד</td><td>7310003</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>פלוקה</td><td>71635</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; ערכת בחירת KTA explorer</td><td>FPLC GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiTrap HIC GE</td><td>Healthcare</td><td>28-4110-07</td><td>כוללת HiTrap 1 מ"ל בוטיל HP</td></tr><tr><td>אמוניום סולפט</td><td>VWR</td><td>2133.296</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>Honywell</td><td>34863-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>טטרזין-vcMMAE</td><td>ChemPartner</td><td>-</td><td>Costum מסונתז</td></tr><tr><td>Tetrazine-5-TAMRA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-017-05</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 מ"מ x 10 באר</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 מ"מ, 5 ומיקרו; m</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>088553</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>NanoAcquity</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4 BEH 1-5 ומיקרו; m 1.0 x 100 מ"מ עמודת UPLC&nbsp;</td><td>ווטרס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 בארות מיקרו-פלטות לתרבית תאים</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>סרום אנושי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4522-20 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HER2 ECD</td><td>Sino Biological</td><td>10004-HCCH</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TAMRA</td><td>Abcam</td><td>an171120</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר HRP</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>TMB</td><td>BioLengend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>84727-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar FS</td><td>BMG קורא</td><td></td><td>צלחות</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5671-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>בדיקת HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>CellTiterGlo 2.0 Promega</td><td></td><td>G9242</td> בדיקת <td>כדאיות תאים המבוססת על מדידת ATP המשתחרר לאחר ליזיס תאים. אות הפלט הוא זוהר.</td></tr><tr><td>מונומתיל אוריסטטין E</td><td>קיימן כימי</td><td>16267</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח</td></tr><tr><td>אנושי IgG ELISA Quantificaiton Set</td><td>Bethyl</td><td>E80-104</td><td></td></tr><tr><td>MaxEnt1 ב-MassLynx</td><td>Waters</td><td></td><td>יישום תוכנה לפירוק ספקטרום המוני</td></tr><tr><td>IntantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>כתם מבוסס קומאסי</td></tr><tr><td>ערכת MMAE-ADC ELISA שלמה (בדיקת סנדוויץ')</td><td>Epitope Diagnostics, Inc.</td><td>KTR 782</td><td></td></tr><tr><td>צינור 50 מ"ל, 114x28 מ"מ, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>צינור חרוטי</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידות סינון צנטריפוגלי 50,000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td>רכז סינון צנטריפוגלי (לאחר חלבון A למשוך כלפי מטה)</td></tr> <tr><td>יחידות מסנן צנטריפוגלי Amicon Ultra-4 50,000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC805024</td><td>רכזי סינון צנטריפוגליים (לאחר טיהור FPLC או HPLC)</td></tr><tr><td>עמודי התפלה של Zeba Spin, 7K MWCO, 0.5 מ"ל</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>89882</td><td>עמודות ספין אי הכללה בגודל</td></tr><tr><td>צינור PCR 0.2 מ"ל כובע שטוח</td><td>גדילן מדעי בע"מ</td><td>AX-PCR-02-CS</td><td>PCR צינורות</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp&ordf; תחתית שטוחה</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>44-2404-21</td><td>צלחות עבור ELISA</td></tr></tbody></table>

קידוד גנטי חומצת אמינו קאנונית לדור של נוגדן תרופתיים conjugates דרך תגובה מהירה bioorthogonal

