הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1^{- / -}

במהלך זיהום וירוס זיקה, תאי T יכולים לחדור איברים immunoprivileged לחיסול וירוס אבל עשוי גם לתרום immunopathogenesis, כגון תסמונת Guillain-Barre או אשכים פציעה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מקלה על גילוי מבוסס טטרמר של תאי T ספציפיים לאנטיגן באיברים חיסוניים, הן במהלך זיהום נגיף זיקה והן לאחר חיסון החיסון. במודל זה, זיהום וירוס זיקה הוא יזם בעכברי נוקאאוט קולטן אלפא / בטא אינטרפרון, המאפשר מעקב אחר תאי T ספציפיים וירוס זיקה במוח, האשכים, הטחול.

באמצעות גישת הכתמת טטרמר, ניתן לחקור רק מאפיינים של איבר immunoprivileged חדירת תאי T ספציפיים וירוס זיקה לחקור תרומות תאי T לתאים אימונו-פרוטקציוניים ואימונופתוגניים. עבור זיהום וירוס זיקה, לספק פעם אחת 10 לארבע יחידות המיקוד להרכיב של וירוס זיקה ב 100 microliters של PBS באמצעות חיסון רטרו-מסלולית לתוך שישה עד שמונה שבועות בן אינטרפרון אלפא / קולטן בטא נוקאאוט עכברים. לאחר מכן, לפקח על המשקל ואת הסימנים הקליניים של בעלי החיים הנגועים מדי יום במשך 15 ימים.

שבעה ימים לאחר החיסון, לאבטח את החיה הנגועה בתמונת supine על קצף כירורגי, ולהשתמש אזמל סטרילי לעשות חתך בעור לאורך קו האמצע של הבטן. השתמש מספריים כדי לפתוח את שרירי הבטן, בעדינות לחלץ את הכבד. לאחר מכן, להסיר את הטחול, ולשטוף את הרקמה שלוש פעמים PBS כדי להסיר את הדם.

לאחר הכביסה האחרונה, מניחים את הטחול על 1.5 מיליליטר של מדיום RPMI קר כקרח על הקרח עד שכל הטחול נאסף. כדי ליצור מתלה חד-תאי, הנח את הטחול לתוך מסננת תאי רשת סטרילית של 40 מיקרומטר על גבי צינור של 50 מיליליטר, והוסף שני מיליליטר של מדיום RPMI קר כקרח בתוספת סרום בקר עוברי של 10%, או FBS, למאמץ. לאחר מכן, השתמש בוכנה של מזרק חמישה מיליליטר כדי macerate את הרקמה דרך המסנן, באמצעות מדיום טרי כדי לשטוף את התאים ששוחררו דרך רשת.

העבר את ההשעיה של תא יחיד לצינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה, ו resuspend גלולה בחמישה מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום. לאחר חמש עד שש דקות בטמפרטורת החדר, לעצור את תמוגה עם 10 מיליליטר של RPMI קר כקרח בתוספת FBS עבור צנטריפוגה שנייה, ו resuspend את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום מלא לספירה. שבעה ימים לאחר החיסון, לשתק המתת דם, נגוע, עכבר זכר במצב נוטה על קרש חיתוך, ולאבטח את הקרקפת עם מטלחים ישרים אחד על שתי שיניים.

השתמש מספריים איריס לעשות חתך קו האמצע על הקרקפת, חשיפת הגולגולת, ולהשתמש פינצטה חדה כדי להדק את שני הצדדים של המסלולים עם פינצטה חדה, תיקון המוח. הצבת קצה אחד של מספריים איריס חדים לתוך מגנום foramen, לחתוך באופן צדדי לתוך הגולגולת בכל צד. בזהירות לחתוך מאותו חלל במעלה קו האמצע, לכיוון האף, שמירה על טיפים מספריים שטחי ככל האפשר, כדי למנוע פגיעה במוח.

הרם את המוח עם מטלפים, ולהשתמש מספריים איריס חדה לנתח בזהירות את סיבי העצב הגולגולתי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להעביר את המוח לצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של RPMI קר כקרח בתוספת FBS. כדי לבודד את האשכים, להרים את עור הבטן עם מ forceps, ולהשתמש מספריים איריס לעשות חתך אורך דרך ההשתנכלות ואת דופן הבטן ולחשוף את החלק התחתון ביותר של הבטן.

