Name: יחידת מידה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים Kynurenine וחומצה Kynurenic: ביוכימיה הנוגעים קוגניציה ולישון אצל חולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: חקור את השפעת האתגר החד של קינורנין על מטבוליטים במוח ובפלזמה אצל חולדות. שיטה זו משלבת ניתוח ביוכימי והתנהגותי להבנת מסלול קינורנין בנוירומדע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר הנוכחי מומן בחלקו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 NS102209) ותרומה של אמון פורבס קלייר אי.

<ol><li>Leklem, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+aspects+of+tryptophan+metabolism+in+humans+and+other+species%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).</li>
<li>Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128009819000250">Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior</a>. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).</li>
<li>Hilmas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+metabolite+kynurenic+acid+inhibits+alpha7+nicotinic+receptor+activity+and+increases+non-alpha7+nicotinic+receptor+expression%3A+physiopathological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications.</a> Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).</li>
<li>Perkins, M. N., Stone, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iontophoretic+investigation+of+the+actions+of+convulsant+kynurenines+and+their+interaction+with+the+endogenous+excitant+quinolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid.</a> Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).</li>
<li>DiNatale, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+is+a+potent+endogenous+aryl+hydrocarbon+receptor+ligand+that+synergistically+induces+interleukin-6+in+the+presence+of+inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling.</a> Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+as+a+ligand+for+orphan+G+protein-coupled+receptor+GPR35%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).</li>
<li>Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+elevations+of+brain+kynurenic+acid+impair+cognitive+flexibility%3A+normalization+by+the+alpha7+positive+modulator+galantamine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine.</a> Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).</li>
<li>Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-kynurenine+treatment+alters+contextual+fear+conditioning+and+context+discrimination+but+not+cue-specific+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning.</a> Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).</li>
<li>Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevations+of+endogenous+kynurenic+acid+produce+spatial+working+memory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits.</a> Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).</li>
<li>Pocivavsek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+endogenous+kynurenic+acid+control+hippocampal+glutamate+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).</li>
<li>Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Kynurenine+Challenge+Disrupts+Sleep-Wake+Architecture+and+Impairs+Contextual+Memory+in+Adult+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats.</a> Sleep. 40 (11), (2017).</li>
<li>Halassa, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+modulation+of+sleep+homeostasis+and+cognitive+consequences+of+sleep+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss.</a> Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Erhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+levels+are+elevated+in+the+cerebrospinal+fluid+of+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia.</a> Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).</li>
<li>Linderholm, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+kynurenine+and+kynurenic+acid+in+the+CSF+of+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).</li>
<li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+kynurenine+pathway+metabolism+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).</li>
<li>Schwarcz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cortical+kynurenate+content+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Increased cortical kynurenate content in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).</li>
<li>Pocivavsek, A., Rowland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Neuroscience+Illuminates+Causal+Relationship+Between+Sleep+and+Memory%3A+Translating+to+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).</li>
<li>Shibata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorimetric+micro-determination+of+kynurenic+acid%2C+an+endogenous+blocker+of+neurotoxicity%2C+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography.</a> Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).</li>
<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+consolidation+during+sleep%3A+a+neurophysiological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sleep+Research%22%5BJournal%5D)">Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective.</a> Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).</li>
<li>Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+deprivation+selectively+impairs+memory+consolidation+for+contextual+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning.</a> Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).</li>
<li>Yamashita, M., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+circuit+in+fatigue%3A+From+blood+to+brain+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition.</a> Brain Research. 1675, 116-126 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

עבור הערכה אמינה של KYNA במוח לאחר המינהל kynurenine היקפיים, חשוב לשלב ולפרש ניסויים הביוכימי ופונקציונליים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר למשתמשים חדשים ליצור שיטות יעילות למדידת פלזמה kynurenine של המוח KYNA של חולדות. המדד של kynurenine ב הפלזמה אישרה הזרקה מדויקת ואת המידה של מטבוליט KYNA מאשרת את סינתזת דה נובו במוח. ישנם מספר יתרונות המתואר fluorometric HPLC השיטה, המותאמים מ Shibata18, derivatize KYNA בנוכחות Zn2 +, כולל את היכולת לזהות בדיוק כמויות KYNA אנדוגני...