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

נוגדן תרופתיים conjugates (ADCs) בשימוש כיום בפרקטיקה הקלינית הם תערובות של מולקולות הנוגדן מקושרת למספר משתנה של רעלים לעבר עמדות שונות. פרה מחקרים הראו כי ניתן לשפר את חלון תרפויטי של אלה ADCs מסורתיים מאת ניגודים בייעודי לאתר רעלים. אולם, לגישות כדי לייצר ADCs הומוגנית יש מספר מגבלות, כגון חלבון נמוכה ביטוי וקינטיקה מגיבים לאט. ב פרוטוקול זה נתאר כיצד להגדיר מערכת ביטוי לשלב נגזרת cyclopropene של ליזין (CypK) נוגדנים באמצעות הרחבת הקוד הגנטי. ידית bioorthogonal מינימלי זה מאפשר נטיה מהירה של נגזרות tetrazine דרך cycloaddition תגובת דילס-אלדר הפיכה-דרישה. המערכת הביטוי כאן דיווח מאפשרת ייצור נתיישב ולטיהור הרצפטין הנושאת CypK בכל אחד השלשלאות הכבדות. אנחנו מסבירים כיצד ליצור קישור הנוגדן auristatin monomethyl הרעלן E ולאפיין את immunoconjugate על ידי האינטראקציה הידרופובי וספקטרומטר מסה. לבסוף, אנו מתארים את מבחני כדי להעריך את היציבות בנסיוב האנושי של ניגודים dihydropyridazine הנובע הבניין וכדי לבחון את cytotoxicity סלקטיבית של נ עבור תאים סרטניים בשד עם רמות גבוהות של הקולטן HER2.

