אפיון פונקציונלי Carboxylesterases הבית בקוטלי חרקים עמידים בזבובים, דומסטיקה זבוב

שיטה זו יכולה לעזור לשאלות המפתח בתחום הטוקסיקולוגיה של חרקים, כגון, אם כולם מבטאים את הגנים לניקוי רעלים מטבוליים מעורבים בעמידות לקוטלי חרקים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לייצר קשקשים גדולים יותר של חלבונים, ולאפיין את תפקודם של חלבונים אלה בחילוף חומרים של קוטלי חרקים במבחנה. מי שידגים את הנהלים, יהיה שואה-צ'ון פנג, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי.

מחקר הדוקטורט של Xuechen מתמקד באפיון התפקוד של קרבוקסיל אסטראז בעמידות לטפילים של זבובי בית, Musca domestica. כדי להתחיל, ערבבו מיקרוליטר אחד של DNA פלזמה כניסה של GFP, עם חמישה מיקרוליטרים של DNA ליניארי לטווח C זמין מסחרית בצינורות PCR של 250 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של תערובת רקומבינציה למבדה זמינה מסחרית לכל אחד מצינורות ה-PCR.

מערבבים בעדינות את הצינורות, ומדגרים אותם בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה. זרע שני מיליליטר של תרבית תאים SF9 של חרקים צמיחת לוג באופן שווה לבארות של צלחת תרבית תאים. לאחר מכן אפשר לתאים להיצמד לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר, במכסה המנוע.

בעזרת מיקרוסקופ פאזה הפוך ב-250x, בדוק את חיבור התא. לאחר מכן, הסר את מדיום תרבית התאים, והחלף אותו בשני מיליליטר של מדיום החרקים של גרייס. לאחר מכן, הכינו פתרונות תערובת טרנספקציה A ו-B על פי פרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן מערבבים בעדינות תערובות טרנספקציה A ו-B יחד על ידי הקשה על הצינורות. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר, במכסה המנוע, למשך 35 דקות. לאחר מכן, מוסיפים את התערובת בצורה טיפתית, על התאים הזרעים.

אטמו את הבארות בנייר דבק, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס, למשך הלילה. החלף את שני המיליליטר של מדיום החרקים של גרייס, בשני מיליליטר של מדיום גידול שלם. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרומול גנציקלוביר, לכל באר.

אוטמים את הבארות בנייר דבק, ודוגרים על התאים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. 72 שעות לאחר ההדבקה, אוספים את המדיום מכל באר ומעבירים אותו לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות ב-1500 כפול G, למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הוסף מיליליטר אחד של מצע גידול שלם לבאר, והשתמש במיקרוסקופ עם אור פלורסנט, כדי לצפות בסימני הזיהום של תאים בשלב הגברת נגיף הבקולו-וירוס P1. העבירו את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגות חדשים של 1.5 מיליליטר, ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס, בתנאים חשוכים. לאחר מכן, זרעו שני מיליליטר של תרבית תאי חרקים SF9 לגידול שלב לוג, באופן שווה, בבארות של צלחת תרבית תאים.

אפשר לתאים להיצמד לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר, במכסה המנוע. חסנו חמישה מיקרוליטרים של מלאי נגיף P1 לבארות הזרעים בתאים, ולאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרומול גנציקלוביר לכל באר. אטמו את הבארות, ודגרו על התאים למשך 72 שעות בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס.

ראשית, תרבית חמישה מיליליטר של תאי חרקים SF9 לגידול שלב לוג, עם מצע גידול מלא, בצלוחיות T25 לא מטופלות. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של נגיף P1 כדי להדביק את תרבית התאים, למשך 48 שעות, בניעור עדין, בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. בעזרת אצטוניטריל, הכינו דילולים סדרתיים של 100 מילימול פרמטרין.

לאחר מכן, זרעו 200 מיקרוליטר של תרבית תאים נגועה בתוספת 300 מיקרוליטר של מצע גידול שלם, לצלחת של 24 בארות. לוודא שהפרמתרין מומס במלואו באצטוניטריל, ומועבר באופן שווה לכל באר בצלחת. לאחר הוספת הפרמתרין, יש לנער בעדינות את הצלחת כדי לערבב את הפרמתרין במלואו במדיום.

לאחר מכן, אטמו את הצלחת בסרט, ודגרו את הצלחת בחום של 27 מעלות צלזיוס, למשך 48 שעות, בתנאים חשוכים. הסר את מדיום תרבית התאים מהצלחת מבלי להפריע לשכבת התא המחוברת התחתונה. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב MMT לכל באר.

לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות, עד שנוצרים משקעי פורמאזאן סגולים כהים בכל באר. הוסף 500 מיקרוליטר DMSO לכל באר, כדי להמיס לחלוטין את המשקעים. לאחר מכן העבירו 200 מיקרוליטר מהתמיסה המומסת, לכל באר של צלחת 96 באר.

המסה מלאה של המשקעים ל-DMSO היא קריטית לדיוק התוצאות. לאחר הוספת ה-DMSO לדגימות בצלחת, הדגימות יישטפו באמצעות הפיפטה, מספר פעמים, עד שהמשקעים יתמוססו במלואם. לבסוף, השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את ערכי הספיגה של הצלחת ב-540 ננומטר.

בשלב P1, יחס ההדבקה נמוך. בשלב ה-P2, יחס ההדבקה השתפר משמעותית. בשלב ההדבקה ב-P3, כמעט כל התאים הראו תסמינים של ניתוק מלוחית תרבית התאים, עלייה בקוטר התא, כמו גם הפסקת צמיחת התאים.

בהתבסס על ערכי הספיגה שזוהו, תאי הביטוי Md alpha E7 הראו כדאיות גבוהה משמעותית, בהשוואה לתאי הביקורת CAT. בזמן ביצוע הליך זה, חשוב למנוע זיהום תאים בכל השלבים, על ידי ניגוב פני השטח של חומרים, כגון בקבוקים וצינורות, עם 70 אחוז אתנול לפני ביצוע הניסויים בתאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע כמה שיטות אחרות, כמו מידול הומולוגיה וניתוח אפל, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו האינטראקציות בין חלבון קרבוקסיל אסטראז לליגנד פרמתרין.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בטוקסיקולוגיה של חרקים, לחקור את האפיון התפקודי של הגנים והמנגנונים בעמידות לקוטלי חרקים של חרקים. אל תשכח שעבודה עם קוטלי חרקים עלולה להזיק מאוד, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון כפפות ומעילי מעבדה, בעת ביצוע הליכים אלה.