קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis
11 בספטמבר 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן כמותי phycobiliprotein בתוכן cyanobacterium Synechocystis באמצעות שיטת spectrophotometric. ההליך החילוץ היה הוחלו בהצלחה גם זנים אחרים כחוליות ואצות; עם זאת, בשל הבדלים ב ספקטרום בליעה פיגמנט, יש צורך לבחון את המשוואות spectrophotometric עבור כל זן בנפרד.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לקבוע כמותית את תכולת חלבוני הפיקובילי במודל ציאנובקטריום סינכוציסטיס בשיטה ספקטרופוטומטרית. חלבוני פיקובילין הם קומפלקסים של חלבוני פיגמנט מסיסים במים המייצגים מרכיבים עיקריים של אנטנות קצירת האור בציאנובקטריה פרוקריוטית ובמספר קבוצות של אצות אוקריוטיות. מאחר שהם קומפלקסים עיקריים לקצירת אור, חלבוני פיקובילין מייצגים את אחד הגורמים המכריעים שקובעים את הפרודוקטיביות של אצות וציאנובקטריה.
Synechocystis הוא מודל של ציאנובקטריום הנמצא בשימוש במאות מעבדות ברחבי העולם. Synechocystis מכיל שני חלבוני פיקובילין, פיקוציאנין ואלופיקוציאנין. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, יעילה ואמינה לקביעה כמותית של שני חלבוני פיקובילין בזן עובש זה.
השווינו מספר שיטות, מיצוי חלבוני פיקובילין וכימות ספקטרופוטומטרי. יש לבדוק את שיטת הכימות עבור כל זן בודד מכיוון שספקטרום ספיגת חלבוני פיקובילין יכול להשתנות בין זנים שונים. בתחילת מיצוי חלבוני הפיקובילין, העבירו מיליליטר אחד של תרבית ציאנובקטריום לצינור נעילה בטוחה.
אם החלטתם לקבוע משקל יבש של הדגימות, שקלו את הצינורות הריקים לפני דגימת התרבות. וודאו כי התרבות אינה משקעת. צנטריפוגה של התאים ב-15,000 גרם בטמפרטורת מעבדה למשך חמש דקות.
השליכו בזהירות את הסופרנטנט. הקפד לא להפריע לגלולה. הכניסו את הדגימות למקפיא.
לאחסון לטווח ארוך, שמור את הדגימות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. זה הכרחי כדי למנוע פירוק חלבוני פיקובילין. לאחר הקפאת הדגימות הכניסו אותן למייבש ההקפאה.
לאחר תחילת הייבוש בהקפאה, בדוק את הטמפרטורה והלחץ על מייבש ההקפאה. הטמפרטורה צריכה להיות מתחת ל-60 מעלות צלזיוס והלחץ צריך להיות בסביבות דונם פסקל. מקפיאים לייבש את הדגימות למשך הלילה.
לאחר סיום מחזור הייבוש בהקפאה, סגור את הצינורות בהקדם האפשרי כדי למנוע ספיגה חוזרת של מים מהאוויר. הוסף ארבעה מחשבים של שני חרוזי זכוכית מיליליטר לכל צינור דגימה. הומוגניזציה של הדגימות עם חרוזי הזכוכית למשך 15 שניות.
דגימה הומוגנית כראוי נפרסת על פני כל המשטח הפנימי של צינורות נעילת הכספת. לאחר הומוגניזציה של תאים, הוסף מיליליטר אחד של מי מלח עם חוצץ פוספט לדגימות על מנת לחלץ את חלבוני הפיקוביל. ה-pH האופטימלי של PBS הוא בסביבות 7.4.
מערבבים את התאים עם ה-PBS למשך חמש שניות על ההומוגנייזר. זה יבטיח ערבוב דגימות אופטימלי למיצוי יעיל של חלבוני פיקובילין. לאחר הערבוב, הדגימות ירקרקות.
שמור את הדגימות על קרח למשך 60 דקות למיצוי חלבוני פיקובילין היעיל ביותר. לאחר המיצוי יש לצנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, לסופרנטנט יש צבע כחול ציאן.
לפני המדידה הספקטרופוטומטרית, כייל את הספקטרופוטומטר באמצעות PBS כריק. לאחר כיול הספקטרופוטומטר, PBS מושלך מספקטרופוטומטר אחד, קובטה ופיפטה את הסופרנטנט עם חלבוני פיקובילין שחולצו במקום המאגר שהושלך. עבור כימות פיקוציאנין ואלופיקוציאנין, הסופרנטנט עם חלבוני פיקובילין שחולצו נמדד ב-615, 652 ו-720 ננומטר.
