Name: Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: למדו איך לבצע אסיי in vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl באמצעות אנזים Mod5 מ-Saccharomyces cerevisiae. השיטה מאפשרת אפיון ביוכימי ישיר של שינויים קוולנטיים ב-RNA וניתנת להתאמה לאנזימי שינוי RNA נוספים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות ד ר דוד Engelke שלו הדרכה והערות מועילות על כתב היד הזה. פיג'מה - אוניברסיטת המדינה של הכדור מעבדה הפעלה כספים; כי אמחה קלות - להעניק 1R15AI130950-01.

הערה: הפרוטוקול הותאם מ הפניה למעורר 24.
1. לקבל RNA ואנזים עניין
<ol><li>השתמש במבחנה עיבד RNAs פנימי עם התווית עם 32P, His6 רקומביננטי-Mod5 לידי ביטוי וטיהרו מ- e. coli, כפי שתואר לעיל24.<ol>
<li>להציג במבחנה עיבד RNAs (סעיף 3) באמצעות T7 RNA פולימראז בנוכחות ATP ללא תווית, זוג שזור, CTP, GTP ו- µCi 10 של ג'ל טהור, זירז אתנול α-ATP, resuspended ב 1 x TE (10 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 0.1 מ מ EDTA), והם מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס 24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלופין, להשיג זמינים מסחרית fluorescently שכותרתו RNAs עניין. לייצר את enzyme(s) של עניין בכל מערכת ביטוי מועדף. התראה: תגים פלורסנט פנימי RNA יכול לשנות מבנה רנ א והכרה על ידי אנזימים.</li>
</ol>2. מכינים לזיהוי של 20% Denaturing ג'ל
הערה: על מנת לקבל מספיק ברזולוציה של קטעים RNA, ג'ל לוח אנכי אורך 40 ס"מ מומלץ. הרוחב של הג'ל משמש נקבעת על ידי מספר דוגמאות כדי להיות מנותח.
<ol><li>ניקוי יסודי צלחות זכוכית. ראשית, לשטוף עם מים וסבון, לשטוף היטב עם מים יונים, ולנקות סוף סוף עם אלכוהול איזופרופיל ומגבונים ללא מוך.</li>
	<li>להרכיב את הצלחות ואת מפרידי.</li>
	<li>לערבב את ריאגנטים הבאים כדי להפוך 100 מ של אקרילאמיד 20%, אוריאה 7.5 מ', ג'ל x TBE 1: 80 מ של שתנן ג'ל להתרכז (237.5 g/L של אקרילאמיד, 12.5 g/L של מתילן bisacrylamide, אוריאה 7.5 מ' במים יונים), 10 מ של שתנן ג'ל diluent (7.5M אוריאה במים יונים) , ו- 10 מ"ל אוריאה ג'ל מאגר (0.89 מ' טריס-בוראט-20 מ מ EDTA מאגר pH 8.3 ו- 7.5 מ' שתנן). הערה: הנפח של ג'ל הפתרון חייב להיות מותאם על פי הממדים של ג'ל.</li>
	<li>להוסיף 40 µL של N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ו- 800 µL של 10% קירור הטרי (APS).</li>
	<li>להכין פתרון ג'ל לתוך מזרק גדול, לדלג בין לוחות זכוכית. הקש על הכוס עם האצבעות בעת המזיגה כדי למנוע היווצרות בועה.</li>
	<li>לאפשר ג'ל שבמהלכו למשך 30 דקות.</li>
	<li>תהדק את ג'ל הקרושה על גבי מכשירים ג'ל אנכית באמצעות קליפים בינדר.</li>
	<li>למלא את מאגר העליון והתחתון צ'יימברס 1 x TBE.</li>
	<li>שעתיים לפני טעינת הג'ל, להפעיל מראש את הג'ל בגיל 20. אימא, 2 h לאפשר את הגבול מאגר לברוח את oligonucleotides הקטן ביותר - אחרת הקטן נוקלאוטידים oligonucleotides נוטים לצמצם בחזית מאגר.</li>
</ol>3. RNA Isopentenylation Assay
<ol><li>להכין בתגובות נפח סופי של 17 µL, המכיל מ 58 טריס-HCl (pH 7.2), 1.2 מ מ ATP, 5.8 מ מ MgCl2, 0.2 מ מ DMAPP, מעכב U של RNase 10 (למשל, SuperRNaseIn), 40,000 CPM מ פנימי 32התווית על-ידי P RNA, מיקרומטר 5.3 Mod5, ו- 1.2 מ מ 2 - mercaptoethanol.</li>
	<li>דגירה תגובות ב 37 ° C עבור 1 h.</li>
	<li>אתנול-התמיסה RNAs שימוש באמצעי אחסון 2.5 (42.5 µL) של 100% אתנול וביו -1/10 כרכים (1.7 µL) של 3.5 מ' סודיום אצטט pH 5.5 והמקום ב-20 ° C 1 h או לילה.</li>
	<li>צנטריפוגה RNA דגימות במשך 20 דקות-15,400 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר RNA עם 500 µL של 70% אתנול.</li>
	<li>הדוגמאות צנטריפוגה-עבור 5 דקות 15,400 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר בזהירות את supernatant ואת air-dry RNA כדורי למשך 15 דקות, או עד כל אתנול התאדו.</li>
	<li>Resuspend RNA כדורי ב 10 µL של אוריאה שמונה מ'.</li>
	<li>להוסיף 150 U RNase T1, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של 6 x טעינת מאגר (60% גליצרול, 0.1% קסילן cyanol).</li>
	<li>לטעון µL 10 של כל מדגם ה-RNA על לזיהוי מבחו, 20%, ג'ל אוריאה 7.5 מ' (ראו סעיף 2 של פרוטוקול). הערה: Radiolabeled RNA גודל סולמות עשוי להיות כלול כמו סמן ניידות נוספות.</li>
	<li>לרוץ ג'ל ח 2-25 מא.</li>
	<li>עוצרים ג'ל, להסיר את המנגנון.</li>
	<li>הפסקה לאטום בין שתי הזכוכיות ולהסיר באחד הלוחות זכוכית, עם הג'ל שנותרו על צלחת "התחתון". הערה: להקפיד כדי לא לקרוע את הג'ל במהלך שלב זה.</li>
	<li>מניחים שכבה של ניילון נצמד על הג'ל לחשוף על מסך זרחן על ה 3 לחלופין, במקום ג'ל על נייר כרומטוגרפיה, יבש עם ג'ל מייבש לפני חשיפה מסך זרחן.</li>
	<li>תמונת המסך זרחן על imager זרחן.</li>
</ol>

