Name: במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למד שיטות לבידוד נויטרופילים מדם כלבים ולהדמיית מלכודות חוץ-תאיות NET בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרוטוקול כולל גם כימות של citH3 כסמן ל-NETs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר המקביל מומן על ידי קרן חיה מוריס (D15CA-907). המחקר נתמך על ידי קרנות מן אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, מרכז לבריאות סוסים והמרכז לבריאות בעלי חיים מסייע (2016-24-F). המחברים רוצה להכיר ג'ינה Ng לסיוע שלה עם דמויות ואת נגחי נגוין על הסיוע עם הווידאו.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס (פרוטוקול מס: 18338).
1. דם אוסף
<ol><li>לצייר 10 מ"ל של דם מכל אחת את הווריד cephalic או צוואר באמצעות מחט 21 G על ידי השאיפה מזרק.</li>
	<li>כדי למנוע עודף מאמץ גזירה, הסר את המחט המזרק לפני העברת דם לתוך צינור המכיל הפארין נתרן (75 USP). היפוך בעדינות הצינורות כמה פעמים כדי להבטיח ערבוב נאותה של קרישה והדם. בדיקה של קרישי דם או אגרגטים תא אדום לפני הצבת את הדוגמאות על קרח.</li>
</ol>2. נויטרופילים בידוד
<ol><li>לדלל דם anticoagulated עם אמצעי אחסון שווה תמיסת מלח של Dubecco קר כקרח באגירה פוספט (DPBS) (pH 7.4, בלי קטיונים דו ערכיים). העברה 8 מ של דם מדולל לתוך 50 מ ל פוליפרופילן חרוט צינור המכיל 25 מ של 3% לתוספי (מתוך spp. Leuconostoc המומסים בתמיסה נתרן כלוריד 0.9%). מקם את הצינור זקוף בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאפשר צבירת והצטברות של אריתרוציטים.</li>
	<li>בזהירות שכבה 5 מיליליטר ליקוציט עשיר פלזמה (איור 1) מעל 5 מ של התקשורת הדרגתיות צפיפות צינור עגול-התחתון 14 מ ל פוליפרופילן. יש להיזהר לא לערבב את 2 פתרונות11.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 400 גרם עם האצה/ההאטה (A/D) מוגדר כ- 0 (בלי בלמים) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שימוש של 5 מ"ל pipet סרולוגית לאסוף את שכבת תאים גרנולוציט על-ידי עקיפת פלזמה של שכבות תאי תא (PBMC) דם היקפיים (איור 1). השתמש pipet חדש בכל פעם כדי למזער את הזיהום.</li>
	<li>מקום 4-6 מ"ל של השכבה תא polymorphnuclear (נויטרופיל) צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ. מאז כמות קטנה של כדוריות דם אדומות אגרגטים עשוי להיות aspirated יחד עם השכבה נויטרופיל, להשתמש pipet סרולוגית של 1 מ"ל להסיר בעדינות מצרפי כדוריות דם אדומות אשר התיישבו בחלק התחתון של הצינור.</li>
	<li>Lyse של אריתרוציטים הנותרים עם 20 מ של מים קרים הנדסה גנטית. היפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים במשך 30 עד 60 s כדי להבטיח lysing נאותה לפני הוספת אמצעי שווה של קרח 1.8% נתרן כלורי פתרון.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 112 גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, A/D מוגדר כ- 0.</li>
	<li>חזור על השלב פירוק כדוריות דם אדומות אם גלולה זו נראית אדומה. למחוק את תגובת שיקוע בזהירות עם pipet סרולוגית, בעדינות resuspend בגדר ב 100 µL של DPBS (דקסטרוז 5 מ מ, MgCl מ מ2, CaCl 1.9 מ מ2 ו- 1% אלבומין שור, pH 7.3). לשלב את כל התאים resuspended ומניחים על קרח.</li>
	<li>לבצע ספירת תאים באמצעות מנתח אוטומטית תא ואמת הרוזן על-ידי hemocytometer. במידת הצורך, להתרכז PMNs על זכוכית באמצעות של cytocentrifuge (1,000 סל ד, 5 דקות), לקבוע את אחוזי נויטרופילים על ידי ספירת נויטרופילים מבין המספר הכולל של תאים.</li>
	<li>האילתים של נויטרופילים על-ידי ביצוע מבחן הדרה trypan blue כפי שתואר על ידי. Strober et al. 12 הבידוד מוצלח אמור להניב את הכדאיות של בין 95 ל- 100%, נויטרופילים צריך להיות גדול מ- 95%.</li>
	<li>לקבוע את הריכוז של נויטרופילים על-ידי הכפלת ספירת הכולל עם אחוז הכדאיות ואת אחוז נויטרופילים. הבידוד מוצלח אמור להניב ריכוז של נויטרופילים מ- 1.5 עד 6 x 106/mL.</li>