KP אחראי משפילים כמעט 95% של טריפטופן חומצת אמינו חיונית1. במוח של יונקים, kynurenine תוך האסטרוציטים עובר מטבוליזם בתוך המולקולה קטנה neuroactive KYNA בעיקר על ידי האנזים kynurenine aminotransferase (קאט) II2. KYNA פועל כמו אנטגוניסט-קולטני NMDA, α7nACh המוח2,3,4, ואני גם מטרות איתות קולטנים כולל הקולטן פחמימן aryl (אמפר לשעה) ו- G-החלבון בשילוב קולטן 35 (GPR35)5 ,6. בחיות ניסוי, הגבהים במוח KYNA הוכחו לפגום את הביצועים הקוגניטיביים שלהם במערך של מבחני התנהגות2,7,8,9,10 . השערת המתעוררים מרמז על זה KYNA ממלא תפקיד חשוב להתכוונן תפקודים קוגניטיביים על ידי להשפיע על התנהגות שינה11, ובכך תומך עוד יותר את התפקיד של מולקולות נגזר אסטרוציט של להתכוונן לנוירוביולוגיה של שינה, קוגניציה12.
קלינית, הגבהים, KYNA נמצאו השדרתי ורקמות המוח פוסט-מורטם של חולים עם סכיזופרניה13,14,15,16, הפרעה פסיכיאטרית מתישה מאופיין על ידי ליקויים קוגניטיביים. חולי סכיזופרניה מוטרדים גם לעתים קרובות על ידי הפרעות שינה זה עשוי להחריף את המחלה17. להבין את התפקיד של חילוף החומרים KP, KYNA הכוח ויסות גומלין בין שינה, קוגניציה, בעיקר בין למידה וזיכרון, עשויה להוביל לפיתוח טיפולים לטיפול אלה עני תוצאות סכיזופרניה, השני מחלות פסיכיאטריות.
שיטה אמינה ועקבית לשקילת KP מטבוליטים חשוב להבטיח כי המחקר המתעוררים ממוסדות שונים שניתן לשלב את ההבנה המדעית של KP ביולוגיה. כיום, אנו מתארים את המתודולוגיה למדוד kynurenine בפלסמה עכברוש, KYNA במוח חולדה על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC). בפרוטוקול הנוכחי, אשר עושה שימוש זיהוי fluorimetric בנוכחות Zn2 +, פותחה לראשונה על ידי Shibata18 ועוד לאחרונה הותאם and אופטימיזציה to derivatize עם 500 מ מ אבץ אצטט כמו טור שלאחר הכימית, המאפשר זיהוי אנדוגני, כמויות nanomolar של KYNA המוח11.
לעורר את הייצור KYNA דה נובו אנדוגני כמפורט בפרוטוקול הנוכחי, kynurenine bioprecursor ישירה מוזרק intraperitoneally (i.p.) בחולדות. בשילוב עם הערכות ביוכימי כדי לקבוע את מידת KYNA ייצור, ההשפעות של kynurenine לקרוא תיגר על הזיכרון תלוי בהיפוקמפוס (הימנעות פסיבי הפרדיגמה) ואת הארכיטקטורה שינה (EEG ו- EMG אותות) הוא גם ובדוקים11. שילוב של שיטות אלה מאפשר חקר ההשפעה הביוכימי ופונקציונליים של יישום kynurenine אתגר ויוו בחולדות.

