Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך
26 בנובמבר 2018
שיטה זו מאפשרת decellularization של איבר מוצק מורכבים באמצעות פרוטוקול פשוט המבוסס על שוק אוסמוטי זלוף של יונית סבון עם הפרעה מטריצות איבר מינימלי. היא כוללת טכניקה decellularization הרומן מלב אנוש בתוך נרתיק מווסת עם ניטור בזמן אמת זרימה dynamics וסלולר יצוא פסולת.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על יצירת פיגומים vascularized, שהם באמת הגביע הקדוש של השדה הנדסת רקמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי כיס בלחץ בכיוון הפוך משפר את decellularization של איברים אנושיים שאינם להשתלה ומאפשר לנו לעשות את זה בצורה סטרילית על פני מסגרת זמן מתאימה. כדי להכין את הלב לדפלולריזציה, תחילה לבצע בדיקה פנימית עבור פגמים אפשריים.
אם קיים פגם מחיצה, לתקן את הפגם עם התפרים המתאימים. לאחר מכן, ligate ואנה קאבס מעולה ונון נחות עם 2-0 תפר משי. תפרו את קיר ה אטריום הימני עם 5-0 פרולין, ו לנתח את אבי העורקים הרחק עורק הריאה הראשי עבור cannulation הבאים.
הכנס את המחברים, בהתאם לקוטר הכלי, לתוך העורקים העורקים ועורק הריאה, ואבטח את המחברים בתפרים משי 2-0. באמצעות אחד פתחי וריד הריאה, הכנס קו צינורות דרך ה אטריום השמאלי לכיוון החדר השמאלי, וחבר קו עירוי למחבר ב- aorta וקו זרימה למחבר ב עורק הריאה. מניחים את הלב המוכן לתוך כיס פוליאסטר בכיוון ההפוך, ומ מניחים את השקית לתוך מיכל נזיבה.
חבר כל אחד מהקווים ליציאות המתאימות ב פקק הגומי, בהתאם לקוטר המיכל, והכנס את הפקק למכסה של מיכל הנזיפה כדי לאטום את כיס הפוליאסטר. לאחר מכן, לעיין PBS דרך יציאת עירוי של פקק הגומי כדי לאמת את הזרימה מן העורק ריאתי מן הקו מוכנס לתוך החדר השמאלי, באמצעות זרימה זו כדי לנקות את האיבר של כל עקבות שיורית של דם בתוך כלי הדם. כאשר הלב מוכן, מניחים את הביוריאקטור שהורכב בכיוון זקוף, וחברו את קו העירוי, קו ראש הלחץ, קו זרימת עורקים ריאתי וקו ניקוז ביו-ריאקטור ליציאות פני השטח של מכסה הגומי על גבי הביוריאקטור של הזלוש.
לאחר מכן, decellularize הלב במשך ארבע שעות עם פתרון היפרטוני, שעתיים עם פתרון היפוטוני, 120 שעות עם נתרן dodecyl סולפט, או SDS, ו לשטוף סופית עם 120 ליטר של PBS, כל תחת קבוע 120 מילימטרים של לחץ כספית כפי שנמדד בשורש האורטי. במהלך 10 ליטר האחרון של לשטוף PBS, להוסיף 500 מיליליטר של 2.1% חומצה סטרילית פתרון חומצה peracetic מנוטרל עם 10 הידרוקסיד נתרן נורמלי לתופס זלוס כדי לעקר את הפיגום. בדרך כלל, קצב הזרימה לתוך בית הדם במהלך תהליך דקלולריזציה בהדרגה פוחתת כמו פתרון זלוח משתנה היפרטוני היפוטוני.
לעומת זאת, קצב הזרימה עולה כאשר פתרון התדלוק משתנה מפתרון היפוטוני ל- SDS, ובנקודה זו קצב זרימת העירוי מדגים תנודות. קצב הזרימה של עורק הריאה מדגים מגמה דומה עם הפתרונות ההיפר-היפוטוניים. עם זאת, קצב הזרימה במהלך זלוש SDS מציג ירידה כוללת.