מערכת דווח על הביטוי ארעי (איור 1 א') מניב 22 ± 2 מ ג של trastuzumab(CypK)2 לליטר של תרבות בינוני, אשר מייצג את 2/3 של הנוגדן פראי סוג מיוצר תחת באותם התנאים (איור 1 c). הקו הסלולרי יציב יכול להגדיל את התשואה עד 2 mg/L ±2131.
יכול להיות מצומדת Trastuzumab(CypK)2 עם tetrazine-vcMMAE, אשר מניב trastuzumab(MMAE) הומוגנית בדאנטה2 בתוך 3 שעות 25 ° c (איור 2). Hydrophobicity גבוהה של cytotoxin זה דורש תוספת של 10% acetonitrile כאשר 5 או יותר מהמקבילות טוחנת של רעל לכל CypK משמשים. לחלופין, cycloaddition השלמת גם בתוך 20 h שימוש במקבילות 2 של tetrazine-vcMMAE ללא acetonitrile (איור 2 c). Trastuzumab(CypK)2 מגיב עם tetrazine-טמרה בתוך 2 h ב- 25 ° C, h 3-6 נדרשים כאשר הטמפרטורה יורדת עד 4 ° C (איור 3 c).
דאר הצפוי עבור trastuzumab(MMAE)2 נמדדת HPLC-HIC הוא 1.9 (איור 2b). הפסגה שנצפתה בתחילה chromatogram ב דקה 8.0 מייצג הנוגדן unconjugated (DAR 0), כדאי נעלמו לחלוטין כאשר התגובה הושלם. המין עם 1 דאר elutes ב 9.1-9.6 דקה ויש לו של האזור &lt; 10% לאחר 3 שעות; ויש המוצר היעד עם 2 דאר לו זמן השמירה של 10.5-11.0% &gt; 90 אזור הצפוי. הניידות shift וזריחה במרחביות-דף ג'לים מאשר שילוב של טמרה (איור 3b) והזהות של immunoconjugates מאומת על ידי LC-MS (איור דו-ממדי-e ו- 3d איור).
דגירה של trastuzumab(TAMRA)2 במשך 5 ימים בנסיוב אדם, לאחר מכן ניתוח מאת אליסה מאשרת כי המטען נשאר קשור הנוגדן (איור 4b). לגבי וזמינותו cytotoxicity, trastuzumab(MMAE)2 מציג האון גבוהה ב- SK-BR-3 (HER2 גבוהה) השד תאים סרטניים, עם ריכוז אפקטיבי מקסימלי חצי (EC50) של 55 ± 10 בלילה (איור 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 שומר את cytotoxicity לאחר 5 ימי דגירה בנסיוב אדם (איור 4 c). לעומת זאת, כאשר ADC זה לבדיקה-MCF-7 (HER2 נמוך) ה EC50 הוא 200-fold נמוך (איור 4 d). פראי סוג נוגדן, trastuzumab(CypK)2 , tetrazine-vcMMAE מראים רעילות נמוכה ביותר (איורים 4 d ו- 4e), ואילו MMAE מציג גבוה cytotoxicity לא בררניים בשתי השורות תא (איור 4e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig1.jpg"> איור 1: מערכת ביטוי ארעית. א רלוונטי מחוזות פלסמידים משמש תקנים ארעי בתאים HEK293. CMV: cytomegalovirus מקדם, WPRE: וודצ'אק הפטיטיס וירוס תקינה רכיב Posttranscriptional, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: מקדם ספציפי, PylRS: pyrrolysil סינתזת המעביר, &gt; ו- &lt;: כיוון של שעתוק. N B. חדוה-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). ג. הביטוי התשואות של הרצפטין פראי סוג (WT), trastuzumab(CypK)2 כפי שנמדד מערבון כתם לאחר החלבון הוא לטיהור. קווי שגיאה לייצג סטיית התקן של triplicates ביולוגית. דמות זו שונתה באישור Oller-מרווה. et al. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig2.jpg"> איור 2: ההטיה של trastuzumab(CypK)2 עם tetrazine-vcMMAE. א cycloaddition תגובת דילס-אלדר אלקטרון-דרישה הופכי בין השאריות CypK ב הנוגדן הנגזרת tetrazine של MMAE. הקבוצות מגיבים מובלטים באדום, p- aminobenzylalcohol מתואר את dipeptide ולין-citrulline בכחול וירוק. B. HPLC-היק chromatograms מציג את ההתקדמות של הבניין של נוגדן. ג. מידת המרה ביחס דאר המרבי של 1.9 באמצעות ריכוזים ריאגנט שונים. D-אי Deconvoluted ספקטרום המונית של הנוגדן באורך מלא לפני ואחרי הבניין. Trastuzumab(CypK)2 הושג באמצעות שורת תאים יציב. דמות זו שונתה באישור Oller-מרווה. et al. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig3.jpg"> איור 3: ההטיה של trastuzumab(CypK)2 עם tetrazine-טמרה. א cycloaddition תגובת דילס-אלדר אלקטרון-דרישה הופכי בין השאריות CypK ב הנוגדן tetrazine הנגזרת של טמרה. B. מרחביות-דף ג ' לים מציגים את המשמרת ניידות וגם את זריחה בג'ל מקורו הבניין של טמרה. ג. ההטיה קינטיקה בטמפרטורות שונות שני. ד Deconvoluted הספקטרום המונית של trastuzumab(TAMRA)2- Trastuzumab(CypK)2 הושג באמצעות שורת תאים יציב. דמות זו שונתה באישור Oller-מרווה. et al. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig4.jpg"> איור 4: יציבות סרום, cytotoxicity של הרצפטין conjugates. א קריקטורה הדגשת התכונות הרצוי ב- ADC בהטמעת. B. יציבות של trastuzumab(TAMRA)2 בנסיוב אדם כפי שנמדד ב- ELISA. ג תא הכדאיות assay עם trastuzumab(MMAE)2 לאחר 5 ימים בנסיוב אדם (+ סרום, שחור). דגימת הבקרה מודגרות ב- PBS במקום סרום (-סרום, אדום) נכלל באותו וזמינותו. ד תא הכדאיות assay עם דגימות נוגדן טרי מדולל. ה תא הכדאיות assay עם נגזרות MMAE טרי מדולל. קווי שגיאה מייצגים השגיאה הסטנדרטית של הממוצע של 3 ניסויים עצמאית. דמות זו שונתה באישור Oller-מרווה. et al. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

שילוב נגזרת cyclopropene של ליזין נוגדנים מאפשר הצמדה בייעודי לאתר, מהיר ויעיל של מולקולות tetrazine מניבי לייצר נוגדן-סמים conjugates.