<table><tbody><tr><td>חולדות וויסטאר מעבדות</td><td></td><td>נהר צ'ארלס</td><td>זכר בוגר, 250-350 גרם</td></tr><tr><td>L-קינורנין סולפט</td><td>Sai Advantium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 עמודה (4 מ"מ x 150 מ"מ)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Clips</td><td>Stoelting Co.</td><td>59022</td><td></td></tr><tr><td>ברגי חומרי הרכבה</td><td>פלסטיק אחד</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>תפרים בלתי נספגים</td><td>MedRep Express</td><td>699B</td><td>CP רפואי מונומיד שחור תפרי ניילון, 4-0, P-3, 18 אינץ', קופסה של 12</td></tr><tr><td>תפרים נספגים</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 מצופה Vicryl Violet 1X27'' SH-1</td></tr><tr><td>צמנט שיניים</td><td>Stoelting Co.</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה</td><td>Stoelting Co.</td><td>514551</td><td>0.45 מ"מ</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>תגובות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ברית HPLC מערכת</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E2695 מודול הפרדה</td><td>ווטרס</td><td>176269503</td><td></td></tr><tr><td>2475 גלאי פלואורסצנטי</td><td>ווטרס</td><td></td><td></td>186247500</tr><tr><td>מנהל ריאגנטים לאחר הטור</td><td>ווטרס</td><td>725000556</td><td></td></tr><tr><td>מחשב לנובו</td><td>ווטרס</td><td>668000249</td><td></td></tr><tr><td>העצמת תוכנה</td><td>ווטרס</td><td>176706100</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>><חזקה>פסיבית תיבת הימנעות לחולדה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא הנחתת קול MDF גבוה במיוחד</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-018MD</td><td>פנים: 22 אינץ' (W) x 22 אינץ' (H) x 16 אינץ' (D)</td></tr> <tr><td>תא תיבת מעבורת מודולטור ערוץ מרכזי</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MC</td><td></td></tr><tr><td>רצפת רשת נירוסטה לחולדה</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-GF</td><td></td></tr><tr><td>דלת גיליוטינה אוטומטית</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010B-S</td><td></td></tr><tr><td>ניתוק מהיר רתמת רצפת רשת מעבורת לחולדה</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-QD</td><td></td></tr><tr><td>אור גירוי, עדשה לבנה בגודל 1 אינץ', מותקנת על פאנל מודולרי</td><td>מודול</td><td>MedAssociates ENV-221M</td><td></td></tr><tr><td>Sonalert עם בקרת עוצמת קול לתא חולדות</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-223AM</td><td></td></tr><tr><td>SmartCtrl 8 כניסה/16 פלט חבילת</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-716P2</td><td></td></tr><tr><td>8 ערוצים בקרת IR עבור תיבות מעבורת</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-253C</td><td></td></tr><tr><td>מקור אינפרא אדום ורצועות מערך דקטקטור</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-256</td><td></td></tr><tr><td>ארון ממשק שולחני, 120 וולט 60 הרץ</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080C</td><td></td></tr><tr><td>מודול גירוי מרתיע זרם קבוע בטווח כפול</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-410B</td><td></td></tr><tr><td>מודול רצפת רשת מצב מוצק</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-412</td><td></td></tr><tr><td>מודול בקרת זעזועים כפול A/B</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-415</td><td></td></tr><tr><td>2' 3 פינים הארכת מיני-מולקס</td><td>MedAssociates</td><td>SG-216A-2</td><td></td></tr><tr><td>10 אינץ' כבל פלט זעזועים, DB-9 M/F</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219G-10</td><td></td></tr><tr><td>כבל בקרת זעזועים של מעבורת 15 ', 6</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219SA</td><td></td></tr><tr><td>ארון שולחן קטן וספק כוח, 120 וולט 60 הרץ</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080D</td><td></td></tr><tr><td>חבילת ממשק PCI</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-700P2-R2</td><td></td></tr><tr><td>חבילת שירות הימנעות מתיבת הסעות</td><td>MedAssociates</td><td>SOF-700RA-7</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק><</td><td> strong>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Sleep-Wake Monitoring Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponehmah Software</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNP-P3P-610</td><td></td></tr><tr><td>MX2 8 Source Acquisition Interface</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNM-P3P-MX204</td><td></td></tr><tr><td>מחשב Dell, Optiplex 7020, Windows 7, 64 סיביות</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0112-013</td><td></td></tr><tr><td>צג מחשב Dell בגודל 19 אינץ'</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0113-001</td><td></td></tr><tr><td>מקלטים לכלובי פלסטיק, 8x</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>נתב VPN של Cisco RV130</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>RV130</td><td></td></tr><tr><td>מטריקס 2.0</td><td>מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI)</td><td>271-0119-001</td><td></td></tr><tr><td>מתג רשת</td><td>מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI)</td><td>SG200-08P</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Neuroscore</td><td>מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI)</td><td>271-0171-CFG</td><td></td></tr><tr><td>משדר שני ערוצי ביו-פוטנציאל, דגם TL11M2-F40-EET</td><td>מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI)</td><td>270-0134-001</td><td></td></tr></tbody></table>

