בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון איפה תאי גזע זקיק שיניים אנושי יכול להיות מהונדס גנטית כדי לשפר את המאפיינים הטיפוליים שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי גזע יכולים להשתנות על ידי הקדמת microRNA ללא סכנה של שילוב גנום יציב. התחל את ההליך לעיכול אנזימטי של שני זקיק, על ידי התחממות מראש לטמפרטורת החדר, תא גזע זקיק שיניים אנושי או hDFSC תרבות בינונית פתרון PBSPSG.

הפשרו כינוי אחד לכל אחד מפתרונות המניות של קולגנס I ו-Dispase II. הכן פתרון עיכול על ידי הוספת 500 microliters של פתרון מלאי מסוג Collagenase I ו 500 microliters של פתרון מלאי Dispase II ל 4 מיליליטר של מדיום בזל המכיל 1% חומר אנטיביוטי. כדי למנוע זיהום באתר במהלך בידוד תא גזע זקיק אנושי לשטוף מאגרים ותקשורת תרבות בשימוש חייב להכיל סוכנים אנטיביוטיים.

מניחים זקיק שן שחולץ בצלחת פטרי סטרילית. הוסף 10 מיליליטר של פתרון PBSPSG לשטוף את הרקמה שחולצו. שאפו והשליכו את הפתרון והוסיפו פתרון PBSPSG טרי כדי לחזור על הכביסה.

באמצעות אזמל סטרילי טחון זקיק שחולץ לחתיכות אם על 1 על 1 מילימטרים. מעבירים את הרקמה הטחון ואת תטגם PBSPSG מצלחת פטרי לצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מיליליטר, לשטוף את צלחת פטרי עם 10 מיליליטר של פתרון PBSPSG, ולהעביר את הפתרון לתוך אותו צינור. צנטריפוגה הצינור חרוט ב 353 x גרם בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות.

מוסיפים 5 מיליליטר של פתרון עיכול לרקמה המשטחים, מערבבים בעדינות את הפתרון ואת הרקמה, דוגרים את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 באינקובטור רועד במשך שעתיים. לאחר שעתיים, צנטריפוגה התא מתעכל השעיית רקמות ב 353 גרם במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את המשטח המתקבל ב-6 מיליליטר של מדיום תרבות HDFSC.

זרע את ההשעיה התא בבקבוק תרבות תאים 25 ס"מ מרובע, ולהדיגר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר קצירת התא ואפיון HDFSC הוא כמתואר בפרוטוקול הטקסט, hDFSCs זרע בצלחת 24 תרבות תאים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 ו 20% חמצן במשך 24 שעות.

למחרת לדלל 40 picomoles של microRNA ב 66.7 microliters של מדיום סרום מופחת, ומערבולת הפתרון. לדלל 0.67 microliters של השומנים הקטיוני מבוסס, reagent transfection ב 66.7 microliters של מדיום סרום מופחת, מערבולת הפתרון, דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות מוסיפים את המיקרו-רנ"א הטרום-מדולגל לרגנט הטראנס-חלקיקי הקדומה, מערבבים את הפתרון ומטוגים בטמפרטורת החדר במשך רבע שעה.

לאחר מכן, להוסיף את המורכבות transfection מוכן, dropwise, ישירות למדיום התרבות על תאים. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה צלחת 24 תרבות התא היטב קדימה ואחורה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.

24 שעות לאחר transfection, לאסוף את supernatant של דגימות בהתאמה 15 צינורות צנטריפוגה חרוטית מיליליטר בהתאמה. לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של PBS, ולהעביר את PBS לתוך צינור צנטריפוגה בהתאמה. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של טפטפות ו- EDTA לתאים, ו דגירה 24 צלחת גם ב 37 מעלות צלזיוס, במשך 3 דקות.

לעצור את טריפסיניזציה על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום תרבות התא עבור התאים, והעברת הפתרון לתוך צינור צנטריפוגה בהתאמה. צנטריפוגה התאים ב 300 x גרם ו 4 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות. מכאן הלאה לשמור את התאים ואת reagents על קרח אלא אם כן צוין אחרת.

השלך את העל-טבעי, תן שימוש חוזר בתאים ב-100 מיקרוליטרים של מאגר כתמים, והעבר את ת פתרון התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף 0.5 מיליליטר של צבע תגובתי אמין לכל מדגם על מנת להבחין בין תאים חיים ומתים. מערבבים בעדינות את הפתרון, ו דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות.

הוסף 1 מיליליטר של PBS לתאים, וצנטריפוגה ב 300g ו 4 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 100 microliters של PBS, להוסיף 33 microliters של paraformaldehyde, ולערבב את הפתרונות, לאחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור עד זרימה cytometric מדידות. העבר את הדגימות לצינורות המתאימים למדידות ציטומטריות של זרימה, ובצע ציטומטריית זרימה באמצעות אסטרטגיית הגתה המתוארת בפרוטוקול הטקסט. תאי גזע זקיק השיניים האנושיים המבודדים הראו את כל המאפיינים המתוארים להגדרה של תאים סטרומה mesenchymal, תאים היו חסידי פלסטיק והפגינו פיברגלס כמו מורפולוגיה, בתנאי תרבות סטנדרטיים.

ניתוח ציטומטרי זרימה גילה כי hDFSCs ביטא פאנל של אנטיגנים משטח מסוימים, כולל CD29, CD44, CD73, CD90, ו CD105. בעוד CD45 ו-CD117 נעדרו. פוטנציאל ההידול האדיפוגניים, האוסטיאוגניים והכונדרוגניים של תאים בתנאים ספציפיים בתרבות הויטרו אושר על ידי immunostaining, חלבון מחייב חומצת שומן עבור: אוסטאוקלצין ואגגרקן.

אסטרטגיית gating המשמש לכימות של cytotoxicity ו Cy3 שכותרתו יעילות ספיגת microRNA 24 שעות לאחר transfection, ספיגת microRNA אישרה ב 100% של תאים קיימא. כמויות דומות של תאים מתים בדגימות מרוטות ולא פתורות מצביעות על כך שמיקרו-רנ"א מוצג ביעילות ללא השפעות ציטוקסיות. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כגון transdifferentiation יכול להתבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו פלסטיות Cytolab.