קידוד גנטי חומצת אמינו קאנונית לדור של נוגדן תרופתיים Conjugates דרך תגובה מהירה Bioorthogonal

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

שיטה זו מספקת כלי חשוב בתחום שינוי החלבון, ומאפשרת ייצור קל ויעיל של תרופת נוגדנים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם קלות הטיפול, התשואה הגבוהה של ייצור הנוגדנים, מהירות התגובה הפסיכודיזית ויציבות הקשר שנוצר. התחל הליך זה עם גידול תאים תלויים HEK כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כאשר הצפיפות של 2.5 מיליון תאים למיליליטר הוא הגיע, להכין פתרון טרי של נגזרת ציקלופרופן של לי לסין, או CpK, ב 1 נתרן הידרוקסיד טוחן. הוסף 2.5 מיליליטר של CpK לביטוי בינוני בתוספת אנטיביוטיקה. מערבבים היטב את הפתרון ומוסיפים 250 מיקרוליטרים של HCl טוחן אחד, ואז לעקר את הפתרון באמצעות מסנן 22 מיקרון.עכשיו צנטריפוגה 125 מיליון תאים בצפיפות היעד במשך חמש דקות ב 500 x גרם. לאחר הצנטריפוגה, מוסיפים את תערובת ה- DNA-transfection reagent למדיום הביטוי המכיל CpK ולהשתמש במדיום זה כדי לנצל מחדש את התאים. שישה עד שבעה ימים לאחר הוספת CpK, לקצור את trastuzumab נושאת נוגדני CpK מן supernatant על ידי צנטריפוגה התאים במשך 15 דקות ב 3, 000 x גרם.לאחר מכן, סנן את העל-טבעי. עכשיו להוסיף חיץ לשטוף חרוזים 5x ב 250 צינורות חרוט מיליליטר ומערבבים עם supernatant ולהוסיף את החלבון preequilibrated A שדון. מניחים את הצינור חרוט על רולר במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כדי למשוך את הנוגדן ואת supernatant.לאחר הדגירה, מעבירים חלבון שף עם העל-טבעי לעמודה ומאפשרים לנוזל לזרום דרכו. לאחר מכן להוסיף 25 מיליליטר של חיץ לשטוף ולאפשר לזה לזרום דרך. הוסף מיליליטר אחד של חיץ פוספט טוחן אחד, 150 מילימולר נתרן כלורי לצינור האיסוף ולחמק הנוגדן עם ארבעה מיליליטר של 1 נתרן ציטראט ציטראט 3.הפתרון החומצי מנוטרל מיד כפי שהוא יורד מהטור על ידי הפתרון הבסיסי כבר קיים בצינור האיסוף. לאחר מכן, לדלל את הנוגדן עם 10 מיליליטר של PBS. לרכז את הנוגדן ל 5 עד 1 מיליליטר על ידי סינון צנטריפוגלי ולהחליף את החיץ שלוש פעמים עם PBS.לטהר את הדגימות על ידי FPLC באמצעות עמודת אינטראקציה הידרופובית בוטיל עם אפס עד 100% הדרגתי של מאגר מלח נמוך במאגר מלח גבוה מעל 30 דקות. לאסוף את כל השברים ולפקח על האלוטיון ב 280 ננומטר. לרכז את השברים המכילים נוגדנים על ידי סינון צנטריפוגלי ולהחליף את המאגר שלוש פעמים עם PBS.לאחר מכן ניתן לאחסן את הנוגדן בארבע מעלות צלזיוס. מונו-מתיל אורסטטין E, או MMAE, הוא רעיל ביותר. לכן, השתמש בכפפות ומ המשקפיים בעת טיפול בנגזרות MMAE.אם אתה משתמש ב- MMAE שלא שופץ כפקד, טפל במוצר המוצק בתוך מכסה המנוע של האדים בעת הכנת פתרון המלאי ב- MSO. כדי להצטייד בנוגדן עם מולקולת נושאת טטרזין, לדלל 10 שקילות טוחנת של MMAE טטרזין לכל נוגדן עם 20 microliters של אצטוניטריל ו 76 microliters של PBS בצינור חרוט קטן. הוסף שווה ערך טוחן אחד של טרסטוזומפב הנושא CPK.מערבבים היטב ומאפשרים להגיב במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כדי ליצור trastuzumab מקושר MMAE. מולקולות אחרות מלבד MMAE פוטנציאל גדול יותר מעוכב סטרית יותר יכול להיות קשור לנוגדן באמצעות פרוטוקול זה. הוסף את כל עוצמת הקול של התגובה על עמודת הסיבוב ואת הצנטריפוגה ב 1500 x g לדקה אחת.כדי לנתח את ההטיה, יש לצייד את עמודת HPLC HIC במאגר מלח גבוה ב-100% למשך חמש דקות. ואז לערבב 15 microliters של מיליגרם אחד לכל פתרון מיליליטר של trastuzumab מקושר MMAE עם 15 microliters של מאגר מלח גבוה 2X בבקבוקון. הזרק את התערובת לעמודת HPLC.