<ol><li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li>
<li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li>
<li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+modification+of+transfer+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li>
<li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li>
<li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li>
<li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li>
<li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li>
<li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li>
<li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+MOD5%2C+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li>
<li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li>
<li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li>
<li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li>
<li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+%28TRIT1%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutations%22%5BJournal%5D)">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li>
<li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424(2014).</li>
<li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li>
<li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3%27+untranslated+region+of+TRIT1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009(2015).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1%2C+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients%27+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li>
<li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li>
<li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+tRNA-modifying+protein%2C+TRIT1%2C+forms+amyloid+fibers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23716598">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li>
<li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li>
<li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li>
<li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N%281%29-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+reveals+a+conserved%2C+widespread%2C+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li>
<li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053(2011).</li>
<li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li>
</ol>

לא לחשוף.

שינויים RNA להמשיך להציג את ממלאים תפקידים מגוונים וחשובים יותר בתפקוד הסלולר, organismal. ככזה, הפיתוח של מבחני לחקור RNA שינוי אנזימים הוא מרכזי כדי להבין טוב יותר את ההיבטים הבסיסיים של הביולוגיה. פרוטוקול זה מתאר assay ברזולוציה גבוהה במבחנה כדי לאפיין את פעילות שינוי tRNA Mod5.
פרוטוקול זה יש יתרון מובהק של מתן readout isopentenylation ישירה, interpretable בקלות. הפרוטוקול המתואר מאפשר חזקים איפיון ביוכימי של isopentenyl transferases. יתר על כן, מערכת זו יכולה לשמש עם גרסאות או ש...