	<li>לדלל נויטרופילים כדי ריכוז סופי של עונה 1 פרק 106/mL עם DPBS המכיל דקסטרוז 5 מ מ, מ מ MgCl2, 1.9 מ מ CaCl2ו- 1% אלבומין שור עם pH להתאים ל- 7.3.</li>
</ol>3. פלורסנט מיקרוסקופיה של נויטרופילים בשידור חי
<ol><li>במקום 200 עד 400 μL של נויטרופילים (1 x 106/mL) כל טוב של פולי-L-ליזין מצופה צלחת תרבות 12-. טוב. לאפשר נויטרופילים לדבוק בתחתית הבארות מאת המקננת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>תווית חומצות גרעין עם 1 μM של אחד של שני צבעי חומצת גרעין, אחד כי כתמי בתאים עם ממברנות שלם ואחד כתמי בתאים עם חדיר ממברנות (ראה טבלה של חומרים), 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להפעיל נויטרופילים עם μg/mL 100 ליפופוליסכריד (LPS) (e. coli O55. B5), 100 ננומטר phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) לשלוט, או מקביל בנפח DPBS כפקד שלילי עבור 180 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>לרכוש תמונות באמצעות ה-GFP (עירור: 470/22 ננומטר, פליטת: 525/50 ננומטר) וערוצי טקסס אדום (עירור: 585/29 nm, פליטת: 628/32 ננומטר)-מיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית בהגדלה X 40 נקודות בפעם הבאה: 30, 90, 120, 180 דקות.</li>
</ol>4. נטו כימות וזיהוי מרכיבים נטו באמצעות Immunofluorescence
<ol><li>בזהירות המקום 18 מ מ קוטר פולי-D-ליזין מצופה שער גולשת לתוך הבארות של צלחת תרבות 12-. טוב. תווית הבארות כראוי.</li>
	<li>זרעי μL 100-200 של מבודדים נויטרופילים (1 x 106/mL) ישירות על גבי coverslips ולאפשר נויטרופילים לדבוק שער גולשת על ידי המקננת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>הפעל נויטרופילים כמתואר ב- 3.3. לעכב היווצרות רשת על-ידי pretreating נויטרופילים עם 200 µΜ Cl-amidine (15 דקות, 37 ° C) לפני ההפעלה כפי שצוין בעבר שתואר על ידי Li. et al. 13 . ודא כי הפקד רכב מתאים (דימתיל סולפוקסיד) נכלל לניסוי.</li>
	<li>הסר בזהירות את שער גולשת עם מלקחיים משובחים. שכבה גיליון הסרט פרפין מעל דוכן מבחנה כדי ליצור בארות רדודים מקום 2-3 טיפות של 4% מחברים כל טוב10. תווית הבארות כראוי ולהניח בעדינות את שער גולשת במהופך על הבארות מלא מחברים. מאפשרים לתאים יהיה קבוע בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים 3 פעמים ב DPBS במשך 5 דקות, על-ידי הזזתם מבאר אחד למשנהו.</li>
	<li>אם לא ניתן לבצע immunolabelling זמן קצר לאחר הפעלת נויטרופילים, קיבוע, לאפשר שער גולשת להיות אוויר יבש על ידי הנחת את הפנים שער גולשת על פיסת נייר ספיגת. שער גולשת ניתן לאחסן עד 1 בשבוע פנים כלפי מעלה לתוך צלחת עם תוויות ברורות. ובכן 12 תרבות ב 4 ° C עד ניתוח נוסף. לשטוף את התאים 3 פעמים ב- DPBS עבור 1 דקות שימוש באותה השיטה כפי שמתואר 4.4 לפני שתמשיך לשלב הבא.</li>
	<li>כדי permeabilize תאים, בעדינות שכבה בתגית כיסוי במהופך על ירידה של 1% NP-40 דקות 1 בטכניקה המתוארת ב- 4.4. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 1 דקות על כיסא נדנדה.</li>
	<li>באופן אקראי להקצות כל דגימה מספר ולהשתמש היהלום נקודת סמן לתייג את coverslips בהתאם.</li>
	<li>להכין, פטרי בודדים תווית מרופדת עם סרט פרפין ומניחים μL 100-200 של הסרום עיזים 5% על הסרט (חסימת מאגר). שכב על coverslips במהופך על המאגר חסימה. מניחים על כיסא נדנדה, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה.</li>
	<li>לדלל נוגדן ראשוני (1:400 ארנב polyclonal אנטי-citrullinated היסטון H3 (citH3) בנסיוב עיזים 5%). דגירה בתאים שכותרתו צלחות פטרי עם הסרט פרפין. שכבה בכל תגית כיסוי במהופך על 50 ל- 100 μL של הפתרון מדולל נוגדן. מניחים על כיסא נדנדה, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה.</li>