כפי שמתואר בטקסט, ישנן מספר משוואות לכימות הפיקוביליזומים הידועות בספרות. המשוואה ששימשה בפרוטוקול זה נמצאה כמתאם הטוב ביותר בין ריכוזי פיקוציאנין ואלופיקוציאנין כפיגמנטים ונקודות. שלבים קריטיים של הפרוטוקול הם הומוגניזציה ומיצוי תאים, שאמורים לספק גם תפוקה גבוהה וגם ספציפיות גבוהה.
בדקנו מספר הליכי מיצוי כגון שיבוש תאים על ידי סוניקציה, הומוגניזציה עם חרוזי זירקוניה או קישור תאים קפואים. השיטה מפרוטוקול זה סיפקה את התפוקה הגבוהה ביותר של פיקוביליזומים. מכיוון שאפילו זיהום קטן של תמצית החלבון על ידי כלורופיל יכול להוביל להערכת יתר של תכולת חלבוני פיקובילין, יש להימנע מכל מיצוי כלורופיל מהתאים.
זיהינו כלורופיל בתמצית הגולמית, ואז השתמשנו בסוניקציה לשיבוש תאים. עם מחזורי סוניקציה חוזרים, ריכוז הכלורופיל עלה. זמן ההומוגניזציה עבר אופטימיזציה ל-15 שניות.
הומוגניזציה של חמש שניות ו-20 שניות סיפקה תשואות מעט נמוכות יותר. תוספת של נתרן או אשלגן כלורי למאגר PBS או למים, לא הגדילה את יעילות המיצוי של חלבוני פיקובילין, בדומה למיצוי במאגר נתרן אצטט. זמן מיצוי חלבוני הפיקובילין היה מותאם ל-60 דקות, מכיוון שלאחר 120 ואפילו 240 דקות, ריכוז חלבוני הפיקובילין לא השתנה באופן משמעותי.
ודא שהספיגה ב-615, 652 ו-720 ננומטר מתאימה לטווח הספיגה הקרוב של הספקטרופוטומטר. הספקטרופוטומטר המשמש בפרוטוקול זה מראה את טווח הספיגה הקרוב בין 0.1 לשלוש. השווינו מספר משוואות של כימות חלבוני פיקובילין ספקטרופוטומטריים הידועים מהספרות.
המשוואה של בנט ובוגוראד סיפקה את השחזור הטוב ביותר של תכולת פיקוציאנין ואלופיקוציאנין בתקני הפיגמנט עם ריכוזי חלבון ידועים. ההבדלים בין המשוואות הבודדות קשורים לשינויים במקדמי ההכחדה של חלבוני פיקובילין של האורגניזם הספציפי. השימוש בסטרפטומיצין סולפט לא הוביל להפחתת כלורופיל A בדגימות שבהן סוניקציה יושמה או נמנעה
ממנה.כנתונים מייצגים, קבענו את התוכן של חלבוני פיקובילין בתאי Synechocystis. תכולת חלבוני פיקובילין פחתה תחת אור גובר. הפרוטוקול הוקם כדי למזער את דרישות הזמן והציוד לניתוח הפיגמנט הכתוב שניתן לבצע בכל מעבדה סטנדרטית למדע חי.
כמו כן, הפרוטוקול מכיל שני שלבים נוספים, כגון ייבוש בהקפאה של כדור התא ומיצוי חלבונים. זמן העבודה הכולל לכימות הפיקוביליזומים אינו עולה על שעתיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתווה שיטה לקביעה כמותית של תכולת הפייקובילפרוטאין (phycobiliprotein) בציאנובקטריה מסוג Synechocystis באמצעות ספקטרופוטומטריה. שיטת המיצוי ישימה למגוון זני ציאנובקטריה ואצות, אם כי נדרש בדיקה פרטנית של המשוואות הספקטרופוטומטריות בשל הבדלים בספיגת הפיגמנטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- ביוכימיה
רקע
- פיקובילפרוטאינים הם קומפלקסים חיוניים לקצירת אור בציאנובקטריה ובאצות.
- Synechocystis משמש כאורגניזם מודל במעבדות רבות.
- הבנת תכולת הפייקובילייפרוטאינים חיונית להערכת הפרודוקטיביות באורגניזמים אלו.
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לכימות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול למדידת רמות פיקוביליפרוטאין ב-Synechocystis.
- סיוע בחקר יעילות קליטת האור בציאנובקטריה.