יחידת מידה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים kynurenine וחומצה kynurenic: ביוכימיה הנוגעים קוגניציה ולישון אצל חולדות

A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats

מסלול kynurenine (KP) של טריפטופן השפלה היה מעורב הפרעות פסיכיאטריות. באופן ספציפי, נגזר אסטרוציט המטבוליט kynurenic חומצה (KYNA), אנטגוניסט-שתי N-מתיל-d-אספרטט (NMDA) ואת רצפטורים אצטילכולין nicotinic (α7nACh) α7, היה מעורב תהליכים קוגניטיביים על בריאות ומחלה. כפי KYNA רמות גבוהות במוחם של חולי סכיזופרניה, תקלה glutamatergic, קולטנים שימוש הוא האמין להיות סיבתי קשורה בתפקוד הקוגניטיבי, תחום הליבה של פסיכופתולוגיה המחלה. KYNA עשוי לשחק תפקיד משמעותי pathophysiologically אנשים עם סכיזופרניה. ניתן להעלות את רמת KYNA אנדוגני במוח מכרסמים על ידי טיפול בבעלי-חיים עם kynurenine bioprecursor ישירה, פרה מחקרים בחולדות הראו כי הגבהים חריפה ב- KYNA עשוי להשפיע את תהליכי הלמידה והזיכרון שלהם. בפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה זו ניסיוני בפירוט, והוא משלב א) ניתוח הביוכימי של רמות kynurenine בדם והמוח היווצרות KYNA (באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים), בדיקת b) התנהגותית כדי לחקור זיכרון הקשרי תלויי-בהיפוקמפוס (פרדיגמה הימנעות פסיבי), ו- c) הערכה על התנהגות שינה [telemetric הקלטות שילוב העוויתיים (EEG) electromyogram (EMG) אותות] אצל חולדות. יחדיו, יחסים בין גבוהות KYNA, שינה, קוגניציה היא למדה, פרוטוקול זה מתאר בפירוט גישה נסיונית להבנת תפקוד תוצאות של העלאת kynurenine ו KYNA היווצרות ויוו בחולדות. התוצאות המתקבלות באמצעות וריאציות של פרוטוקול זה יהיה לבחון את ההשערה כי KP ואת KYNA לשרת תפקידי מרכזי הכוח ויסות שינה וקוגניציה במצבי בריאות ומחלה.

כדי לאמת את השימוש זריקה kynurenine בקרום הבטן כשיטה להעלות את המוח KYNA, בוצע ניתוח HPLC של רקמות. רגיל עקומות (איור 1) נבנו באמצעות התוכנה המשויכים ואת המותר עבור כימות של דגימות רקמה. נציג chromatograms עבור kynurenine ו- KYNA מוצגים באיור2. Kynurenine נצפתה בזמן השמירה של 6 דקות, והיה KYNA זמן השמירה של 11 דקות. כדי לבחון את הדינמיקה KP, 100 מ"ג/ק"ג של kynurenine היה מנוהל בפרוטוקול זה, רקמת נאסף מייד לאחר ההזרקה או 2 או 4 h ...

שינויים ב- kynurenine מסלול (KP) neuroactive מטבוליטים הם מעורבים מחלות פסיכיאטריות. חוקרים התוצאה הפונקציונלית של kynurenine שינו מסלול חילוף החומרים של ויוו בחולדות עשוי לעזור להבהיר רומן גישות טיפוליות. בפרוטוקול הנוכחי משלב גישות ביוכימיים והתנהגותיים לחקור את ההשפעה של אתגר kynurenine חריפה אצל חולדות.