	<li>נוגדנים משניים שתדללו מצומדת fluorophore (1:200) בנסיוב עיזים 5%. דגירה בתאים שכותרתו צלחות פטרי עם הסרט פרפין. שכבה בכל תגית כיסוי במהופך על 50 ל- 100 μL של הפתרון מדולל נוגדן. מניחים על כיסא נדנדה, דגירה h 1 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.</li>
	<li>רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה בחושך.</li>
	<li>גילוי בו-זמניות של myeloperoxidase (MPO) בצע את השלבים שלהלן עבור פרוטוקול ששונה immunolabeling זוגי כפי שתואר על ידי Li. et al. 13
</li>
	<li>דגירה בתאים שכותרתו צלחות פטרי עם הסרט פרפין. שכבה בכל תגית כיסוי במהופך על 100 עד 200 μL של 10% ארנב סרום תחת עדין נדנדה (לילה, 4 ° C, בחושך).</li>
	<li>רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה בחושך.</li>
	<li>דגירה תאים 50 μg/mL unconjugated עז אנטי-ארנב Fab קטעים עבור 2 h בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה בחושך.</li>
	<li>רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה בחושך.</li>
	<li>לדלל נוגדן ראשוני (1:200 ארנב polyclonal נגד MPO נוגדנים) בנסיוב עיזים 5%. דגירה בתאים שכותרתו צלחות פטרי עם הסרט פרפין. שכבה בכל תגית כיסוי במהופך על 50 ל- 100 μL של הפתרון מדולל נוגדן. מניחים על כיסא נדנדה, דגירה h 1 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.</li>
	<li>לדלל נוגדנים משניים מצומדת fluorophore בנסיוב עיזים 5%, דגירה כמתואר ב- 4.8</li>
	<li>רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה בחושך.</li>
	<li>הפרעה פקדים כדאי להיערך על ידי למעט הדגירה עם גם נוגדנים העיקרי בשלב השני labelling החיסון.</li>
	<li>כתם DNA עם 300 nM של 4 אינץ ', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (דאפי) עבור 5 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 1 דקות על כיסא נדנדה בחושך.</li>
	<li>חלה ירידה (~ 50 μl) של mountant antifade על זכוכית. טפח בעדינות על קצה coverslip על נייר סופג כדי להסיר עודפי מאגר לפני שיקימו את coverslip עם תאי במהופך. המדיום הרכבה יוצרות שכבה דקה בין coverslip את השקופית זכוכית. כדי להסיר בועות אוויר, לחץ בעדינות על coverslip עם מלקחיים משובחים.</li>
	<li>אפשר דוגמאות לרפא בן לילה בחושך ב 4 º C. המדיום הרכבה צריך להקשיח לבדיקה מיקרוסקופית עם עדשות טבילה. לאחסן דגימות 4 ° C בחושך.</li>
</ol>5. נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית כמת
<ol><li>לעוור את operator(s) רכישת וניתוח תמונות מיקרוסקופ לתנאים ניסיוני.</li>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה X 40, קח 10 תמונות באופן אקראי מאזורים שונים בכל coverslip בניסוי תחת הערוצים בהתאמה. ודא כי זמן החשיפה, הבהירות והניגודיות של כל ערוץ נשמרים עקביים בכל הרכישה של תמונות.</li>
	<li>לנתח את התמונות באמצעות תוכנת זמינים כגון ImageJ (NIH). לזהות רשתות המבוסס על שיתוף לוקליזציה של cfDNA, citH3 ו- MPO (איור 3 א, ב'). לכמת את מספר רשתות ו נויטרופילים בשדות אקראי 10 עבור כל תנאי הניסוי. המספרים של רשתות שפורסמו ניתן לבטא יחס (מספר רשתות: המספר הכולל של נויטרופילים) עבור כל תנאי הניסוי.</li>
	<li>כדי להעריך את ההשפעות טיפול על הביטוי citH3 תאיים, לספור את מספר נויטרופילים עם citH3 תאיים ומספר נויטרופילים ללא תאיים citH3 בשדות אקראי 10-40 X הגדלה מתחת הערוצים בהתאמה ( איור 3, חצים אדומים). CitH3 תאיים הביטוי ניתן לבטא את היחס שבין מספר נויטרופילים עם תאיים citH3 למספר של נויטרופילים ללא citH3 תאיים.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die%2C+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+Double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142(2016).</li>
<li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151(2012).</li>
<li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis%2C+trauma%2C+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li>
<li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