- אספקת שיטה שניתן להתאימה לזנים אחרים של ציאנובקטריה ואצות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- מיצוי פיקובילפרוטאינים מ-Synechocystis.
- יישום טכניקות ספקטרופוטומטריות לצורך כימות.
- בחינה של משוואות ספקטרופוטומטריות עבור זנים שונים.
- השוואת תוצאות בין סוגים שונים של ציאנובקטריה ואצות.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של פיקוציאנין ואלופיקוציאנין ב-Synechocystis.
- הדגמה של ישימות השיטה עבור זנים אחרים.
- הדגשת הצורך בבדיקה פרטנית של המשוואות הספקטרופוטומטריות.
- אספקת פרוטוקול מהימן עבור חוקרים בתחום.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל לקביעת תכולת הפיקוביליפרוטאין.
- ניתן להתאימו למגוון זנים של ציאנובקטריה ואצות.
- הבנת רמות הפיקוביליפרוטאין יכולה להרחיב את הידע על הפרודוקטיביות של אורגניזמים אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
קביעה ספקטרופוטומטרית כמותית של פיקוביליפרוטאינים ב-Synechocystis מאפשרת הערכה סטנדרטית של שכיחות קומפלקס קליטת האור, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקרי פריון פוטוסינתטי. כימות מהימן במאבקי ציאנובקטריה ואצות מהווה בסיס לגילוי מוקדם ולניתוח השוואתי של מסלולים, ומספק מידע לקבלת החלטות לגבי פורטפוליו בביולוגיה סינתטית והנדסה מטבולית. יכולת ההסתגלות של הפרוטוקול ודרישות הציוד המינימליות שלו מקלות על אימוץ נרחב בארגונים עבור צוותי מו"פ המתמקדים באופטימיזציה של פוטוסינתזה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה כמותית של שפע חלבוני קציר האור בציאנובקטריה מודלית.
- תומכת בתיקוף פונקציונלי של התערבויות גנטיות או סביבתיות המשפיעות על רמות הפייקובילפרוטאין.
- מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין תרומות ספציפיות של חלבוני-פיגמנט לפרודוקטיביות.
- מספקת מדד סטנדרטי להשוואות בין זנים שונים ותנאים שונים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות בתהליכי ניתוח פיגמנטים.
- מכין תמציות שעברו תיקוף עבור פלטפורמות של סריקת תרכובות או סריקה גנטית בשלבים הבאים.
- מאפשר הערכה מהירה וניתנת להרחבה של תכולת phycobiliprotein במגוון זנים או תנאים.
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על ידי יישום הפרוטוקול על טקסונים מגוונים של cyanobacteria ואצות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם את כימות הפיגמנטים עם מחקרים תרגומיים על יעילות פוטוסינתטית ותוצר מטבולי.
- שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני בזנים מהונדסים.
- מספק נתונים חזויים לקידום מותאם-סיכון של תוכניות לאופטימיזציה של פוטוסינתזה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול ספקטרופוטומטרי זה משלב בין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח הבדיקה, ומאפשר בדיקת השערות ובניית מדדי ייחוס כמותיים לחלבונים קולטי אור בציאנובקטריה ואצות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך במחקרים מבוססי היפותזה על תפקוד חלבוני-פיגמנט ומודולציה של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות מבוססות בליעה באורכי גל מוגדרים להשוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מאפשר המשכיות בכימות פיגמנטים ממערכות מודל לזנים מהונדסים.
- שימוש חוזר בארגון: מציע פרוטוקול סטנדרטי בעל יישום רחב עבור צוותי מו"פ מגוונים העובדים עם אורגניזמים פוטוסינתטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי נתיבי קליטת אור ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מאפשר כימות פיגמנטים סטנדרטי, הניתן לשחזור ובעל יכולת הרחבה בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go עבור תוכניות להנדסת זנים ואופטימיזציה מטבולית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של אסטרטגיות לשיפור הפוטוסינתזה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוח ספקטרופוטומטרי ובהכנת דגימות.
- נדרשת גישה לצנטריפוגות מעבדה סטנדרטיות, למייבשי קיפאון, להומוגניזטורים ולספקטרופוטומטרים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי המיצוי והמדידה לצורך הדירות (reproducibility).
- חובה לתקף את מקדמי הנימיקה (extinction coefficients) ואת משוואות הכימות עבור כל זן או טקסון הנחקרים.
- ספציפיות המיצוי היא קריטית כדי למנוע זיהום בכלורופיל ולהבטיח כימות מדויק.