יחידת מידה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים Kynurenine וחומצה Kynurenic: ביוכימיה הנוגעים קוגניציה ולישון אצל חולדות

The kynurenine pathway (KP) of tryptophan degradation has been implicated in psychiatric disorders. Specifically, the astrocyte-derived metabolite ...

שיטה זו משלבת גישות ביוכימיות והתנהגותיות כדי לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח לגבי ההשפעה של אתגר קינורנין חריף בחולדות. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא מספקת שיטה אמינה ועקבית למדידת מטבוליטים של מסלול קינורנין במוח ובפלזמה של חולדות. מי שתדגים את ההליך תהיה קרלי פביאן, עוזרת מחקר סטודנטית מהמעבדה שלי.בנקודת הסיום הניסיונית, לאחר מתן קינורנין תוך-צפקית, יש להפשיר פלזמה שנקטפה בהקפאה על קרח רטוב ולדלל את הדגימות המופשרות במים טהורים במיוחד. העבירו 100 מיקרוליטר של דגימה מדוללת למיכלים בודדים של 25 מיקרוליטר של חומצה פרכלורית 6% ומערבולת בצנטריפוגה את הדגימות. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של סופרנטנטים מכל צינור לצינורות מיקרו-צנטריפוגות בודדים של 250 מיקרוליטר לקביעת קינורנין וחומצה קינורנית.למדידת חומצה קינורנית מדגימות מוח, יש להפשיר את דגימות המוח הקפואות שנקטפו על קרח יבש ולשקול כל דגימה בנפרד באיזון אנליטי מדויק. לאחר שכל הדגימות נשקלו, העבירו את הצינורות על קרח רטוב ודללו כל דגימת רקמה ביחס משקל של 1 עד 10 בנפח עם מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן הומוגניזציה עם סוניקטור. יש לצרף 100 מיקרוליטר מכל תמיסת דגימה לצינור חדש ואז להוסיף 25 מיקרוליטר של חומצה פרכלורית 25% למערבולת וצנטריפוגה.לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים של 250 מיקרוליטר לקביעת חומצה קינורנית. כדי להכין את מכונת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים, או HPLC, לניתוח קינורנין, הנח תחילה את צינורות הצריכה הבודדים של HPLC לשלב הנייד, מים טהורים במיוחד ומיכלי אצטוניטריל 100%. לאחר מכן, תכנת את המכשיר להפעיל 5% אצטוניטריל ו-95% מים טהורים במיוחד ב-0.5 מיליליטר לדקה ולאפשר למכונת ה-HPLC לפעול במשך 20 עד 30 דקות.כאשר הושגו לחץ וקו בסיס יציבים, שנה את הרכב התמיסה לשלב נייד של 5% אצטוניטריל ו-95% נתרן אצטט ואזן את המכשיר למשך 30 דקות נוספות. בזמן שהמכשיר מתאזן, הפעל את המנורה בגלאי הקרינה. לפני הנגזרת, יש לשאוב את תמיסת האבץ אצטט בנפרד דרך משאבה פריסטלטית המשתלבת עם עמוד עמוד הפאזה הנייד ולהפעיל את משאבת עמוד העמוד לקצב זרימה של 0.1 מיליליטר לדקה למשך כ-20 דקות, עד שהיא מגיעה ללחץ יציב של כ-500 psi.