אנו מציגים כאן פרוטוקול כדי לבחון את השינויים בשחרור קונפורמציה, cfDNA גרעינים נויטרופילים כלבים חיים באמצעות צבע permeant תא והן צבע impermeant תא. היתרון העיקרי של assay הזה הוא שהיא מאפשרת גילוי בזמן אמת של היווצרות נטו על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה בנויטרופילים לחיות בלי קיבוע תא, לכן, מתן כלי יקר ופשוט להבחנה במבחנה היווצרות נטו. מאז assay זו אינה דורשת נוגדנים איתור רכיבים נטו, זה אידיאלי עבור הלומדים NETosis מינים עם זמינות מוגבלת של נוגדנים תלויי מין. שימוש assay הזה, המחברים הראו כי נויטרופילים הכלבי...

הנויטרופילים הם אחראים על הביטחון הראשונית נגד פולשים גורמי מחלה קצרת ימים גרנולוציטים. נויטרופילים, גייס לאתר של זיהום, לחסל מיקרואורגניזמים phagocytosis, degranulation ועל הדור של חמצן תגובתי מינים (ROS)1. בנוכחות חיידקים או endotoxins, נויטרופילים שחרור נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות), המורכבת של כרומטין חוץ-תאית מעוצבים עם שינויים היסטוניים, חלבונים פרטנית כמו elastase myeloperoxidase (MPO)2. למרות רשתות יש מאפיינים מיקרוביאלית הכרחית, הוכחה ניסויית וקלינית גוברת מרמז כי היווצרות נטו נלהב במהלך אלח דם עלול להוביל מספר איברים בתפקוד ומוות3,4, 5 , 6.
כי רשתות עשויים לשחק תפקיד pathophysiological דומה אצל כלבים, התערבויות טיפוליות או למנוע או להפחית את היווצרות נטו עשוי לשמש אסטרטגיות טיפול חדשניים בבעלי חיים ספיגה. מסיבה זו, יש צורך טכניקה אמין להעריך ולכמת NETosis ורכיבים נטו אצל כלבים. רכיבים נטו כולל DNA ללא תא (cfDNA) ו נוקליאוזומים בעבר הוערכו נויטרופילים הכלביים, פלזמה כלבים קליני-7,-8,-9. באמצעות מבחני פלורסצנטיות, Goggs ו- Letendre מצא כי כלבים ספיגה יש רמות גבוהות יותר של cfDNA יותר בריאים הכלבים8. למרות טכניקות אלה הן מאוד אובייקטיביים, כמותיים, מדידה של cfDNA ושל נוקליאוזומים סמנים של NETosis היא לא ספציפית מאז הם הנגזרות תאים עם נמק פרט NETosing נויטרופילים. כאן נתאר טכניקה אשר מנצל פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי לבחון את התנהגויות של נויטרופילים NETosing בשידור חי. אנחנו גם פירוט פרוטוקול ששונתה באמצעות כפול-immunolabeling סובייקטיבי לכמת רשתות ורכיבים שלהם כגון MPO citH3 נויטרופילים הכלבי10.

