פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי סינתזת חלבון דינמית והפרוטאום המעורב בתהליך. טכניקה זו מאפשרת לזהות את ה-mRNA שנבחרו לתרגום, את המיקרו-רנ"א שיכולים להשתתף בתהליך ולהפריע לתרגום, ואת החלבונים התורמים לתרגום החלבונים או שהם עצמם מתורגמים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תגובות לבביות ללחץ, אך ניתן ליישם אותה גם לחקר תגובות חריפות ללחץ באיברים אחרים.

מי שתדגים את ההליך תהיה מירוסלבה סטסטנה, מדענית הפרויקט מהמעבדה של ג'ניפר ואן אייק. ביום הניסוי, מלאו את התא השמאלי של מערבל שיפוע בחמישה מיליליטר של תמיסת שיפוע סוכרוז של 15%, ומלאו את התא הימני בחמישה מיליליטר של תמיסת שיפוע סוכרוז של 50%. פתח את הברז והפעל את המשאבה כדי לערבב את שני התאים הקטנים בעזרת מערבל מגנטי, והשתמש בצינור המקושר לברז השני כדי לאפשר לתמיסות הסוכרוז המעורבות לזרום לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה יחיד עם קירות דקים על קרח.

לאחר מכן, הומוגניזציה של רקמת הלב הטרייה או הקפואה עם POLYTRON במאגר ליזה מסונן למשך 15 שניות על קרח. בסוף הדגירה, צנטריפוגה את הליזאט כדי להסיר את החומר הבלתי מסיס, ולקצור את הסופרנטנט. הקצו 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט לקביעת חלבון, בידוד רנ"א וניתוח שלמות רנ"א, ושכבה של 100 עד 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט הנותר מעל תמיסת השיפוע.

השתמש במאגר ליזה טרי כדי לאזן את הנפחים בין שני צינורות השיפוע, ואולטרה-צנטריפוגה את הדגימות באולטרה-צנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד. היזהר מאוד לא להפריע לשיפוע הסוכרוז לפני או אחרי הצנטריפוגה. כדי לאסוף את השיפועים, תכנת את אספן השברים להשליך את שלוש הדקות הראשונות של האיסוף ולאסוף את השברים הכבדים, הקלים והלא מתרגמים במהירות של מיליליטר לדקה ב-17 שברים מארבע עד 19 דקות עם ניטור רציף של הספיגה ב-254 ננומטר.

הניחו כל שבר על קרח ברגע שהוא נאסף. לאחר מכן אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס, אם הן לא מעובדות באופן מיידי. כדי לחלץ חלבונים משברי הפוליזום, שלב את שברי הסוכרוז שנאספו לשלושה שברים סופיים, וסמן את השברים ככבדים, קלים ולא מתורגמים.

מערבבים 0.5 מיליליטר מכל דגימה עם 60 מיקרוליטר של 100% חומצה טריכלורואצטית, או TCA. דגרו את השברים למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס בחושך. למחרת בבוקר, הפשירו את הדגימות על קרח לפני שגלגלו את החלבונים על ידי צנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנטים, ושטפו את הכדורים פעמיים עם 0.5 מיליליטר מינוס 20 מעלות צלזיוס אצטון צונן לכל צנטריפוגה. ודא שהגלולה, לאחר משקעי TCA, מומסת לחלוטין, באמצעות סוניקציה דופק כדי להבטיח מסיסות מלאה, לפי הצורך. יבש את הכדורים באוויר לאחר הכביסה האחרונה לפני ההשעיה מחדש ב-360 מיקרוליטר של מאגר Tris-HCl.

לאחר מכן הוסיפו 40 מיקרוליטר דיתיותרייטול לדגירה של 45 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס עם ניעור. בתום הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר של יודואצטמיד לדגימות לדגירה של 30 דקות על השייקר בטמפרטורת החדר, מוגן מאור, ולאחר מכן עיכול הדגימות עם יחס משקל למשקל של 1 ל-50 טריפסין לחלבון לדגירת טלטול לילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לאחר הקירור, צנטריפוגה קצרה של הדגימות, והתאם את ה-pH לשתיים עד שלוש עם 10% חומצה פורמית כדי להרוות את פעילות הטריפסין.

כדי להפיל את הדגימות, תחילה יש לתקן את הספיגה בבארות של צלחת של 96 בארות עם 200 מיקרוליטר מתנול שלוש פעמים, ולאחר מכן מיזוג עם 200 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית לבאר שלוש פעמים. לאחר מכן, טען את הדגימות על כל באר, ושטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית לכל שטיפה. באמצעות כוח הכבידה, ואחריו ואקום נמוך, יש להוציא את הדגימות עם 100 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית ב-50% אצטוניטריל פעמיים לתוך שפופרת אחת של 0.5 מיליליטר עם שימור חלבון נמוך לכל דגימה.

לאחר מכן השתמש ברכז כדי לאדות את הדגימה מתפשטת ליובש, ולבנות מחדש כל כדור פפטיד טריפטי ב-50 עד 100 מיקרוליטר של חומצה פורמית של 0.1% לניתוח ספקטרומטריית מסה. ניתן לבצע ניתוח mRNA כדי להעריך את ההתפלגות של mRNA מסוים מעניין בכל שבר או לכימות והשוואה של שברי התרגום הפוליריבוזומליים המשולבים לשבר הלא מתורגם כיחס של שפע mRNA בכל שבר. לדוגמה, כאן, מוצגים השינויים בהתפלגות ה-mRNA על פני השברים המתרגמים והלא מתרגמים לאחר הכפפת לב העכבר לאיסכמיה או איסכמיה, בהשוואה לטיפול בלב דמה.

בניסוי מייצג זה, ניתוח תת-קבוצה של מיקרו-רנ"א בשברים הכבדים המאוגדים גילה כי 22 מיקרו-רנ"א היו קשורים לפוליזומים במהלך איסכמיה, תשעה היו קשורים במהלך איסכמיה ורפרפוזיה, ושבעה היו משותפים לשני המצבים, מה שמדגים כי הקשר של מיקרו-רנ"א הוא דינמי בתגובה ללחצים של איסכמיה ורפרפוזיה. יתר על כן, רוב החלבונים הריבוזומליים המיטוכונדריאלים זוהו בשבר הקל, ורוב החלבונים הריבוזומליים הציטוזוליים זוהו בדרך כלל הן בשברים הכבדים והן בשברים הקלים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר מאוד עם שיפוע הסוכרוז.

משקעי TCA למיצוי חלבונים משברי פוליזום נבחרו בזרימת העבודה שלנו על סמך היכולת לעבד את השבר בריכוז גבוה של סוכרוז ומספר החלבונים שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק בגלל האתגרים הקשורים לשחזור של שיפוע הסוכרוז. משקעי TCA הם יתרון מכיוון שנדרשים רק נפחים קטנים כדי לזרז את החלבונים, הגלולה נראית בתחתית הצינור, ואין הצטברות של סוכרוז במהלך המשקעים.