כאשר המכשיר מוכן לניתוח, הגדר את תוכנת המערכת לשלוט בפרמטרי רצף הדגימה ולאפשר הזרקה אוטומטית של מספר דגימות. במסך הפעל דגימה, לחץ על קובץ' וגרור מטה אל צור ערכת דוגמאות חדשה 'בחירה ריק' בחלון החדש. רשום בנפרד את כל התקנים והדגימות לפי הסדר שבו יש להפעיל אותם, כאשר התקנים נבדקים בתחילת ובסוף הרצף.בעמודת הפונקציה, ציין את התקנים והדגימות והגדר את התוכנית להזרקת מים בין כל חמש דגימות. הגדר את זמן הריצה של כל דגימה ל-15 דקות והזריק 20 מיקרוליטר מהדגימות מהתקנים, ולאחר מכן 20 מיקרוליטר של דגימות הפלזמה ו-30 מיקרוליטר של דגימות המוח הומוגנטיות בהתאם לניסוי. לאחר מכן, הגדר את אורכי גל העירור והפליטה בהתאם לתרכובת הנמדדת והפעל את הרצף.כדי לכמת את הנתונים, פתח את מסך עיון בפרויקט ותחת הכרטיסייה קבוצות לדוגמה, לחץ פעמיים על ערכת הדוגמאות שיש לכמת. מרשימת ההזרקות סמן את כל התקנים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור תהליך' בחלון החדש. לאחר מכן, השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור כיול וכמות'סמן שוב את כל התקנים, לחץ לחיצה ימנית ובחר סקירה'כאשר הכרומטוגרמות נפתחות, שלב וכייל כל תקן כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית.לאחר מכן, חזור לכרטיסייה ערכות מדגם ולחץ פעמיים על ערכת הדגימה כדי לכמת ולסקור כפי שהודגם, לשלב ולכמת כל דגימה כדי להפיק את הריכוז של כל דגימה על סמך העקומה הסטנדרטית שנוצרה קודם לכן. ניתוח HPLC של דגימות רקמה שנאספו מבעלי חיים הניתנים לקינורנין מגלה זמן שימור קינורנין של כשש דקות וזמן שימור חומצה קינורנית של כ-11 דקות. הכימות של קינורנין בפלזמה וחומצה קינורנית בהיפוקמפוס מגלה כי הזרקת קינורנין חריפה מעלה את רמות החומצה הקינורנית במוח עם שיא המושג שעתיים לאחר ההזרקה שחוזר לנקודת ההתחלה ארבע שעות לאחר ההזרקה.למרות שלא נצפו הבדלים בין קבוצות במהלך ניסויי אימון פרדיגמת הימנעות פסיבית, חיות ביקורת מציגות עלייה משמעותית בחביון כדי להיכנס לצד האפל במהלך ניסויי ניסוי, מה שמעיד על למידה הקשרית, בעוד שבעלי חיים שהוזרקו להם קינורנין 24 שעות קודם לכן אינם מציגים את אותה עלייה בחביון, מה שמדגים ליקוי בלמידה. יתר על כן, הערכת ההשפעה של עלייה חריפה בקינורנין במהלך שלב האור על ארכיטקטורת שינה-ערות מצביעה על ירידה במשך השינה הכולל של תנועת עיניים מהירה במהלך השעתיים הראשונות לאחר הזרקת קינורנין. נתונים אלה משתקפים על ידי עלייה במשך הערות בפרקי זמן אלה וירידה קלה בשינה עם תנועות עיניים לא מהירות, מה שמדגים כי עלייה חריפה בקינורנין גורמת גם להפרעות בדינמיקה של שינה-ערות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח התנהגותי כדי לענות על שאלות נוספות לגבי התפקיד של היווצרות חומצה קינורנית מוגברת בוויסות הקוגניציה והשינה.