<table><tbody><tr><td>Dextran מLeuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>משקל מולקולרי 450,000 &ndash; 650,000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s ThermoFisher מלוח חוצץ פוספט</td><td>A1285801 מדעי</td><td></td><td>עם קטיונים דו-ערכיים</td></tr><tr><td>Dulbecco' s ThermoFisher Scientific 14190136 מלוח חוצץ פוספט</td><td></td><td></td><td>ללא קטיונים דו-ערכיים</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX כתום כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 מ"מ ב-DMSO; כתמים בתאים עם ממברנות חדירות</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 מ"מ ב-DMSO; כתמים בתאים עם ממברנות שלמות</td></tr><tr><td>מגברי משטח NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים מצופים פולי-D-ליזין</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>קוטר 12 מ"מ</td></tr><tr><td>נוגדן H3 אנטי-ציטרולין אנטי ציטרולין Abcam</td><td></td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>שברי פאב נגד ארנב עזים לא מצומדים</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>ספציפיות: IgG (H+L)</td></tr> <tr><td>נוגדן נגד מיאלופרוקסידאז</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-דיאמידינו-2-פנילין (DAPI)</td> <td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

בתגובה פתוגנים פולשים, נויטרופילים משחררים מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), אשר הן רשתות חוץ-תאי ה-DNA מעוטרים עם שינויים היסטוניים, חלבונים מיקרוביאלית. היווצרות מופרז נטו (NETosis), citH3 שחרור במהלך אלח דם קשורה בתפקוד איברים מרובים ותמותה בעכברים ובבני אדם אבל השלכותיו אצל כלבים אינם ידועים. במסמך זה, אנו מתארים שיטה לבודד נויטרופילים הכלבי מהדם כל תצפית, כימות של NETosis. ליקוציט עשיר פלזמה, שנוצר על ידי משקעי סחף לתוספי, מופרד באמצעות מדיה ההפרדה הדרגתיות צפיפות זמינים מסחרית ואסף גרנולוציטים עבור תא count ו בדיקות הכדאיות. לצפות NETosis בזמן אמת בנויטרופילים בשידור חי, תא permeant וכתמים impermeant פלורסנט חומצת גרעין התא מתווספים נויטרופילים הופעל על-ידי ליפופוליסכריד (LPS) או 13 12-פעילים phorbol-אצטט (PMA). שינויים מורפולוגיה גרעיני ויצירת רשת שנצפו לאורך זמן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. במבחנה NETosis מאופיין בהמשך co-colocalization של התא ללא ה-DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ו- citrullinated היסטון H3 (citH3) באמצעות פרוטוקול כפול-immunolabelling שונה. כדי לכמת באופן אובייקטיבי נטו היווצרות וביטוי citH3 באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, רשתות, תאים citH3-חיוביות הן לכמת באופן עיוור באמצעות תוכנה הזמינים. טכניקה זו היא assay ספציפיים כדי להעריך במבחנה הקיבולת של נויטרופילים הכלבי לעבור NETosis.