אלוט בזרימה איסטוקרטית של מיליליטר לדקה עם חיץ מלח בגובה 100% למשך דקה אחת. בצע זאת עם שיפוע של 15 דקות מ- 100 עד אפס אחוזים של מאגר מלח גבוה במאגר מלח נמוך. לפקח על האלוטיון ב 280 ננומטר.שלב את הפסגות בכרומטוגרמה עם זמני שמירה של 7.5, 9.2 ו- 11.5 דקות, המתאימים לטרסטוזומפ עם אפס, אחד ושני רעלנים נדנים, בהתאמה. עכשיו, לחשב את DAR על ידי הוספת אזורי הפסגות ב 9.2 דקות, אשר יש משקל של אחד, ו 10.5 דקות, אשר יש משקל של שתיים, ולחלק על ידי השטח הכולל של שלוש הפסגות. כדי לנתח את ההטיה על ידי LC-MS, הראשון, deglycosylate 30 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר ADC ואת הנוגדן ללא שונה בתנאים שאינם מפחיתים באמצעות 250 יחידות של F PNGase לפחות שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס.להפשיר את הנסיוב ולסנן אותו דרך מסנן 22 מיקרון. ואז למלא את בארות חיצוניות של צלחת 96 באר עם מים. בארות המרכזיות, לערבב טריליקט 90 microliters של סרום עם 10 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר trastuzumab tetramethylrhodamine ב PBS בריכוז הסופי של 1 מיליגרם למיליליטר.מניחים את הצלחת באינקובטור רווי לחות ב 37 מעלות צלזיוס וארבעה אחוזים CO2. כל 24 שעות לאורך חמישה ימים, פיפטה כל אחד ביסודיות לערבב ולקחת aliquot חמישה microliter. פלאש להקפיא את aliquot עם חנקן נוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס.לאחר איסוף כל הדגימות, הפשיר את האליקוצים ונתח באמצעות ELISA עקיף, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לחלופין, ניתן להשתמש בערכת ELISA מסחרית למדידת הריכוז של ה- ADC. יומיים לפני ההתרפסות, מלאו את בארות החיצוניות של צלחת 96 בארות במים.לאחר מכן להרים תאים עם 05%טריפסין ב 5 מילימולרי EDTA. צנטריפוגה התאים שלוש דקות ב 250 x g ו resuspend במדיום חדש. ואז זרע 3, 000 תאים ב 100 microliters לגם ב 96 צלחות גם למקם אותם בחזרה לתוך החממה.יומיים לאחר זריעת התאים, הכן דילול סדרתי של כל הדגימות ב- triplicate עם 1%DMSO בגודל בינוני מלא. עכשיו להוסיף 100 microliters של כל מדגם לתוך כל באר דגירה במשך חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס וארבעה אחוזים CO2. ביום החמישי, למדוד את הכדאיות התא.לשם כך, השתמש בערכה מסחרית כדי לריס התאים ולמדוד ATP שוחרר. התווה את אחוז האות ביחס לתאי בקרה שטופלו ב- 1%DMSO. ADCs ניתן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים בסרום והווכח עבור cytotoxicity כדי להוכיח יציבות תפקודית.נוגדן עם ידית ציקלופרופן ניתן להשיג באמצעות הליך זה עם תשואות מעל 20 מיליגרם לליטר לאחר חלבון טיהור. הנוגדן המיוצר יכול להיות במהירות ובאתר במיוחד נדנוד רעלן הנושא טטרזין. עם הטיית הנוגדן עם רעלן, יחס התרופה הממוצע לנוגדנים גדול מ-1.9, כפי שנמדד על ידי כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית.זהותו של ה- ADC מאושרת על ידי ספקטרומטריית מסה. הקשר דיהידרופירידיזן שנוצר הוא יציב בסרום אנושי במשך למעלה מחמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. תרופת הנוגדנים מדביקה היא חזקה והורגת באופן סלקטיבי תאים עם רמות גבוהות של HER2, ולא תאים עם רמות נמוכות של HER2.יתר על כן, הנוגדן ללא הרעלן ואת הרעלן שונה עם מקשר tetrazine יש רעילות נמוכה מאוד. הרעלן לבדו מראה רעילות שאינה תלויה HER2 המדגיש את הצורך של מיקוד כדי להשיג סלקטיביות. בעקבות הליך זה, אנו יכולים להכין במהירות וביעילות תרופות נוגדנים תולים לטיפול בגידולים.באופן פוטנציאלי, כל תרופה מתפקדת עם טטרזין יכול להיות קשור לכל נוגדן מיקוד סמן ביולוגי תא סרטן. ההשלכות של טכניקה זו חלות על כל תותב חלבון המיועד לטיפול או לאבחון.