163. לפחות שינויים ברורים posttranscriptional RNA זוהו, עם שינויים אלה היוועצות פונקציות מגוונות and תלויי-ההקשר RNAs ישירות המשפיעים על מבנה רנ א, המשפיעים על האינטראקציות של RNA עם השני מולקולות1,2. הערכה ממגוון גדול של RNA שינויים גודלת, חיוני לפתח מבחני זה שניתן לחקור בצורה אמינה את השינויים RNA והן האנזימים לעודד אותם.
אחד השינויים RNA הראשון להיות מזוהה מתרחשת 37 בסיס ב- tRNAs, סמוך codon אנטי-3' צד3,4. קבוצת isopentenyl של dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) מועבר המיקום N6 של אדנוזין 37 (אני6A37) 3,5 ב תת-קבוצה של tRNAs cytoplasmic והן מיטוכונדריאלי. אני6A37 משפר את דיוק התרגום ועל יעילות על ידי הגדלת אהדה של tRNA ריבוזום4,6 ו אני6A37 חשוב לתגובת הלחץ בחיידקים7. האנזימים לבצע שינוי זה מכונים tRNA isopentenyl transferases, מאוד נשמרים חיידקים8,9, פטריות10, תולעים11, צמחים12ו גבוה פרוקריוטים13 , כולל בני14.
מוטציות בגן האנושי tRNA isopentenyl טרנספראז, TRIT1, קשורים עם מחלות אנושיות. לדוגמה, מוטציה בגן TRIT1 הוא מתואם עם מחלה מיטוכונדרית קשה, ככל הנראה נגרם על-ידי פגם חלבון מיטוכונדריאלי סינתזה15,16. יתר על כן, TRIT1 מתוארת כ הגידול משתיק קול ג'ין17,18 , הייתה שם מספר סוגי סרטן כולל מלנומה19, השד20, קיבה21וסרטן ריאות22 ,23. לבסוף, TRIT1, Mod5 transferases isopentenyl (האפייה) הם חלבונים צבירת נוטה היוצרים סיבי עמילואיד פריון דמוי24,25,26. תצפיות אלה שעלולים לסבך tRNA transferases isopentenyl מחלות ניווניות, למרות עדות ישירה לכך עדיין לא הוכח.
בהתחשב בתפקיד isopentenyl transferases לשחק ב תרגום ומחלות, שיטות ישירות למדוד לי6פעילות isopentenyl טרנספראז חשובות להבנה מכניסטית של אנזימים תחת נורמלי ועם מצבי מחלה אלה. מספר גדל והולך של שיטות זמינות לזהות אני6א RNA שינויים, כולל במבחנה isopentenylation מבחני, הכלאה חיובי בהעדר אני6מבחני (PHA6), דק שכבה כרומטוגרפיה (TLC), חומצת אמינו מבחני קבלה פעילות, גישות ספקטרומטר מסה (אירוע של יום שלם הפניה למעורר 4).
וזמינותו isopentenylation במבחנה תואר אשר מנצל 14C-DMAPP ו- tRNAs ללא תווית. ב הזה assay, פחמן רדיואקטיבי מועבר RNA מ 14C-DMAPP על ידי טרנספראז isopentenyl. בעוד assay זו היא רגישה מאוד, לעתים קרובות קשה לקבוע שאריות ספציפי זה שונה9,20,27. מבחני PHA6 להסתמך על מגושם אני6א שינוי המפריעים הכלאה של 32התווית על-ידי P החללית פורש את שאריות ששונה. ככזה, הכלאה גדול בהיעדר תמונה628,18,שינוי29. מבחני PHA6 הם רגישים, יכולת ניתוח הכולל RNA מופק lysates הסלולר. בנוסף, היכולת לעצב הגששים ספציפי הרנ א עניין נותן גמישות יעד משמעותי בשיטה זו. עם זאת, מבחני PHA6 מוגבלות אפיון שינויים העשויים להתרחש על שאריות בתוך אזור ממוקד של המכשיר, ולכן סביר פחות לזהות שינוי הרומן אתרים. בנוסף, כמו היעדר איגוד מעידה על השינוי, שינויים או מוטציות המשפיעות על ה-RNA מחייב אחרים וחיסול ניתוח נתונים.
גישה אחרת משלב בנזיל DEAE תאית (BD) תאית כרומטוגרפיה עם חומצת אמינו פעילות קבלה כמו readout אני6א שינויים ב- tRNA30. גישה זו assays ישירות את הפונקציה של i השינוי6א, אבל זה היא גישה עקיפה כדי לזהות אני6א שינוי ושל חסר רזולוציה למפות שינויים משקע ספציפי ב- RNA. בגישה TLC שימש כדי לזהות tRNA סה כ אני6א שינויים. בגישה זו, באופן פנימי 32tRNAs התווית על-ידי P מתעכלים כדי נוקלאוטידים בודדים, ניתוח TLC מימדי משמש לזיהוי isopentenylation. גישה זו היא רגישה מאוד באיתור סה כ אני6א במדגם RNA נתון אבל על העיכול, כל רצף מידע אובד; לפיכך, החוקר אין שום דרך לקבוע אילו שאריות היה שונה31.
לאחרונה, ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) פותחו שיטות המשווים באופן כמותי הכולל שינויים RNA בין המינים, סוגי תאים תנאים ניסיוני32,33, 34. מגבלה של מתודולוגיה זו הוא כי הוא פחות מסוגל לקבוע זהותו ואת מיקום בתוך RNA שממנו היה nucleoside ששונה נגזר34. יתר על כן, הידע, הציוד הנדרש לביצוע ניסויים אלה מגבילות את המעשיות של גישה זו.
בנוסף, פותחו מספר טכנולוגיות הדור הבא רצפי למפות RNA שינויים transcriptome ברוחב34. Immunoprecipitation של RNAs עם נוגדנים ספציפיים שינוי מסוים (RIP-Seq) מאפשרים החוקר לזהות כל רצפי המכילה35,שינוי מסוים36. בנוסף, גישות רוורס טרנסקריפטאז כגון כימיה-Seq ורצף אי-התאמה שאינן אקראיות להסתמך על לפליטת התגובה שעתוק במהופך38,37,שאריות ששונה39. למרות היתרון של טכניקות אלה כדי למפות RNA שינויים transcriptome רחב, RIP-seq וטכנולוגיות כימית-Seq מוגבלים על ידי חוסר של נוגדנים אמין או זמין עבור כל שינוי מסוים, בהתאמה34תגובתי כימיקלים. יתר על כן, רוורס טרנסקריפטאז אנזימים הדרושים לביצוע כימית-Seq, אי התאמה שאינן אקראיות רצף טכניקות יכול להיות מובן מבנים RNA יציבה. הטבע ששונה מאוד ויציב מבחינה מבנית של tRNAs תגרום להם קשה במיוחד לחקור שיטות אלה. עד כה, טכנולוגיות מבוססות-רצף של הדור הבא שלא טרם נוצלו למפות אני6שינויים34.
במסמך זה, אנו מתארים גישה פשוטה וישירה כדי לזהות אני6א tRNA שינויים בתוך חוץ גופית. שיטה זו משתמשת דגירה של RNAs עם רקומביננטי cerevisiae ס isopentenyl טרנספראז (Mod5), ואחריו RNase T1 לעיכול, חד-מימדי ג'ל אלקטרופורזה ניתוח כדי למפות אני6א שינויים. גישה זו הוא ישיר ואינה דורשת מומחיות ייחודית קצת כדי לנתח את הנתונים. יתר על כן, שיטה זו ניתנת להתאמה אחרים RNA שינוי אנזימים, כולל אנזימים covalently לשנות את המשקל המולקולרי של RNA או הניידות של RNA באמצעות ג'ל.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרכיז אוריאה-ג'ל</td> National <td>Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>כחלק מערכה</td></tr><tr><td>UreaGel</td><td>Diluent National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>כחלק מערכה</td></tr><tr><td>UreaGel Buffer</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>כחלק מערכה</td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>כחלק מערכה</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34369-07-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>DMAPP</td><td>Caymen Chemical</td><td>1186-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Super RNaseIN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>קסילן ציאנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד ואספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות זכוכית קצרות (20-40 ס"מ רוחב x 40 ס"מ L)</td> חברת <td></td><td></td><td>הג'ל</td></tr><tr><td>לוחות זכוכית ארוכים (20-40 ס"מ רוחב x 40 ס"מ L)</td> חברת <td>הג'ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנגנון ג'ל אנכי</td><td>The Gel Company</td><td>S2-3040</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל מזרק חד פעמי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-377-26</td><td></td></tr><tr><td>קליפס קלסר נירוסטה</td><td>Idea Scientific</td><td>1066</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoscreen</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>ניילון נצמד</td> <td>(מכולת מקומית)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assay ב vitro לגילוי פעילות טרנספראז trna-isopentenyl