באמצעות פרוטוקול זה הדמיה תא חי, החוקרים ניתן להבחין מורפולוגיה גרעינית, פלזמה הקרומיות ונוכחות של cfDNA ב חי נויטרופילים. צבע גרעיני impermeant תא כתמי חומצות גרעין אדום בתאים עם קרום התא הפגוע. צבע תא-permeant אחר, תוויות חומצות גרעין תאיים בתאים חיים עם ממברנות פלזמה ללא פגע. כל נויטרופילים שלם, ללא קשר טיפולי שלהם, עליו להופיע ירוק, תערוכת גרעינים lobulated האופיינית-0 כדי 30 דקות לאחר גירוי (איור 2 א). הגרעינים של נויטרופילים שטופלו PMA מתחילים לאבד את ה...

אנו מתארים שיטות כדי לבודד את הכלבים נויטרופילים של דם מלא, להמחיש את NET-צורה נויטרופילים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ זריחה. גם המתוארים הם פרוטוקולים לכמת היווצרות נטו, citrullinated היסטון H3 (citH3) ביטוי באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח לגבי מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית או היווצרות NET בכלבים או במינים אחרים. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה כוללים זיהוי חי אמיתי של היווצרות NET וזיהוי רכיבי NET כמו פרוקסידאז קל והיסטון H3 ציטרולין. התחל בהשגת 10 עד 20 מיליליטר דם מווריד הצוואר של תורם כלבים בריא, הוצאת המחט מהמזרק לפני הוצאת הדם לצינורות נתרן הפרין כדי למנוע שיתוף יתר. הפוך בעדינות את הצינורות כמה פעמים כדי להבטיח ערבוב הולם של הדם ונוגד הקרישה, ובדוק אם יש קרישים ואגרגטים של כדוריות אדומות לפני הנחת הדגימות על קרח.לדלל את הדם נוגד הקרישה בנפח שווה של PBS קר כקרח, ולהעביר שמונה מיליליטר של דם מדולל לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן בנפח 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 3% דקסטרן מסונן. הנח את הצינור זקוף למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר צבירה ושקיעה של האריתרוציטים. לאחר מכן שכב בזהירות חמישה מיליליטר פלזמה עשירה בלויקוציטים על גבי חמישה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות בצינור תחתון עגול של פוליפרופילן בנפח 14 מיליליטר.לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, השתמש בפיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר כדי להעביר את שכבת תאי הגרנולוציטים הבינוניים לחרוט של 50 מיליליטר, ולייז כל אריתרוציטים שנשאבים יחד עם התאים הפולימורפו-גרעיניים עם 20 מיליליטר מים קרים וטהורים במיוחד. הפוך בעדינות את הצינור למשך 30 עד 60 שניות כדי להבטיח ליסטרינג הולם לפני שטיפת התאים בנפח שווה של תמיסת נתרן כלורי קרה כקרח 1.8%. לאחר היפוך הצינור מספר פעמים, צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס.השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להסיר בזהירות את הסופרנטנט, והשהה בעדינות את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר תרבית תאים. ספרו ואשרו את הכדאיות שלהם על ידי אי הכללה כחולה של טריפאן. לאחר מכן יש לדלל את הנויטרופילים לאחד כפול עשרה עד שישה תאים למיליליטר של ריכוז מאגר תרבית התאים.חיוני להשתמש בטכניקה סטרילית נכונה ולטפל בנויטרופילים בזהירות לאורך כל תהליך הבידוד מכיוון שכוחות זיהום וגזירה עלולים להוביל לנמק במבחנה וליזיס תאים. כדי לדמות את הנויטרופילים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הוסף 200 עד 400 מיקרוליטר של תאים לכל באר של צלחת תרבית מצופה פולי-ליזין עם 12 בארות למשך 30 דקות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר הנויטרופילים נצמדו לתחתית הבארות, סמנו את התאים בצבע חומצת גרעין פלואורסצנטי מתאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.בתום הדגירה, הפעל את הנויטרופילים עם 100 מיקרוגרם למיליליטר LPS, 100 ננו-מולרי של PMA כבקרה חיובית, או נפח שווה ערך של מאגר תרבית תאים כבקרה שלילית ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן דמיין את תרביות הנויטרופילים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 40 בנקודות הזמן שצוינו. לכימות NET, הנח בזהירות כיסויים מצופים פולי-D-ליזין בקוטר 18 מילימטר לבארות בודדות של צלחת תרבית של 12 בארות וסמן את הבארות בהתאם לגירוי הניסוי.