יעילות חליטה כלילת גם פוחתת עם הזמן כמו reagents שונים הם חדור דרך כלי הדם. כאשר הזרימה מתפרפרת מ עורק הריאה והחנדר השמאלי נאספים בו זמנית, ניתן להשוות את תוכן הפסולת שלהם על ידי ספקטרוסקופיה. העיסתנות של הפלחיה משני כלי השיט פוחתת עם הזמן במהלך הזלוף, אם כי העכור בעורק הריאה מציג שינוי צבע פתאומי יותר בהשוואה לזה שנצפה בחדר השמאלי במהלך תקופת הזלוף הראשונית.
הערכת המתאם בין עששת הזרימה לבין פסולת התאים על ידי אסאי חלבון חומצה ביצינצ'ונית משישה לבבות אנושיים דפלולריים מגלה מתאם ליניארי בין ריכוז החלבון לבין חרפת הרוחות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לפקח על קצב הזרימה ולאסוף את ההתעלות מעת לעת כדי לפקח בפועל על תהליך התדלוק. בעקבות הליך זה, טכניקות אחרות כמו הערכה מכנית או בדיקות סטריליות ניתן להשתמש כדי להעריך את הנאמנות של הפיגום ואת השימוש הפוטנציאלי שלה recellularization כדי ליצור רקמת לב תפקודית.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית והנדסת רקמות לחקור את הדור של איברים שלמים של כלי דם, ממש לשנות את תחום השתלת איברים מוצק. אל תשכח כי עבודה עם איברים אנושיים ורקמות וכימיקלים כגון SDS יכול להיות מסוכן מאוד, תמיד ללבוש ציוד הגנה אישי המתאים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטה זו מאפשרת דה-צלולריזציה (הסרה של תאים) של איברים מוצקים ומורכבים, ובסגול לב אנושי, באמצעות פרוטוקול פשוט הממזער את פגיעת המטריקס של האיבר. הטכניקה עושה שימוש בשק בלחץ לצורך ניטור בזמן אמת של דינמיקת הזרימה ושל זרימת השאריות התאיות החוצה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת רקמות
- דסלולריזציה של איברים
- מחקר קרדיווסקולרי
רקע
- דה-צלולריזציה (Decellularization) היא קריטית ליצירת פיגומים מכליים בהנדסת רקמות.
- שיטות נוכחיות גורמות לעיתים קרובות להרס של המטריצה של האיבר.
- דרושות טכניקות משופרות עבור איברים אנושיים שאינם ניתנים להשתלה.
- ניטור בזמן אמת יכול לשפר את תהליך הדה-צלולריזציה.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקת דקלול (decellularization) חדשנית עבור לבבות אנושיים.
- שיפור הסטריליות והיעילות של תהליך הדקלול.
- הס cqללה של יצירת פיגומים (scaffolds) עם כלי דם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקה פנימית של הלב לאיתור פגמים.
- תיקון פגמים במחיצות הלב באמצעות תפרים.
- קישור של הוורידים החלולים העליון והתחתון.
- ניתוח של האורטה לצורך קניולציה.
תוצאות עיקריות
- השקית המלוחצת משפרת את יעילות הדקולולריזציה.
- ניטור בזמן אמת מאפשר שליטה טובה יותר בתהליך.
- הושגה הפרעה מינימלית למטריקה של האיבר.
- השיטה ישימה בסביבה סטרילית.
מסקנות
- טכניקה זו מהווה התקדמות משמעותית בדסלולריזציה של איברים.
- היא מבטיחה יישומים עתידיים בהנדסת רקמות.