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6- isopentenyladenosine RNA שינויים הינם מגוונים באופן פונקציונלי מאוד שנשמרת בין אאוקריוטים פרוקריוטים. אחד השינויים שנשמרת ביותר של - isopentenyladenosine6N מתרחשת במיקום A37 בקבוצת משנה של tRNAs. שינוי זה משפר את יעילות התרגום ונאמנות על ידי הגדלת את הקרבה של tRNA הריבוזום. מוטציה של אנזימים האחראים את השינוי בפרוקריוטים משויכות מספר מצבי מחלה, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי וסרטן. לכן, הבנת את המצע ירידה לפרטים ופעילויות הביוכימי של אנזימים אלה חשוב להבנה של ביולוגיה האיקריוטים נורמלי, פיפטות. כבר מועסקים מערך מגוון של שיטות לאפיון אני6א שינויים. בזאת הוא תיאר גישה ישירה של איתור isopentenylation על ידי Mod5. שיטה זו משתמשת דגירה של RNAs עם טרנספראז isopentenyl רקומביננטי, ואחריו RNase T1 עיכול, וניתוח חד-מימדי ג'ל אלקטרופורזה לזהות אני6א שינויים. בנוסף, נדון על הסתגלות פוטנציאלי של הפרוטוקול לאפיין אנזימים אחרים שינוי RNA.

