בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הרכב תת-קבוצות של תאי חיסון בתוך הלב הן במצב יציב והן במצב מחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה לאימונופנוטיפ מדויק של אוכלוסיות תאי חיסון לבביים, כולל תת-קבוצות נדירות מאוד. הפרוטוקול הזה פשוט יחסית.

עם זאת, הזרקות לוורידי הזנב יכולות להיות קשות, לכן חשוב לתרגל טכניקה זו עד שתרגישו בנוח לפני השימוש בחיות ניסוי. כדי לסמן את הלויקוציטים המסתובבים, העמיסו 200 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-CD45 מצומד פלואורופור טרי בעכבר ב-PBS לתוך מזרק אינסולין בקוטר 28.5, וחממו שמונה עכברים בני 12 שבועות על שמיכת מים במחזור המכוונת ל-35 עד 41 מעלות צלזיוס למשך חמש עד עשר דקות. כאשר וריד הזנב התרחב, רסן את החיה הראשונה במצב החזה בהתקן ריסון מתאים.

אם ורידי הזנב אינם מורחבים מספיק, טבלו את הזנב במים של 36 עד 40 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתיים. כאשר ורידי הזנב מוכנים, ספוג את אזור ההזרקה עם גזה ספוגה באתנול 70% ושיתק את בסיס הזנב עם האצבע המורה והאמצעית ואת האזור האמצעי הדיסטלי של הזנב עם האגודל והאצבע הטבעתית. החזק את המחט עם הצד השיפוע כלפי מעלה ובמקביל לווריד, הכנס את המחט לווריד זנב מורחב והזריק תוך ורידי את כל נפח הנוגדן.

לאחר מכן אפשר לנוגדנים להסתובב במשך חמש דקות לפני המתת חסד הומאנית. כדי לקצור את הלב, רססו את העכבר באתנול 70% והרימו את עור הבטן כדי לפתוח את הבטן לאורך קו האמצע הגחוני מהירכיים ועד עצם החזה. פתח את הצפק והזיז את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת.

חותכים את הסרעפת והצלעות משני צידי קו האמצע, תוך הקפדה להימנע מניקוב הריאות והלב. מקלפים את הצלעות לאחור כדי לחשוף את הלב לפני חיתוך הפרוזדורים השמאלי והימני. אחזו בעדינות בבסיס הלב בעזרת מלקחיים, הכניסו מחט בגודל 21 המחוברת למזרק של 60 מיליליטר לחדר השמאלי ליד הקודקוד והחדירו את הלב עם 15 עד 20 מיליליטר PBS קר.

זלוף נכון של הלב חיוני כדי למנוע מזהמים תוך-וסקולריים. לכן הקפידו לנתח ולחדל את הלב במהירות לאחר המתת חסד כדי למנוע זיהום עקב דם קרוש. לאחר החדרת החדר הימני כפי שהודגם זה עתה, יש להבחין בריאות לבנות ובכבד חיוור.

החזקת בסיס הלב עם המלקחיים משוכה בעדינות את הלב כלפי מעלה וחתכה את עורקי הריאה והוורידים העיקריים, אבי העורקים ושק קרום הלב כדי לנתק את רקמת הלב. החזיקו בעדינות את הלב בין האגודל לאצבעות המורה, נקו את הלב בזהירות עם מגבת נייר נקייה ונטולת מוך והשתמשו במלקחיים כדי להסיר את הפרוזדורים וכל שאריות של עורקים וורידים ראשיים או מזהמים אחרים. מניחים את הלב הנקי בכלי פלסטיק של חמישה סנטימטרים ומוסיפים 50 מיקרוליטר PBS קר.

בעזרת מספריים מעוקלים טוחנים את הלב עד שאין חתיכות גלויות והרקמה בעלת עקביות עבה וחלקה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי להעביר את הרקמה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר המכילים 800 מיקרוליטר DMEM קר. הוסיפו קולגנאז, DNase והיאלורונידאז ודגרו במשך 45 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-50 סל"ד.