- מחקרים נוספים עשויים להרחיב את השימוש בה לסוגים אחרים של איברים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
דה-צלולריזציה (Decellularization) של לבבות אנושיים שלמים באמצעות שקית בלחץ במצב הפוך מאפשרת יצירת סקאפולדים (scaffolds) וסקולריים להנדסת רקמות לב, ובכך נותנת מענה לצורך הקריטי באיברים להשתלה. שיטה זו תומכת בהפחתת סיכונים חזויה על ידי שימור ארכיטקטורת המטריצה החוץ-תאית ומאפשרת ניטור בזמן אמת של דינמיקת הפרפוזיה, דבר המעניק מידע על איכות הסקאפולד ועל פוטנציאל הרצלוולריזציה שלו. היא ממצבת את הטכניקה כבסיס חיוני לקידום פיתוח לבבות ביו-סינתטיים ולהפחתת התלות באיברים מתורמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של הרכב המטריקס extracellula של הלב ושל המבנה הווסקולרי לצורך תיקוף מטרות בטיפולים לאי-ספיקת לב.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמת פיגום (scaffold) ניתנת לשחזור למחקרים מכניסטיים של אינטראקציות תא-מטריקס ברקמה חולה לעומת רקמה בריאה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר פיגומים סטנדרטיים ממקור אנושי לצורך הערכה כמותית של זריעת תאים, שגשוג ושילוב תפקודי במודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: תומך במוכנות הבדיקה באמצעות מדדי עכירות ומספרי מתאם של חלבון בזמן אמת, המאפשרים בקרת תהליך ועקביות בין סדרות ייצור.
מחקר תרגומי ופקליני
- ערך מדעי: מקדם רציפות תרגומית על ידי אספקת פיגום לב אנושי רלוונטי למחלה לצורך הערכת אסטרטגיות של רפופולציה (recellularization) והבשלה אלקטרומכנית.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון באמצעות ניתוח מתואם של עכירות הנוזל המנותק והסרת פסדתיים תאיים כמדד לבקרת איכות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות אספקת פלטפורמת פיגום מvסקולרית ממקור אנושי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של יעדים במטריקס extracellullar של הלב ובהבהרת מסלולים באמצעות שימור ארכיטקטורת הרקמה המקורית.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות עכירות זרימה מדידה ומתאם עם בדיקת חלבון bicinchoninic acid לניטור יעילות הדסלולריזציה.
- אנליטיקה: מספקת פלטים מדידים הכוללים דינמיקה של קצב זרימה, מ gradientי לחצים ופרופילי זרימת פסולת, המשמשים לאופטימיזציה של התהליך ולהחלטות של המשך או עצירה (go/no-go).
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי אספקת פיגום המתאים לדה-סלולריזציה ולהערכה תפקודית במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ליצירת פיגומים לשימוש חוזר, הישומה בתוכניות מרובות של תיקון והתחדשות לבבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בנאמנות הפיגום באמצעות שימור המטריצה החוץ-תאית התלת-ממדית ומערכות כלי הדם, המפחית את העמימות המכניסטית בהנדסת רקמות לבביות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה המושגות באמצעות מערכת שקיות בלחץ, המאפשרת דה-צלוליות (decellularization) סטרילית ומנוטרת לאורך פרקי זמן ממושכים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) המבוססת על ניטור פרפוזיה בזמן אמת ומדדי פינוי פסדתיים, המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי רפואה רגנרטיבית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעודוף של מועמדים לפיגומים המותאם לסיכון, תוך שימוש במתאם כמותי בין עכירות לחלבון כקריטריון לשחרור עבור תהליכי רצלוולציה (recellularization).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרפוזיה של איברים, טיפול בחומרי דקולולריזציה ועיבוד רקמות סטרילי.
- תלוי בתשתית של ביו-ריאקטור לפרפוזיה המסוגל לשמור על לחץ קבוע של 120 mmHg והחלפת תמיסות של ריאגנטים מרובים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי איסוף זרימה יוצאת, ספקטרוסקופיה ובדיקות חלבון להערכה עקבית של איכות הפיגום.
- כולל שיקולי התאמה לגדלי איברים שונים ומבנים וסקולריים בעת הרחבת הפרוטוקול מעבר ללבבות אנושיים.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לסכנות חשיפה לריאגנטים (למשל SDS, חומצה פראצטית) הדורשות ציוד מגן אישי (PPE) קפדני ופרוטוקולי הכלה.