לאחר מכן זרעו 100 עד 200 מיקרוליטר של הנויטרופילים המבודדים ישירות על הכיסויים לדגירה של 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר הנויטרופילים נדבקו לכיסויים, הפעל את הנויטרופילים בכל באר עם LPS, PMA או DPBS למשך 180 דקות כפי שהודגם זה עתה. במהלך 30 הדקות האחרונות של הדגירה, שכבו יריעת סרט פרפין מעל מעמד מבחנה ליצירת בארות רדודות, והוסיפו שתיים עד שלוש טיפות של 4% פרפורמלדהיד לכל באר.סמן את הבארות כמתאימות לניסוי, והשתמש במלקחיים עדינים כדי להעביר בעדינות את החלקות הכיסוי מכל צלחת הפוכה היטב על באר ה-PFA המתאימה המלאה. לאחר 20 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו את התאים הקבועים שלוש פעמים למשך חמש דקות בשתיים עד שלוש טיפות של מי מלח חוצצים בכל שטיפה על ידי העברת התאים מבאר אחת של DPBS לבאר הבאה. כדי לחלחל את התאים, הניחו בעדינות את הכיסויים הפוכים על טיפה של 1% NP-40 למשך דקה אחת ואחריה שלוש שטיפות מי מלח של דקה אחת על נדנדה.לאחר הכביסה האחרונה, הניחו את הכיסויים הפוכים ב-100 עד 200 מיקרוליטר של סרום עיזים 5% בצלחות פטרי עם תווית נפרדת מרופדות בניילון פרפין פלסטיק טרי לדגירה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס עם נדנדה. בתום הדגירה החוסמת, שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במי מלח עם נדנוד כפי שהודגם זה עתה. העבירו את הכיסויים לצלחות פטרי בודדות מרופדות בסרט פרפין מפלסטיק ב-50 עד 100 מיקרוליטר של הנוגדן המתאים המעניין לדגירה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס עם נדנדה.לאחר הכביסה, דגרו את הכיסויים עם הנוגדן המשני המתאים מצומד פלואורופור למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס המוגן מפני אור. בתום הדגירה המשנית של הנוגדנים, יש לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים במי מלח חוצצים בחושך עם נדנוד ואחריו צביעת צבע חומצת גרעין עם DAPI למשך חמש דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שטיפות מי מלח של דקה אחת בחושך עם נדנדה, מרחו טיפה של 50 מיקרוליטר של מדיום הרכבה נגד דהייה על שקופית זכוכית אחת לכל דגימה, והרכיבו בזהירות כל כיסוי מיובש הפוך על טיפה אחת של מדיום הרכבה.לאחר מכן אפשר לדגימות להתרפא למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מאור. למחרת בבוקר, השג 10 תמונות באופן אקראי מאזורים שונים של כל כיסוי בהגדלה של פי 40. כל הנויטרופילים השלמים, ללא קשר לטיפול, צריכים להופיע בירוק ולהציג את הגרעינים האופייניים לאונות באפס עד 30 דקות לאחר הגירוי.בסביבות 90 דקות, גרעיני הנויטרופילים שטופלו ב-PMA מתחילים לאבד את המראה האונות שלהם וממשיכים להתפרק עד לשחרור ה-DNA נטול התאים. LPS, ממריץ איטי ופיזיולוגי יותר של נויטרופילים כלבים, בדרך כלל אינו גורם לעיבוי כרומטין או NETosis עד 90 דקות לאחר הגירוי. לאחר 120 דקות, ניתן לראות נויטרופילים המופעלים על ידי LPS ו-PMA מוקפים ב-DNA נטול תאים.בהשוואה לתאים מגורים על ידי LPS, יותר נויטרופילים המופעלים על ידי PMA מאבדים את שלמות קרום הפלזמה שלהם, כפי שמעידה הצביעה שלהם בצבע תאים. נויטרופילים לא מגורים צריכים לשמור על הגרעינים האונים שלהם ועל ממברנות הפלזמה השלמות שלהם לאורך כל תקופת הדגירה. נויטרופילים המגורים על ידי LPS במשך 180 דקות, מייצרים פיגומי NET דיסקרטיים דמויי רשת בסמיכות לנויטרופילים סמוכים.לעומת זאת, נויטרופילים המופעלים על ידי PMA מייצרים כמויות עצומות של NETs ששטחם גדול יותר באופן ניכר. ואכן, PMA, ממריץ רב עוצמה של אנזים המזרז את רכיב ה-NET החיוני היסטון H3 ציטרולין תוך-תאי, גורם למספר גבוה יותר של תאים המבטאים היסטון H3 ציטרולין תוך תאי בהשוואה לנויטרופילים לא מגורים ומגורים LPS. בעת ביצוע בדיקה זו, חשוב ביותר שהמפעיל הרוכש ומנתח את תמונות המיקרוסקופ יהיה עיוור לתנאי הניסוי כדי לשמור על הערכה אובייקטיבית של הבדיקה.למחצית מההליכים הללו יש את הבדיקות שלהם, כמו ELISA או ציטומטריית זרימה, שניתן לבצע כדי לכמת עוד יותר את היסטון H3 ציטרולין בתאים. אל תשכח לכלול בקרות שליליות המורכבות מניטרופילים לא מגורים או נויטרופילים המטופלים במעכב ארגינין פפטידיל, כרוליד אמידין. אנו ממליצים גם לבדוק דילולים שונים של נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי למזער קשירה והפרעות לא ספציפיות.

