ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את הארגון של רשתות astrocytic. השיטה המתוארת ממזער הטיה לספק מדדים תיאוריים של רשתות אלה כגון ספירת תאים, גודל, שטח, מיקום בתוך גרעין. . בנוגע למקורו שקובעת עם ניתוח וקטורי.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הארגון של רשתות אסטרוציטים במבני המוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה שיטה לא משוחדת לספור תאי תווית ולתעד את הארגון האנטומי שלהם בתוך מבנה מוגדר. פתחו את ImageJFIJI, בחרו בקובץ הרצוי ולחצו על הלחצן 'אשר' בחלון אפשרויות הייבוא של תבנית הביו.

כדי להגדיר מחדש מחסנית Z שתכיל רק את הפרוסות האופטיות הדרושות לערימת Z הסופית, בחר תחילה פרוייקט STK ו- Z ולאחר מכן לחץ על ידית המחסנית ב סרגל הכלים. בחר בעוצמה מרבית בהגדרת סוג ההקרנה. שמור את הקובץ ותן לו שם לקובץ המחסנית.

אם קובץ ההדמיה כולל מספר ערוצים, השתמשו בצבע תמונה ובערוצי פיצול כדי להציג רק את הערוץ עם תמונת הרשת האסטרוצטית. בדוק את הגדרות הפיקסל של התמונה על-ידי בחירת תמונה, מאפיינים, פיקסל, עם ממד פיקסל אחד. לאחר מכן השתמש בכלי חיסור הרקע על-ידי פתיחת תהליך וחיסור הרקע כדי להסיר תיוג ביוצטין ברקע.

השתמש בפונקציית התצוגה המקדימה כדי להגדיר את רדיוס הכדור המתגלגל, שבדרך כלל מוגדר ב- 50 פיקסלים. אם נדרשת הפחתת רעש נוספת לאחר שלב ההפחתה ברקע, בחר תהליך, רעש והסר חריגים. בחר בהיר בהגדרה החריגה, ולהשתמש בפונקציית התצוגה המקדימה כדי להגדיר את הרדיוס ואת הסף.

היזהר באמצעות הכלי להסיר חריג, שכן הוא עלול לטשטש את הנתונים, כפי שמוצג כאן. התאימו את הסף באמצעות תמונה, התאימו, סף. בחר ברירת מחדל ואת מצב B ו- W.

לחץ על החל. המירו את התמונה לתמונה בינארית בעזרת כלי התהליך הבינארי על-ידי בחירת תהליך, בינארי והפוך לקובץ בינארי. שמור את הקובץ כקובץ tiff ותן לו שם של קובץ בינארי.

לספירת תאים, קבעו תחילה את סוג המדידה בלחיצה על נתח והגדרת מדידה. לאחר מכן בחר באפשרות centroid. ודא שהקובץ הבינארי פתוח על המסך.

שוב, פתח את תפריט הניתוח, והפעם בחר לנתח חלקיקים. לאחר מכן, בחר הצגה וחלוקה לרמות. פעולה זו יוצרת קובץ חדש המציג את תוצאת הזיהוי.

מטב את הפרמטרים כדי למקד את הזיהוי. כדי לזהות תאים בלבד, השתמש בערך גודל בין 30 ל- 6000, ועיגוליות בין אפס לאחד, כאשר אחד מגדיר עיגול מושלם ואפס צורה אקראית. הפעל את הזיהוי על-ידי לחיצה על אישור. יופיעו שתי טבלאות, סיכום שכותרתו טבלה המספקת את מספר התאים שזוהו וטבלה שכותרתה תוצאות המספקות את קואורדינטות X ו- Y של כל תא.

העתק את הערכים והדבק אותם ביישום גיליון אלקטרוני. שמור טבלה זו תחת טבלת זיהוי השמות. כמו כן יופיע קובץ עם התוויה של תאים שזוהו.

שמור קובץ זה כקובץ tiff תחת קובץ זיהוי השמות. אם קבוצה של שני תאים מסומנים בתווית או יותר מזוהה כתא יחיד עם הכלי לנתח חלקיקים, השתמש בכלי קו פרשת המים בתמונה הבינארית על-ידי בחירת תהליך, בינארי, קו פרשת המים לפני החלת הכלי חלקיקי ניתוח. כדי למדוד את שטח הפנים של הרשתות, השתמש בקובץ הזיהוי ב- ImageJ.

שמאל לחץ על העכבר כדי לבחור את כלי בחירת מצולע בסרגל הכלים. לחץ שוב שמאלה כדי להתחיל ל איתר אזור מעניין, או ROI, המחבר את כל התאים הממוקמים בפריפריה החיצונית של הרשת. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסגור את המצולע.

פתחו את חלון המדידה של קבעו ובחרו באפשרות האזור. לאחר מכן פתחו את מנהל ההשקעות והוסיפו את המצולע שעקבו אחריו במנהל ההשקעות על-ידי לחיצה על 'הוסף'. הפעל את המדידה על-ידי לחיצה על מדידה במנהל ההשקעות.

מדידת האזור תופיע בטבלה ותתבטא בפיקסלים. אל תשכח להמיר ערך זה עם גורם המרה עבור המיקרוסקופ המשמש להשגת הערך במיקרומטרים מרובעים. פתח את קובץ המחסנית ב- ImageJFIJI וזהה את התא המדבק בעוצמת התיוג החזקה יותר שלו.