Mod5, נדגרה עם טירוזין tRNA או סרין tRNA, נוכחות או היעדרות של DMAPP. בעקבות התגובה השינוי, מוצרים היית RNase T1-מעוכלים, אשר cleaves 3' סוף כל guanosines עוזב בגודל 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (איור 1). עיכול מלא של RNAs מפיק דפוס צפוי של שברי radiolabeled (איור 2א), ואז אתה נחוש לזיהוי 20% denaturing ג'ל. ההעברה של קבוצת isopentenyl מ- DMAPP ל הרנ א גורם משמרת ניידות של המקטע המכ...

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לאפיין ביוכימית tRNA-Isopentenyl Transferase פעילות במבחנה. שיטה זו שימושית עבור זיהוי ואפיון במבחנה של פעילות tRNA-isopentenyl transferase של אנזימים רקומביננטיים מטוהרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה חקירה פשוטה וישירה המשמשת לגילוי שינוי RNA קווולנטי.למרות שיטה זו מספקת תובנה לפעילות tRNA-isopentenyl transferase, זה פוטנציאל הסתגלות לאפיון ביוכימי של מגוון רחב או RNA שינוי אנזימים. הצעד הראשון בהליך זה הוא לנקות ביסודיות את צלחות הזכוכית שישמשו ליציקת הג'ל. לשטוף את הצלחות עם מים וסבון, לשטוף היטב עם מים deionized, ולאחר מכן לנקות את הצלחות עם isopropanol ומגבונים ללא מוך.לאחר מכן, להרכיב את הצלחות ואת הרווחים. מערבבים את הבאים reagents לעשות 100 מיליליטר 20%אקרילאמיד, 7.5 אוריאה טוחנת, 1x ג'ל TBE. 80 מיליליטר של תרכיז ג'ל אוריאה, 10 מיליליטר של דילואנט ג'ל אוריאה, ו -10 מיליליטר של חיץ ג'ל אוריאה.הוסיפו לתערובת 40 מיקרוליטרים של T-med ו-800 מיקרוליטרים של 10%אמוניום. משוך את פתרון הג'ל למזרק גדול וחלוק את ת פתרון הג'ל בין צלחות הזכוכית הקשה על הזכוכית תוך חלוקת הפתרון למניעת היווצרות בועה. אפשרו לג'ל להתגבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר הג'ל התגבש, לשתול את הג'ל על מנגנון ג'ל אנכי. מלא את תאי המאגר העליונים והתחתון ב- TBE אחד. שעתיים לפנ

an-in-vitro-assay-to-detect-trna-isopentenyl-transferase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט...

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

הדו"ח הנוכחי מתאר בדיקה אנזימטית במבחנה למדידת פעילות פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז באמצעות תמציות תאי לישמניה. בדיקה זו מבוססת על העברה של קבוצת מתיל רדיואקטיבית מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine על פוספטידיל-אתנולמין אנדוגני.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול לבחינה תפקודית של שעתוק ופעילות מעכבת של חומרים אנטיבקטריאליים המכוונים לשעתוק חיידקים.

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג 'ל agarose פיגור.

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את התקנת תרגום mRNA ב-poxvirus תאים נגועים באמצעות מבחנה מבוסס RNA המבוסס לוציפראז כתבת הכתב. ניתן להשתמש באותו שיטת לימוד בקרת תרגום על ידי cis-אלמנטס של mrna, כולל 5 '-אזור בלתי מתורגם (utr) ו-3 '-utr. ניתן גם לבדוק מצבי שונה של ייזום תרגום באמצעות שיטה זו.

ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

למדו איך לבצע אסיי in vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl באמצעות אנזים Mod5 מ-Saccharomyces cerevisiae. השיטה מאפשרת אפיון ביוכימי ישיר של שינויים קוולנטיים ב-RNA וניתנת להתאמה לאנזימי שינוי RNA נוספים.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

גלה סרטונים נוספים