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

סרטון זה מדגים את ההשראות וההדמיה של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs בנויטרופילים מסומנים מראש באמצעות נסיוב מטופלים המכיל נוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים. יתר על כן, שימוש בצבע DNA בלתי חדיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה של NETs.

אינדוקציה והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים שסומנו מראש

מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) הן רשתות של DNA, ההיסטונים וחלבונים נויטרופילים. למרות מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, רשתות מעורבות אוטואימוניות פקק. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד נויטרופילים כלבי וכימות של רשתות באמצעות assay קרינת microplate.

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

פרוטוקול זה מתאר assay מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) של תפוקה רגיש מאוד, גבוהה עבור כימות חצי אוטומטיות של ex-vivo נטו היווצרות מאת immunofluorescence קונפוקלית תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות נטו והשפלה אחרי גירויים שונים והוא יכול לשמש כדי ללמוד טיפולים פוטנציאליים, ממוקדות נטו.

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

מלכודות מוכילות (רשתות) הן מבנים תלת-מימדיים שנוצרו על-ידי ממריצים נויטרופילים גרנולוציטים. זה הפך ברור בשנים האחרונות כי רשתות מעורבות במגוון רחב של מחלות. זיהוי רשתות ברקמות עשויות להיות בעלת רלוונטיות אבחונית, ולכן נדרשות פרוטוקולים מתוקננת לתיוג רכיבי NET.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

אנו מתארים את השיטה כדי לזהות השמנות נויטרופילים מסחטות (רשתות) ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע העורקים בעורק העורקי באמצעות החום המושרה אנטיגן ופרוטוקול immunolabeling כפול.

זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

למד שיטות לבידוד נויטרופילים מדם כלבים ולהדמיית מלכודות חוץ-תאיות NET בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרוטוקול כולל גם כימות של citH3 כסמן ל-NETs.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

גלה סרטונים נוספים