בסוף מערבולת העיכול דגימות למשך 20 שניות והניחו אותן מיד על קרח. יש לשמור את הדגימה תמיד בארבע מעלות צלזיוס אלא אם כן צוין אחרת מכיוון שניתן להפנים כמה אנטיגנים על פני השטח אם משאירים אותם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הרטיבו מראש מסננת תאים של 140 מיקרוליטר בצינור חרוטי של 50 מיליליטר לדגימה עם מיליליטר אחד של HBB קר.

בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, פיפטה את הדגימות עד שמתלי הרקמה הומוגניים ואינם סותמים את קצה הפיפטה ומוסיפים את הדגימות ההומוגניות למסננים. שטפו לאט את הדגימות דרך המסננים עם 12 עד 14 מיליליטר HBB קר לדגימה, והעבירו את הדגימות המסוננות לצינור חרוטי מסומן של 15 מיליליטר על קרח. עיכול טוב מודגם על ידי היעדר שרידי לב במסנן.

אוספים את הדגימות על ידי צנטריפוגה ומסירים את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזיס אשלגן אמוניום כלוריד לכל דגימה. השעו מחדש את הדגימות במערבולת קצרה, ולאחר מכן דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הפסק את ההמוליזה עם חמישה עד שמונה מיליליטר של HBSS קר. אסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי או מאגר FACS והעביר לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה נוספת. כדי לנתח את הדגימות על ידי זרימה ציטומטרית, יש להשעות את הכדורים ב-50 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-CD16/CD32 וחוסם מונוציטים כדי להפחית את קשירת הנוגדנים הלא ספציפיים למשך 15 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.

ללא שטיפה, הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת מאסטר נוגדנים לכל דגימה עם ערבוב לדגירה של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור. בתום הדגירה יש לשטוף את הדגימות עם 600 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל צינור ולהשעות מחדש את הכדורים ב-300 מיקרוליטר של מאגר FACS טרי או 1% פרפורמלדהיד. לאחר מכן נתח את הלויקוציטים הלבביים על ידי ציטומטריית זרימה על פי פרוטוקולי ניתוח זרימה סטנדרטיים.

ניתוח תרחיף התא הבודד של הלב על ידי זרימה ציטומטרית דורש שער מקדים עם CD45 כדי להבדיל בין תאים חיסוניים לתאים לא חיסוניים של הלב, ואחריו שער הדרה של תא בודד וגודל קטן. מקרופאגים, המזוהים על ידי ביטוי CD64 שלהם, הם אוכלוסיית תאי החיסון העיקרית של הלב, המייצגת 60 עד 70% מכלל תאי החיסון. תאים דנדריטיים לבביים קונבנציונליים הם תאים שליליים CD64 המבטאים רמות גבוהות של MHC Class II ו-CD11c.

ניתן לחלק תאים אלה עוד יותר על סמך הביטוי שלהם של CD103 או CD11b ומייצגים תת-אוכלוסיית לב קטנה בהרבה בהשוואה למקרופאגים. השימוש בזרימה ציטומטרית של תרחיף תא בודד של שריר הלב מאפשר לחקור תת-אוכלוסיות לויקוציטים קטנות בתוך הלב. לדוגמה, באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרית כדי להשוות את התאים החיסוניים של שריר הלב מסוג בר לעומת עכברים חסרי Batf3, ניתן לאשר את היעדר תאים דנדריטיים חיוביים ל-CD103 בקרב חיות הנוק-אאוט.

בנוסף, ניתוח זה חשף היעדר שינוי משמעותי בהרכב אוכלוסיות לב אחרות בבעלי חיים חסרי Batf3, מה שמדגים את מידת הרגישות שניתן להשיג באמצעות שיטה משולבת זו של עיכול אנזימטי ומכני להשגת תרחיף תא בודד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב תמיד לקחת בחשבון את הכדאיות של התא המבודד שלך. לכן אנו ממליצים לייעל את הזמן וריכוז האנזים של העיכול בהתאם לתנאי הניסוי שלך.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף RNA של תא בודד, בדיקות פונקציונליות ובידוד חרוזים מגנטיים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי תפקודי התאים המבודדים.