genetic-encoding-non-canonical-amino-acid-for-generation-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר...

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

סרטון זה מדגים את האינטראקציה ההידרופובית המבוססת על כרומטוגרפיה נוזלית של צימוד נוגדנים-תרופות. באמצעות עמודת כרומטוגרפיה מבוססת ליגנד בוטיל (butyl ligand), הצמידות בין נוגדנים לתרופות מאופיינות באמצעות אינטראקציות הידרופוביות עם הליגנד.

אינטראקציה הידרופובית תלוית בוטיל כרומטוגרפיה נוזלית: טכניקה לאפיון הצמדות נוגדנים-תרופות בהתבסס על אינטראקציות הידרופוביות

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

פרוטוקול ביטוי קל לשימוש ונטול תאים לשילוב ספציפי לשאריות של אנלוגים של חומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים, כולל ניתוח במורד הזרם, מוצג למחקרים רפואיים, פרמצבטיים, מבניים ופונקציונליים.

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להחדרת בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד, ולאחר מכן צימוד האזיד עם בדיקה כימית על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן (SPAAC).

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

ביולוגיה סינתטית מאפשר ההנדסה של חלבונים עם מאפיינים חסרת תקדים באמצעות החדרת חומצות אמינו קאנונית co-translational. . הנה, הצגנו איך spectrally אדום-העביר גרסה של fluorophore GFP-סוג עם מאפייני ספקטרוסקופיות הרומן פלורסצנטיות, הנקרא חלבון פלואורסצנטי "זהב" (GdFP), מופק ב e. coli באמצעות הלחץ הסלקטיבי ההתאגדות (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

כאן, אנו מציגים עבור שיתוף L-dihydroxyphenylalanine biosynthesized מחומרים פשוטים המוצא הגנטי ויישומו חלבון ההטיה פרוטוקול.

התאגדות גנטי של Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) ויישומו ההטיה חלבון

ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה של התרמילים, phenyoxadiazolyl מתיל מבוססי sulfone ריאגנט של הקובץ המצורף באתר סלקטיבית של מטענים תיולים של מולקולות, במיוחד נוגדנים. בנוסף, נתאר את סינתזה ואפיון של chelator bifunctional של תרמילי מניבי, ההטיה שלה נוגדן מודל.

סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

למד שיטה לשינוי ספציפי של נוגדנים באמצעות נגזרת ציקלופרופן של ליזין ליצירת ADCs. הטכניקה מציעה תפוקה גבוהה, יציבות קשרים ויישום בטיפולים ממוקדים בסרטן.

קידוד גנטי חומצת אמינו קאנונית לדור של נוגדן תרופתיים Conjugates דרך תגובה מהירה Bioorthogonal

גלה סרטונים נוספים