לדחוף את האשכים עד החתך, ולהשתמש פינצטה כדי למשוך בעדינות את שכבת השומן, כדי לחשוף אשכים כדוריים משני הצדדים. השתמש במספריים הקשתית כדי לנתח בזהירות את שכבת השומן ואת האפידימיס, ולהעביר את האשכים לצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של RPMI קר כקרח בתוספת FBS. כדי ליצור השעיה של תא יחיד מכל אחת מהרקמות שנקטפו, מניחים את האיבר על מסננת תאים סטריליים עם רשת של 100 מיקרון על גבי צינור 50 מיליליטר, ומוסיפים שני מיליליטר של RPMI קר כקרח בתוספת FBS לא מסננת.

באמצעות הבוכנה ממזרק חמישה מיליליטר, לרסק את הרקמה, ולשטוף את המסנן עם מדיום טרי עד האיבר כבר קרקע מלאה דרך רשת. מעבירים את ההשעיה החד-תאית לצינור של 15 מיליליטר לצנטריפוגה, ומעבירים את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום הדרגתי של 30%. בזהירות שכבת פתרון התא על פני שני מיליליטר של 70% צפיפות שיפוע בינוני בצינור חדש 15 מיליליטר, ולהפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות.

לאחר מכן, להעביר את התאים מן interphase בין שני שיפוע צפיפות לצינור חדש 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של RPMI קר בתוספת FBS עבור צנטריפוגה אחרת, ו resuspend את גלולה ב 10 מיליליטר של קרח קר RPMI / FBS לספירה. כדי לנתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה, לדלל את התאים לחמש פעמים 10 לששים תאים לכל 100 microliters בריכוז מאגר FACS, ולהדגיר את דגימות התא עם 10 microliters של CD16/CD32 נגד העכבר חסימת נוגדנים לכל מדגם. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של תאים למספר המתאים של בארות של צלחת עגולה בת 96 בארות, בהתאם לפרוטוקול הכתמת ציטומיית הזרימה הניסיונית, והוסיפו 20 מיקרוליטרים של תערובת הטטרמט של חלבון אלקטרוני לכל באר לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

בסוף הדגירה, מוסיפים את נוגדני פני התא המעניינים את התאים עבור דגירה של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגנת מפני אור. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 microliters של חיץ FACS לכל לשטוף, בזהירות resuspend התאים בכל באר עם 200 microliters של מאגר FACS טרי. לאחר מכן, לאחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור, עד הניתוח שלהם על ציטומטר זרימה.

תסמינים פתולוגיים וסימנים כגון myeloparalysis ו paraparesis מוטוריים נצפו אינטרפרון אלפא / קולטן בטא 1 עכברים נוקאאוט שבעה ימים לאחר חיסון עם וירוס זיקה. שינויים במשקל קולטן אינטרפרון אלפא / בטא נגוע 1 חיות נוקאאוט היו במעקב במשך 15 ימים, עם ירידה במשקל נצפתה לראשונה ארבעה ימים לאחר זיהום והתאוששות במשקל החל ביום שבע לאחר ההדבקה. תמונות מייצגות של מוחות מורין נגועים חושפות בצקת ברורה והיפרמיה שבעה ימים לאחר החיסון עם נגיף זיקה.

תמונות מייצגות של אשכים נגועים זיקה מורין להדגים התכווצות הדרגתית מהיום השביעי עד 30 ימים לאחר ההדבקה. ניתוח היסטופתולוגי של חלקי המוח ורקמות האשכים הנגועים בזיקה ממחיש גם את ההשפעה של השינויים הפתולוגיים ההרסניים בהשוואה לפקדים לא נגועים. כצפוי מהמאקרו והניתוחים ההיסטופתולוגיים, עומסים נגיפיים גבוהים מזוהים גם במוח ובבדיקה של עכברים נגועים בנגיף זיקה על ידי כשל חיסוני.

זה מלווה חזק CD3 חיובי T-תא חדירה לתוך המוח לאחר זיהום זיקה. לימפוציטים CD3 חיוביים, CD8 חיוביים T ספציפיים לנגיף זיקה מזוהים הן בעכברים נגועים בנגיף זיקה והן בעכברים מחוסנים על ידי כתמי טטרמר E-חלבון. תאי T ספציפיים ל- CD8 חיוביים לחלבון אלקטרוני יכולים גם להיות מזוהים במוח ונבדקים שבעה ימים לאחר החיסון עם וירוס זיקה.

לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בחקר אפיון תאי T ספציפיים לפתוגן באיברים immunoprevalent במהלך זיהומים טבעיים במודלים של בעלי חיים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על איברים נפוצים אחרים במערכת החיסון, כגון שליה או עין, כמו גם על זיהום ויראלי וסרטן. בעקבות הליך זה, Tetramers MHC-I יכול לשמש לגילוי אימונוהיסטוכימי או immunofluorescent של תאי T ספציפיים לפתוגן כדי לגשת להפצה של תאי T חודרים למוח או אשכים.