a-high-performance-liquid-chromatography-measurement-kynurenine

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

סרטון זה מדגים פרוטוקול להשתלת הרכבת אלקטרודות אלקטרואנצפלוגרם (EEG) ואלקטרומיוגרמה (EMG) בעכבר מורדם. התהליך כולל אבטחת העכבר על מסגרת סטריאוטקסית, ביצוע חתך קו אמצע בגולגולת, קידוח חורים עבור האלקטרודות, וקיבוע יחידת האלקטרודה להקלטת אותות. לאחר ההתאוששות, התנהגות השינה-ערות של העכבר מנותחת באמצעות האותות המוקלטים.

ניתוח התנהגות שינה בעכברים באמצעות אלקטרואנצפלוגרם והקלטות אלקטרומיוגרמה

הרישום של אלקטרואנצפלוגרמה (EEG) ואלקטרומיוגרמה (EMG) בעכברים שמתנהגים בחופשיות הוא צעד קריטי למתאם התנהגות ופיזיולוגיה עם שינה וערות. הפרוטוקול הניסיוני המתואר כאן מספק מערכת מבוססת כבלים לרכישת הקלטות EEG ו-EMG בעכברים.

נוהל הקלטת פוליגרפים למדידת שינה בעכברים

ספיגת דופמין synaptosomal ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים ניתוח מייצגים ניסוי כלים לחקור דופמין הומאוסטזיס בעכברים על-ידי הערכת את הפונקציה של המשגר דופמין, רמות הדופמין ברקמת striatal, בהתאמה. כאן אנו מציגים פרוטוקולים למדוד דופמין רקמות תוכן, להעריך את הפונקציונליות של המשגר דופמין.

הערכה של דופאמין הומאוסטזיס בעכברים באמצעות ניתוח ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית, דופמין Synaptosomal ספיגת

נציג של מיצוי מוצק-פאזי נוח מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) עם זיהוי אלקטרוכימי (ECD) נחישות סימולטני של נוירוטרנסמיטרים מונואמין שלוש ושתיים של מטבוליטים שלהם בשתן תינוקות. אנחנו גם לזהות את המטבוליט MHPG כמו סמן פוטנציאלי לאבחון מוקדם של נזק מוחי תינוקות.

שיטה נוחה עבור חילוץ וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה של נוירוטרנסמיטורים קטכולאמין מטבוליטים שלהם

אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה של מדידת שינה באמצעות פיקוח הביתה כלוב מבוסס-פעילות. שיטה זו מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות מבוססות-EEG. זה טוב מאומת מצפני משך השינה הכולל והוא יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לפקח על שינה במודלים מכרסם של מחלות אנושיות.

נחישותם לא פולשנית, תפוקה גבוהה של משך השינה בחולדות

כאן, אנו מתארים שיטה ויוו microdialysis לניתוח שחרור אספרטט ולא גלוטמט בהיפוקמפוס הגחון של חולדות אפילפסיה ואפילפטי, בשילוב עם הקלטות EEG. חוץ-תאית ריכוזי אספרטט גלוטמט יכול להיות בקורלציה עם השלבים השונים של המחלה.

Microdialysis של חומצות אמינו מעוררות במהלך ההקלטות EEG בחופשיות העברת חולדות

אובדן שינה ומעגלי מעגליות תורמים לתאונות מבצעיות ולאירועים מרובים. האפקטיביות של אמצעי מנגד ועיצובי תזמון עבודה מכוון לעייפות מקלים יכול להיות מאתגר להעריך בסביבות מבצעיות. כתב יד זה מסכם את הגישה לאיסוף שינה, מעגליות, עייפות ומידע ביצועים בסביבות מבצעיות מורכבות.

איסוף שינה, מעגליות, עייפות ונתוני ביצועים בסביבות תפעוליות מורכבות

כאן, אנו מציגים שיטה לחקור מקצבים יומי בביצועים בעקבות סיווג מדויק של המשתתפים לתוך הקבוצות מעגליות פניטיפ מבוסס על שאלון ChronoType מינכן, מעגלי הזהב בשלב ביולוגי הפאזה ואמצעים האקטגרפיים.

בדיקות ביצועים של מעגלי האדם בעולם האמיתי

המתואר כאן הוא פרוטוקול לקביעת ארבעה מטבוליטים שונים טריפטופן שנוצר במסלול קינורנין (קינורנין, 3-hydroxykynurenine, חומצה xanthurenic, 3-hydroxyanthranilic חומצה) במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם ספקטרומטריית מסה מרובעת אחת.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

חקור את השפעת האתגר החד של קינורנין על מטבוליטים במוח ובפלזמה אצל חולדות. שיטה זו משלבת ניתוח ביוכימי והתנהגותי להבנת מסלול קינורנין בנוירומדע.

יחידת מידה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים Kynurenine וחומצה Kynurenic: ביוכימיה הנוגעים קוגניציה ולישון אצל חולדות

גלה סרטונים נוספים