לאחר מכן פתח את טבלת הזיהוי של הקובץ בשם ביישום גיליון אלקטרוני ולמצוא את המספר המשויך לתא המותק ואת הקואורדינטות המתאימות לו. אם אין אפשרות לקבוע במדויק את התא המדבק, השתמש בכלי המצולע כדי להקיף את האזור שבו הפיקדון של ביוצטין צפוף יותר, והתייחס למיקום זה כאל זה של התא המדבק. השתמש במנהל ההשקעות כבעבר כדי לצייר ROI במיקום התא המותק ולהוסיף אותו למנהל ההשקעות.

לאחר מכן, קבעו את המדידה ובחרו באפשרות centroid. במנהל RIO, לחץ על מידה כדי להשיג את הקואורדינטות של המרכז של האזור שעקבו. השתמש בקואורדינטות אלה כנקודת ההתייחסות עבור רשת ספציפית זו.

השתמש בנוסחה זו כדי לחשב את הקואורדינטות של כל תא בהפניה לאסטרוציטים המותק. הבעת הקואורדינטות של כל תא בהפניה לאסטרוציט המותק היא צעד חשוב לחישוב וקטור מהאסטרוציטים המותק. השתמש בנוסחה זו כדי לחשב את הקואורדינטות של הווקטור הראשי של כיוון מועדף.

הווקטור העיקרי של כיוון מועדף של הרשת הוא הסכום של כל הווקטורים שחושבו בעבר עבור כל תא המורכב ברשת. חלק את אורך הווקטור הראשי במספר התאים ברשת, פחות אחד כדי לא לכלול את התא המדבק, כדי לנרמל את הערכים ולאפשר השוואות בין רשתות. כדי לקבוע את המיקום של כל רשת בגרעין העניין, פתח תחילה את ארבע תמונות ה- x באמצעות עורך תמונות וקטורי.

הכפל את הממדים בחלון הממד בחמישה כדי להגדיל את התמונה four x. כאן, התמונה נדגמה ב 800 על ידי 800 פיקסלים, ולכן רזולוציית הדגימה משתנה ל 4000 על ידי 4000 פיקסלים. יצא את הקובץ בתבנית tiff ותן לו שם שגודלו השתנה לארבעה x.

יישר את הפינה השמאלית העליונה של התמונה בגודל 4 x שגודלה השתנה עם הפינה השמאלית התחתונה של מסמך Adobe Illustrator. התוכנה מספקת קואורדינטות מנקודת התייחסות בפינה השמאלית התחתונה. פתח את תמונת 20 x של הרשת.

השתמש בקובץ הבינארי או בקובץ הזיהוי מכיוון שקל יותר ליישר אותם. לאחר מכן, שחקו עם הכלי אטימות בקובץ הבינארי של התמונה בגודל 20 x כדי ליישר אותה עם ארבע תמונות x שגודלן השתנה. לאחר שהיישור נעשה, בחרו והחזיקו את הכלי pipette כך שכלי המידה יופיע ובחרו בו בסרגל הכלים השמאלי.

השתמש בכלי המידה כדי ללחוץ בפינה השמאלית העליונה של התמונה 20 x כדי לקבל את הקואורדינטות של 20 x נקודת הקשר על גודל ארבע x תמונה. קואורדינטות ייחוסיות אלה של 20 x שימושיות להבעת המיקום של כל רשת בציור סכמטי של הגרעין. לסיכום הנתונים, נעשה שימוש בנורמליזציה של הגרעין כמלבן.

לשם כך, השתמש בכלי מצולע כדי להקיף את הגרעין בתמונה בגודל 4 x שגודלה השתנה. לאחר מכן פתחו את מנהל ההשקעות והוסיפו את ההשקעה המצויר. השתמש בתמונה עם אורות שקופים אם לא ניתן לראות את גבולות הגרעין, במקרה זה זכור לשנות את גודלו תחילה.

במדידה מוגדרת, בחרו באפשרות המלבן התוחמ לחישוב המלבן הקטן ביותר בתוך גרעין המצויר. לבסוף, לחץ על מידה ולאחר מכן בצע את השלבים בפרוטוקול הכתוב כדי לבטא את קואורדינטות התאים המסווים בגרעין מנורמל המיוצג על-ידי המלבן התוחמ. אסטרוציטים בודדים בחלק הגבי של הגרעין החושי הראשי התלת-מימדי, שכותרתו SR101, היו מיועדים להקלטה של תא שלם ומלאים בביוצטין של 0.2%.

גירוי חשמלי של תיוג ביוצטין בדרכי החמישית גדל בחלק הגבי של גרעין החושים הראשי trigeminal, המייצג עלייה במספר התאים המרוכזים. רשתות אסטרוציסטיות נשארות מוגבלות בתוך החלק הגבי של הגרעין החושי הראשי הטריגמינלי והכיוון העיקרי שלהן. טכניקה זו פותחה כדי למקם רשתות אסטרוציטיות בתוך מבנה מוגדר, אך ניתן להשתמש בה כדי לבטא את המיקום של אוכלוסיית התא המסוויג בכל מבנה.